番茄SlJAZ11的表達(dá)分析及互作蛋白的篩選與驗(yàn)證

高苗苗 郭鑫 朱壽松 黃思源 李建君 龐春娜 陳銀華 ， 于曉惠 ，

（1海南大學(xué)，海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228；2海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海南 海口 570228；3中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？?571101）

茉莉酸（jasmonate acid，JA）參與植物信號(hào)傳遞，影響種子萌發(fā)、根系生長、向重力性、毛狀體形成、胚胎發(fā)育、幼苗發(fā)育、塊莖形成、葉片運(yùn)動(dòng)、果實(shí)成熟和葉片衰老等，還影響酚類化合物的積累［1］。此外，茉莉酸能與其他植物激素共同調(diào)節(jié)植物的生理過程，包括水楊酸（salicylic acid，SA）、赤霉素（gibberellin，GA）等［2］。茉莉酸除可調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育外，還可改善和提高植物對(duì)脅迫環(huán)境的耐受性［3-4］。SA和JA信號(hào)之間的相互作用可以進(jìn)一步調(diào)控植物防御反應(yīng)，形成針對(duì)多種病原體的強(qiáng)大植物免疫系統(tǒng)［5］。

在茉莉酸途徑中有3個(gè)重要的組分，分別是受體、抑制子和下游的轉(zhuǎn)錄因子。含ZIM 結(jié)構(gòu)域的茉莉酸（jasmonate ZIM-domain，JAZ）是JA途徑的抑制子，是下游轉(zhuǎn)錄因子MYC2的抑制劑和SCFCOI1（Skp1-Cul1-F-box proteinCORONATINEINSENSITIVE1）復(fù)合體的靶點(diǎn)［6］。JAZs是僅存在于植物中的TIFY超家族中的一個(gè)亞家族［7］，含有3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別為ZIM（Zinc-inflorescence meristem）、NT和JAS結(jié)構(gòu)域［8-10］。已有研究表明，JAZ在番茄中有26個(gè)家族成員，擬南芥有13個(gè)、水稻有15個(gè)［11］、玉米有23個(gè)［12］。JAZ主要通過與下游不同的轉(zhuǎn)錄因子互作來實(shí)現(xiàn)不同的生理作用。當(dāng)植物體內(nèi)茉莉酸含量較低時(shí)，JAZ蛋白和其他共抑制子如轉(zhuǎn)錄共抑制因子（groucho∕tup1-type co-repressor，TPL）結(jié)合為組成型蛋白，與轉(zhuǎn)錄因子MYC2結(jié)合從而抑制早期茉莉酸應(yīng)答基因的表達(dá)［13-15］。當(dāng)植物受到外界脅迫時(shí)，體內(nèi)茉莉酸含量上升，在JAR1酶的催化下與異亮氨酸（Ile）形成復(fù)合物茉莉酸-異亮氨酸（3R，7S-jasmonoic acid-isoleucine，JA-Ile），其 與 茉 莉 酸 的 受 體COI1（CORONATINE INSENSITIVE 1）結(jié)合后在復(fù)合物SCFCOI1作用下使JAZ蛋白泛素化，釋放出MYC2，從而開始早期茉莉酸應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄過程。

番茄（Solanum lycopersicum）是我國重要的栽培蔬菜之一。隨著番茄種植產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展與擴(kuò)大，番茄種植過程中出現(xiàn)的問題越來越突出，特別是各種傳染性病害已成為制約番茄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要原因之一。據(jù)調(diào)查，在我國危害番茄的病害約有40多種，如煙草花葉病毒、青枯病、細(xì)菌性斑點(diǎn)病、白粉病等［16］。細(xì)菌性斑點(diǎn)病也稱葉斑病，主要危害葉片，該病的致病病原菌為丁香假單胞菌番茄致病變種（Pseudomonas syringaepv.tomatoDC3000，PstDC3000）。PstDC3000常被用于研究病原菌與植物的互作［17］，為揭示番茄和細(xì)菌之間的相互作用原理提供了便利。

