陸地棉小GTP結(jié)合蛋白基因GhROP6的克隆及表達(dá)初步分析

胡子曜 雷建峰 程貫富 劉 超 代培紅 孫博洋 馬海洋 李 月，

（1新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院∕教育部棉花工程研究中心∕農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830052）

小G蛋白是一類與異源三聚體G蛋白的α亞基偶聯(lián)的單體鳥苷酸結(jié)合蛋白，其分子量在21～30 kDa之間，屬于Ras超家族，通過自身獨(dú)特的調(diào)節(jié)方式，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［1］。根據(jù)其結(jié)構(gòu)與功能的差異性可分為5個(gè)家族：Rho、Ras、Arf∕Sar、Ran及Rab，這5個(gè)家族在調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)中發(fā)揮著不同的功能［2］。植物特異的Rho GTP酶（Rho-related GTPase of plants，ROP）蛋白是植物所特有的一種Rho類小G蛋白，又稱植物Rac蛋白，通過與三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）結(jié)合（激活態(tài)）和與二磷酸鳥苷（guanosine diphosphate，GDP）結(jié)合（非激活態(tài)）過程中構(gòu)象的變化，以“分子開關(guān)”的形式參與細(xì)胞內(nèi)多項(xiàng)生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)［3］。在結(jié)構(gòu)上，ROP蛋白含有5個(gè)GTP∕GDP結(jié)合位點(diǎn)（G1～G5），其中G1～G3具有GTP酶活性，是GTP水解區(qū)域，同時(shí)也是磷酸化和Mg2+結(jié)合區(qū)域；G4和G5是由9～11個(gè)氨基酸組成的Rho結(jié)構(gòu)域，可能與下游信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)，是GTP結(jié)合區(qū)域；此外還含有1個(gè)Rho插入序列和1個(gè)C末端多變區(qū)［4］。Winge等［5］根據(jù)擬南芥ROP蛋白的同源性及C末端多變區(qū)的差異將其分為Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型包含AtROP1～AtROP8，Ⅱ型包含AtROP9～AtROP11。

1993年Yang等［6］從豌豆中克隆出第一個(gè)ROP基因，此后越來越多的ROP基因在植物中被發(fā)掘、鑒定，目前已在玉米（Zea mays）、番茄（Solanum lycopersicum）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、葡萄（Vitis vinifera）、水稻（Oryza sativa）、煙草（Nicotiana tabacum）、沉香（Aquilariae Lignum Resinatum）、辣椒（Capsicum annuum）、大麥（Hordeum vulgare）、大豆（Glycine max）等多種植物中克隆出ROP基因［7］。功能研究發(fā)現(xiàn)，ROP基因參與植物細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長和分裂、亞細(xì)胞定位、mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)翻譯及生長素（3-indoleacetic acid，IAA）和脫落酸（abscisic acid，ABA）激素應(yīng)答反應(yīng)