在番茄中，目前已知有26個(gè)JAZ成員［11］，其中SlJAZ11的功能研究相對(duì)較少，僅在衰老、非生物脅迫方面有相關(guān)報(bào)道［18］?，F(xiàn)有研究表明，SIJAZs在不同程度上參與對(duì)PstDC3000侵染的早期響應(yīng)，其中SlJAZ9∕10∕11在誘導(dǎo)后1 h表達(dá)量有顯著性上調(diào)［19］，說明SlJAZ11受到病原菌的強(qiáng)烈誘導(dǎo)。進(jìn)一步探究SlJAZ11響應(yīng)抗病相關(guān)激素以及病原菌脅迫的調(diào)控機(jī)制，對(duì)培育番茄抗病品種具有十分重要的意義。鑒于此，本研究以SlJAZ11為對(duì)象，探索其在抗病相關(guān)激素和PstDC3000誘導(dǎo)下的表達(dá)特征，并對(duì)SlJAZ11的互作蛋白進(jìn)行篩選及驗(yàn)證，以期為闡明SlJAZ11的功能與作用機(jī)制奠定良好的分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 本研究所用的野生型番茄品種AC（Solanum lycopersicMill.cv Ailsa Craig，AC）由海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，種植于溫室中，光照∕黑暗條件為16 h∕8 h，26 ℃。煙草為本氏煙由海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，空氣濕度70%，光照∕黑暗條件為14 h∕10 h，25 ℃。

1.1.2 菌株與載體 丁香假單胞菌番茄致病變種PstDC3000、酵母菌株AH109（NRR00030，Clontech，上海）、Y2H（MF2351，Clontech，上海）、大腸桿菌DH5α（DL1001S，唯地生物，上海），農(nóng)桿菌GV3101（pSoupp19）（AC1001S，唯地生物，上海）。

酵母雙 雜 交質(zhì)粒pGADT7、pGBKT7、pGADT7-largeT、pGBKT7-p53、pGBKT7-laminC、pNC-BiFCENC、pNC-BiFC-ECC［20］和pCAMBIA1300-35S-GFP均由海南大學(xué)熱帶生物資源可持續(xù)利用生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 試劑與藥品 主要藥品與試劑：多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN，北京），TRIzol試劑、限制性內(nèi)切酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher，美國），T4 DNA連接酶（EL0011，Invitrogen，上海），質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、2×A9 PCR MasteMix（艾德萊，北京），同源重組試劑盒（新賽美，蘇州），引物由北京擎科生物科技有限公司合成（表1）。100 mg·L-1氨芐青霉素、100 mg·L-1慶大霉素、50 mg·L-1卡那抗生素、25 mg·L-1利福平均由學(xué)校平臺(tái)萊博科技購入并保存。

所用溶液及培養(yǎng)基：酵母選擇營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基（minimal synthetical defined medium，SD）∕-Trp篩選培養(yǎng)基；SD∕-Leu∕-Trp固體和液體篩選培養(yǎng)基；SD∕-Trp+X-α-Gal（5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-α-D-galactopyranoside）（20 mg·L-1）+金擔(dān)子素（aureobasidin A， AbA）固體篩選培養(yǎng)基；SD∕-Trp+X-α-Gal（20 mg·L-1）固體篩選培養(yǎng)基；硅酸鹽細(xì)菌液體培養(yǎng)基（yeast peptone dextrose adenine medium，YPDA）液體和固體培養(yǎng)基；SD∕-Trp-Leu-His-Ade固體培養(yǎng)基；2×YPDA培養(yǎng)液；0.5×YPDA培養(yǎng)液；LB液體培養(yǎng)基；X-α-Gal（北京泛基諾科技公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 SlJAZ11蛋白生物信息學(xué)分析 運(yùn)用PSIPRED（http：∕∕bioinf.cs.ucl.ac.uk∕psipred）網(wǎng)站分析SlJAZ11蛋 白 的 二 級(jí) 結(jié) 構(gòu)；通 過SWISS-MODEL（https：∕∕swissmodel.expasy.org∕interactive）網(wǎng)站預(yù)測(cè)其蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)；應(yīng)用NetPhos 3.1 Server 和 NetNGlyc 1.0 Server分別預(yù)測(cè)蛋白的磷酸化和糖基化位點(diǎn)；利用SignalP3.0 Server（http：∕∕www.cbs.dtu.dk∕services∕Signal P）在線工具預(yù)測(cè)信號(hào)肽；利用HMM方法（http：∕∕www.cbs.dtu.dk∕services∕TMHMM∕）對(duì)SlJAZ11的蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.2 SlJAZ11的亞細(xì)胞定位 構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA-35s-SlJAZ11-GFP，與空載pCAMBIA1300-35S-GFP分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101中。挑選生長周期為30 d左右的煙草，將菌液（OD600值0.8）注射于適齡煙草葉片背面［21］，注射過的植株于21 ℃左右培養(yǎng)48 h，在TCS SP8激光共聚焦顯微鏡（Lecia，德國）下觀察注射過的區(qū)域有無熒光。

1.2.3 植物材料處理 選取生長期約為30 d且生長狀態(tài)一致的約野生型番茄植株幼苗，采用2 mmol·L-1SA、100 μmol·L-1茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）以及OD600值0.2的PstDC3000噴施法處理番茄葉片背部，分別摘取0、0.25、0.5、1、2、4、6、12、24、48和72 h的番茄葉片，放置在-80 ℃條件下備用。

1.2.4 RNA的提取 經(jīng)過處理后取下的番茄葉片經(jīng)液氮速凍后用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取其RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。每個(gè)樣品、每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR） qRT-PCR程序按SYBR Premix Ex Taq TM（TaKaRa，北京）說明操作。Sltublin（Solyc10g086760）作為內(nèi)參基因，通過2???CT法［22］計(jì)算，結(jié)果利用GraphPad 6.02［23］軟件繪圖。

1.2.6 酵母雙雜交載體構(gòu)建 根據(jù)基因編碼區(qū)（coding sequence，CDS）序列設(shè)計(jì)引物（表1），以野生型番茄AC的cDNA為模板，用高保真酶A9進(jìn)行目的基因CDS序列的擴(kuò)增。根據(jù)所選酶切位點(diǎn)，使用NEB公司限制性核酸內(nèi)切酶，37 ℃、6 h條件下對(duì)載體和片段分別進(jìn)行雙酶切。純化回收載體和目的片段，用T4連接酶連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。37 ℃過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，陽性克隆送廣州華大基因公司測(cè)序，獲得目標(biāo)載體。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.7 自激活檢測(cè) 將pGBKT7-SlJAZ11、pGBKT7-SlENT質(zhì)粒分別與pGADT7共轉(zhuǎn)入酵母Y2H或AH109菌株，并涂布于SD∕-Trp∕-Leu缺陷培養(yǎng)基平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d；挑取SD∕-Trp∕-Leu平板上生長較好的酵母單菌落，28 ℃、240 r·min-1條件下過夜培養(yǎng)。陽性對(duì)照為pGBKT7-53+pGADT7-T，陰性對(duì)照為pGBKT7-Lam+pGADT7-T。分別將菌液稀釋10×、100×、1 000×，滴在SD∕-Trp∕-Leu+X-a-Gal、SD∕-Trp、SD∕-Trp+X-a-Gal、SD∕-Trp+X-a-Gal+AbA或SD∕-Trp∕ -Leu、SD∕-Trp∕-Leu∕-His∕-Ade和SD∕-Trp∕-Leu∕-His∕ -Ade+X-a-Gal固體篩選培養(yǎng)基上，28 ℃條件下培養(yǎng)2～3 d，觀察其是否有自激活。

1.2.8 cDNA文庫篩選互作蛋白 用4～5 mL含有pGBKT7-SlJAZ11誘餌載體的酵母菌液和1 mL AD文庫菌液混合，低轉(zhuǎn)速培養(yǎng)出現(xiàn)三葉草形狀結(jié)合子后，均勻涂于SD∕-Trp∕-Leu∕-His+ABA的缺陷型平板上，30 ℃培養(yǎng)7 d，將SD∕-Trp∕-Leu∕-His+AbA板上長勢(shì)較好的單菌落 轉(zhuǎn) 移 到篩 選 度 更強(qiáng) 的SD∕-Trp∕-Leu∕-His∕-Ade∕ +X-a-Gal平板上進(jìn)一步篩選，隨后將藍(lán)色單克隆進(jìn)行進(jìn)一步的測(cè)序分析和點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證。挑取陽性酵母單菌落為模板，pGADT7通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物送廣州華大基因公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在Phytozome（https：∕∕phytozome-next.jgi.doe.gov∕）進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，進(jìn)一步明確這些基因的功能。

1.2.9 酵母雙雜交驗(yàn)證 將候選蛋白構(gòu)建至誘餌載體pGBKT7，按照上述方式驗(yàn)證其是否具有自激活活性，將pGBKT7-SlENT和pGBKT7-SlOOLG分 別 與pGADT7-SlJAZ11共轉(zhuǎn)至酵母菌株AH109，涂布在SD∕-Trp∕-Leu平板上，30 ℃培養(yǎng)4 d后觀察其生長情況。挑取平板上生長較好的酵母單菌落，28 ℃、240 r·min-1條件下過夜培養(yǎng)。陽性對(duì)照為pGBKT7-53+pGADT7-T，陰性對(duì)照為pGBKT7-Lam+pGADT7-T。分別將菌液稀釋10×、100×、1 000×，滴在SD∕-Trp∕-Leu、SD∕-Trp∕ -Leu∕-His∕-Ade、SD∕-Trp∕-Leu∕-His∕-Ade+X-a-Gal固體培養(yǎng)基上，驗(yàn)證互作關(guān)系。

1.2.10 雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證互作關(guān)系 采用你行（Nimble Cloning，NC）［22］克隆方法構(gòu)建雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)（bimolecular fluorescence complementation experiment，BiFC）載體（pNC-BiFC-ENC-SlJAZ11、pNCBiFC-ECC-SlENT），設(shè)計(jì)引物時(shí)采用Nimble Cloning通用引物設(shè)計(jì)原則，目標(biāo)基因兩端加上通用接頭（上游接頭5′-agtggtctctgtccagtcct-3′，5′-ggtctcagcagaccacaagt-3′）。使用高保真酶A9進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，將獲得的PCR產(chǎn)物按照同源重組試劑盒說明書要求進(jìn)行連接（50 ℃、30 min），取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。37 ℃過夜培養(yǎng)后挑選單克隆進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，陽性克隆送廣州華大基因公司測(cè)序驗(yàn)證。將含有目的基因的載體與空載分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101（pSoup-p19）中，挑取陽性單克隆至含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中28 ℃、200 r·min-1條件下?lián)u菌至OD600為0.8，用侵染液［MgCl2+嗎啉乙磺酸（MES monohydrate，MES）+乙酰丁香酮（acetosyringone，As）］清洗并懸浮農(nóng)桿菌菌體。等體積混合兩種含有不同質(zhì)粒的菌液，室溫靜置2 h，將菌液注射于適齡（30 d）煙草葉片背面，注射過的植株于21 ℃左右培養(yǎng)48 h，在confocal顯微鏡下檢測(cè)熒光信號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SlJAZ11蛋白理化性質(zhì)分析

利用PSIPRED和SWISS-MODEL在線網(wǎng)站分別對(duì)蛋白二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，SlJAZ11有5處螺旋結(jié)構(gòu)，其中23.62% α-螺旋（Helix）、3.15% β-折疊（Sheet）、58.27%無規(guī)則卷曲（Coil）（圖1-A、B）；利用TMHMM在線軟件預(yù)測(cè)SlJAZ11蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明SlJAZ11蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，是非分泌蛋白（圖1-C）；Signal IP網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白沒有信號(hào)肽，不具備信號(hào)識(shí)別功能（圖1-D）；利用NetPhos在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)SlJAZ11蛋白有14個(gè)磷酸化位點(diǎn)（絲氨酸13個(gè)、蘇氨酸0個(gè)、酪氨酸1個(gè)）（圖1-E）；有3個(gè)糖基化位點(diǎn)（圖1-F）。

圖1 SlJAZ11蛋白的生物信息學(xué)分析Fig.1 Bioinformatics analysis of SlJAZ11 protein

2.2 SlJAZ11的亞細(xì)胞定位

將重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-35S-SlJAZ11-GFP和空載質(zhì)粒pCAMBIA1300-35S-GFP分別注射于煙草葉片背部，培養(yǎng)48 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光信號(hào)（圖2）。紅色熒光為細(xì)胞核定位熒光標(biāo)記，綠色熒光為SlJAZ11-GFP融合蛋白發(fā)出的熒光。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入空載質(zhì)粒的對(duì)照組煙草表皮細(xì)胞中均分布較強(qiáng)的綠色熒光信號(hào)；而融合蛋白的熒光信號(hào)分布于細(xì)胞核和細(xì)胞膜中，并且紅色熒光與綠色熒光基本重合，呈現(xiàn)出黃色和綠色的光，由此可知SlJAZ11蛋白定位于細(xì)胞核和細(xì)胞膜。

圖2 SlJAZ11亞細(xì)胞定位分析Fig.2 SlJAZ11 subcellular localization analysis

2.3 JA、SA和DC3000誘導(dǎo)下的SlJAZ11表達(dá)量分析

茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）、丁香假單胞菌（PstDC3000）等激素和病原菌、環(huán)境在植物應(yīng)對(duì)各種脅迫過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。利用MeJA、SA、PstDC3000處理番茄葉片，通過qRT-PCR技術(shù)分析SlJAZ11基因的表達(dá)水平變化，結(jié)果如圖3所示。在MeJA、SA、PstDC3000處理下，0.5 h后SlJAZ11基因的表達(dá)量均有顯著上調(diào)，為0 h表達(dá)量的200倍左右。在PstDC3000侵染的不同時(shí)間點(diǎn)的葉片中，SlJAZ11基因的轉(zhuǎn)錄水平呈先上升后下降再上升的變化趨勢(shì)。MeJA和SA誘導(dǎo)后SlJAZ11基因的表達(dá)趨勢(shì)基本一致，SA處理后6 h后表達(dá)量有明顯的上調(diào)，約為0 h表達(dá)量的400倍。初步說明SlJAZ11能響應(yīng)MeJA、SA和PstDC3000誘導(dǎo)的途徑，能夠被抗病相關(guān)激素（MeJA、SA）、病原菌（PstDC3000）所誘導(dǎo)。

圖3 JA、SA和DC3000誘導(dǎo)下SlJAZ11表達(dá)分析Fig.3 Expression analysis of SlJAZ11 induced by JA， SA and DC3000

2.4 SlJAZ11酵母雙雜交載體構(gòu)建

本研究采用酵母雙雜交技術(shù)篩選與SlJAZ11互作的蛋白。以野生型番茄AC的cDNA為模板，根據(jù)番茄SlJAZ11基因編碼區(qū)引物擴(kuò)增得到一條384 bp的目的片段，隨后進(jìn)行酶切、連接和菌落PCR。由圖4可知，電泳特異性強(qiáng)，與預(yù)期結(jié)果一致。菌落PCR檢測(cè)的陽性克隆送廣州華大基因公司測(cè)序，獲得載體pGBKT7-SlJAZ11和pGADT7-SlJAZ11。

圖4 SlJAZ11酵母雙雜交載體構(gòu)建Fig.4 SlJAZ11 yeast two-hybrid vector construction

2.5 SlJAZ11自激活檢測(cè)

將測(cè)序成功的載體pGBKT7-SlJAZ11與pGADT7空載共轉(zhuǎn)入酵母菌株Y2H中，然后涂布于SD∕-Trp∕ -Leu平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d后挑取單克隆搖菌點(diǎn)板，結(jié)果如圖5所示。陽性對(duì)照（pGBKT7-53+pGADT7-T），陰性對(duì)照（pGBKT7-Lam+pGADT7-T）在SD∕-Trp∕ -Leu+X-a-Gal平板上均存在克?。栃詫?duì)照為藍(lán)色克隆，陰性對(duì)照為白色克隆），BD-空載（pGBKT7）和pGBKT7-SlJAZ11在SD∕-Trp，SD∕-Trp+X-a-Gal，SD∕ -Trp+X-a-Gal+AbA存在克隆，且克隆顏色為白色。說明SlJAZ11不存在自激活現(xiàn)象，可進(jìn)行后續(xù)篩選試驗(yàn)。

圖5 SlJAZ11自激活檢測(cè)Fig.5 SlJAZ11 self-activation detection

2.6 cDNA文庫篩選互作蛋白

利用番茄cDNA文庫篩選與SlJAZ11互作的蛋白，通過計(jì)算1 000×DDO平板的單克隆數(shù)得出AD文庫轉(zhuǎn)化效 率>2×107cell·mL，共有100個(gè) 單菌 落可 在SD∕ -Trp∕-Leu∕-His+AbA上長出，將長勢(shì)較好的單菌落轉(zhuǎn)移到篩選度更強(qiáng)的SD∕-Trp∕-Leu∕-His∕-Ade+X-a-Gal平板上，共有40個(gè)單菌落變藍(lán)。測(cè)序結(jié)果共得到14個(gè)可能與SlJAZ11相互作用的蛋白（表2），其中包括與溫度相關(guān)的熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）［1］，與活性氧產(chǎn)生相關(guān)的胚芽素樣蛋白亞家族3成員（oxalate oxidase-like germin 171，OOLG），調(diào)控HSP40的分子伴侶蛋白（chaperone protein dnaJ，CPD）［24］，與植物免疫相關(guān)的含有EMSY-N終端結(jié)構(gòu)域的蛋白（EMSY N TERMINUS，ENT）［25］等，涉及多種生化過程。說明SlJAZ11可能參與調(diào)控多個(gè)復(fù)雜的通路。選擇SlOOLG和SlENT來探究SlJAZ11在抗病過程中可能的調(diào)控通路，構(gòu)建酵母雙雜交載體，并對(duì)其與SlJAZ11的互作關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步研究。

表2 酵母雙雜交文庫篩選出與SlJAZ11互作的蛋白Table 2 Yeast two-hybrid cDNA library screening for possible interactiong proteins of SlJAZ11

2.7 酵母雙雜交點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證

分別將SlENT和SlOOLG進(jìn)行自激活和點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證來進(jìn)一步確認(rèn)SlJAZ11與SlENT和SlOOLG之間的互作關(guān)系。

2.7.1 自激活檢測(cè) 將測(cè)序成功的載體pGBKT7-SlENT和pGBKT7-SlOOLG與pGADT7空載共轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109中，檢測(cè)SlENT和SlOOLG是否具有自激活活性，結(jié)果如圖6所示。陽性對(duì)照（pGBKT7-53+pGADT7-T）和陰性對(duì)照（pGBKT7-Lam+pGADT7-T）在SD∕-Trp∕-Leu平 板 上 均 有 白 色 克 隆，在SD∕-Trp∕ -Leu∕-His∕-Ade，SD∕-Trp∕-Leu∕-His∕-Ade∕+X-a-Gal固體培養(yǎng)基只有陽性對(duì)照存在克隆且變藍(lán)，而試驗(yàn)組（pGBKT7-SlENT和pGBKT7-SlOOLG）只 有 在SD∕ -Trp∕-Leu上有 克 隆，SD∕-Trp∕-Leu∕-His∕-Ade，SD∕-Trp∕ -Leu∕-His∕-Ade∕+X-a-Gal未存在克隆，說明SlENT和SlOOLG不具有自激活活性，可以進(jìn)行后續(xù)的酵母雙雜交試驗(yàn)。

圖6 SlENT和SlOOLG自激活檢測(cè)Fig.6 SlENT and SlOOLG self-activation assay

2.7.2 SlENT與SlJAZ11點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證 利用酵母雙雜交技術(shù)對(duì)候選蛋白與SlJAZ11進(jìn)行互作驗(yàn)證，結(jié)果如圖所示（圖7）。陽性對(duì)照（pGBKT7-53+pGADT7-T）和陰性對(duì)照（pGBKT7-Lam+pGADT7-T）在SD∕-Trp∕-Leu上均有白色克隆，且在SD∕-Trp∕-Leu∕-His∕-Ade，SD∕ -Trp∕-Leu∕-His∕-Ade∕+X-a-Gal固體培養(yǎng)基上只有陽性對(duì)照存在克隆且變藍(lán)。而試驗(yàn)組（AD-SlJAZ11∕ BD-SlOOLG和AD-SlOOLG∕BD-SlJAZ11）只 有 在SD∕-Trp∕ -Leu上有白色克隆，在SD∕-Trp∕-Leu∕-His∕-Ade，SD∕-Trp∕-Leu∕-His∕-Ade∕+X-a-Gal固體培養(yǎng)基上與陰性對(duì)照一致。試驗(yàn)組（AD-SlJAZ11∕BD-SlENT）在SD∕-Trp∕-Leu，SD∕-Trp∕-Leu∕-His∕-Ade，SD∕-Trp∕-Leu∕-His∕-Ade∕+X-a-Gal上均存在克隆且在SD∕-Trp∕-Leu∕-His∕ -Ade∕+X-a-Gal固體培養(yǎng)基上變藍(lán)。試驗(yàn)結(jié)果初步說明SlENT與SlJAZ11存在互作關(guān)系。

圖7 SlJAZ11與SlENT或SlOOLG點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證互作Fig.7 Identification of the interaction between SlJAZ11 and SlENT or SlOOLG by point-to-point assay

2.8 SlENT與SlJAZ11雙分子熒光互補(bǔ)（bimolecular fluorescene complementation, BIFC）驗(yàn)證

酵母雙雜交存在一定的假陽性可能，因此進(jìn)一步通過BIFC驗(yàn)證SlENT與SlJAZ11的互作關(guān)系，利用Nimble Cloning構(gòu) 建BIFC載 體pNC-ENC-SlJAZ11和pNC-ECC-SlENT，分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101（pSoupp19），將含有兩個(gè)載體的菌液1∶1混勻后，注射到適齡的煙草中，48 h后顯微觀察（圖8）。由結(jié)果可知，陰性對(duì)照（cEYFP+nEYFP∕SlJAZ11-nEYFP+cEYFP）沒有檢測(cè)到熒光信號(hào)，試驗(yàn)組（SlJAZ11-nEYFP+SlENT-cEYFP）可以看到黃色熒光信號(hào)，并且熒光信號(hào)存在于細(xì)胞核中，證明SlJAZ11和SlENT存在互作關(guān)系。

圖8 BiFC驗(yàn)證SlJAZ11和 SlENT互作關(guān)系Fig.8 BiFC assays for identifying the interaction between SlJAZ11 and SlENT

2.9 SlENT蛋白的生物信息學(xué)分析

利用PSIPRED和SWISS-MODEL在線網(wǎng)站分別對(duì)蛋白二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，三級(jí)結(jié)構(gòu)以1utu.1.B為 原 型SlENT有17處 螺 旋 結(jié) 構(gòu)，其 中26.85% α-螺旋（Helix）、4.63% β-折疊（Sheet）、65.65%無規(guī)則卷曲（Coil）（圖9-A、B）；利用TMHMM在線軟件預(yù)測(cè)SlENT蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明SlENT蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，是非分泌蛋白（圖9-C）；Signal IP 網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白沒有信號(hào)肽，不具備信號(hào)識(shí)別功能（圖9-D）；利用NetPhos在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)SlENT蛋白有37個(gè)磷酸化位點(diǎn)（絲氨酸28個(gè)、蘇氨酸7個(gè)、酪氨酸2個(gè)）（圖9-E）；有1個(gè)糖基化位點(diǎn)（圖9-F）。

圖9 SlENT蛋白的生物信息學(xué)分析Fig.9 Bioinformatics analysis of SlENT protein

2.1 0 JA、SA和DC3000誘導(dǎo)下SlENT表達(dá)分析

前人研究表明，ENT參與了植物的免疫［25］，本試驗(yàn)對(duì)其在PstDC3000、MeJA、SA處理下的表達(dá)情況進(jìn)行分析，初步探究SlENT的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)除2 h，SlENT被PstDC3000顯著誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)，且在0.25 h和4 h下調(diào)最為明顯；SlENT被JA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，且在6 h時(shí)上調(diào)最為顯著；而在SA處理后，SlENT的表達(dá)變化不明顯，僅在1 h時(shí)顯著下調(diào)表達(dá)。初步證明SlENT基因響應(yīng)MeJA的誘導(dǎo)，能被SA和PstDC3000顯著抑制（圖10）。

圖10 JA、SA和DC3000誘導(dǎo)下SlENT表達(dá)量分析Fig.10 Expression analysis of SlENT under biotic and abiotic stresses

3 討論

JAZ屬于茉莉酸信號(hào)途徑的抑制子，因其ZIM結(jié)構(gòu)域中的保守序列TIFYXG而被命名［26］。茉莉酸ZIM結(jié)構(gòu)域（JAZ）抑制子通過負(fù)調(diào)節(jié)茉莉酸鹽的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)植物發(fā)育和免疫力。在植物的生長發(fā)育過程中，JAZ主要通過與不同的轉(zhuǎn)錄因子互作來實(shí)現(xiàn)不同的生理作用，JAZ1和JAZ4可以與ICE1互作，可以調(diào)控植物的抗寒性［27］。研究表明，JAZ和DELLA的互作可以解除對(duì)MYC2和PIF5的抑制，從而激活下游基因的表達(dá)，促進(jìn)植物下胚軸的生長，同時(shí)還能增強(qiáng)根對(duì)茉莉酸的耐受性，提高植物的抗性［21］。還有研究表明，擬南芥中存在1個(gè)ENT基因家族AtEML（AtEML1、AtEML2、AtEML3和AtEML4）。AtEML1和AtEML2和AtEML4有 助 于RPP7介 導(dǎo) 的 植 物 免 疫［25］。目 前SlJAZ11在衰老和非生物脅迫中的研究較多［18］，但目前鮮有關(guān)于SlJAZ11抗病的報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，SlJAZ11和SlENT存在互作關(guān)系，通過蛋白序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，SlENT與AtENT兩者同源性較高，推測(cè)SlJAZ11可能通過與SlENT互作來調(diào)節(jié)植物免疫。

JA和SA是植物防御和發(fā)育所必需的激素［28］，PstDC3000攜帶大量潛在毒力因子，其結(jié)構(gòu)類似于植物激素茉莉酸［29］。Du等［30］和Pauwels等［31］研究發(fā)現(xiàn)外源噴施JA后能夠促進(jìn)JAZ1、JAZ2、JAZ3、JAZ5、JAZ6基因的表達(dá)，認(rèn)為JA激素能夠誘導(dǎo)JAZs基因的表達(dá)。Ryan等［32］根據(jù)JA反應(yīng)的表達(dá)時(shí)間，將相關(guān)的防御基因分為“早期”基因和“晚期”基因。本試驗(yàn)結(jié)果表明，MeJA噴施后SlJAZ11和SlENT表達(dá)水平在早期呈顯著上調(diào)趨勢(shì)，與上述前人研究結(jié)果一致，說明SlJAZ11和SlENT基因響應(yīng)JA的早期調(diào)控。SlJAZ11和SlENT在MeJA的作用下表達(dá)水平均上調(diào)，因此猜測(cè)SlJAZ11和SlENT基因可能在JA信號(hào)調(diào)控的植物免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用。

本研究結(jié)果表明，SA噴施后SlJAZ11基因的表達(dá)量呈先上升后下降再上升的趨勢(shì)，從整體表達(dá)水平上看，SlJAZ11的表達(dá)量升高，表明該基因的表達(dá)受到SA的誘導(dǎo)；也發(fā)現(xiàn)在PstDC3000處理后，SlJAZ11表達(dá)水平呈顯著上調(diào)趨勢(shì)；在PstDC3000和SA處理后SlENT表達(dá)量被抑制。一般情況下，SA和JA信號(hào)通路出現(xiàn)相互拮抗的作用［33］，在本研究中SA、JA處理后SlJAZ11相對(duì)表達(dá)水平變化趨勢(shì)相反證實(shí)了SA與JA間的拮抗關(guān)系，SlENT驗(yàn)證了SA與JA間的拮抗關(guān)系。SlJAZ11對(duì)PstDC3000敏感，而SlENT對(duì)PstDC3000不敏感，說明SlJAZ11和SlENT影響Pst DC3000侵染的信號(hào)途徑有差異。目前尚不明確SlJAZ11能否與其互作蛋白SlENT共同調(diào)控植物的免疫性，后續(xù)工作可以利用免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)一步闡明SlJAZ11和SlENT之間的互作關(guān)系，以明確SlJAZ11和SlENT在植物免疫過程中的功能，為進(jìn)一步闡明SlJAZ11功能研究奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究通過煙草亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，SlJAZ11在細(xì)胞膜和細(xì)胞核中均有表達(dá)，說明SlJAZ11能在細(xì)胞膜和細(xì)胞核中發(fā)揮功能。對(duì)野生型番茄植株進(jìn)行抗病相關(guān)激素（MeJA、SA）和病原菌（Pst DC3000）處理后，發(fā)現(xiàn)SlJAZ11能響應(yīng)MeJA、SA和Pst DC3000的誘導(dǎo)，且其互作蛋白SlENT也能響應(yīng)MeJA的誘導(dǎo)。通過酵母雙雜交技術(shù)，篩選到14個(gè)可能與SlJAZ11互作的候選蛋白，點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證SlJAZ11與SlENT之間存在互作。進(jìn)一步通過雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)，證明SlJAZ11和SlENT存在互作關(guān)系。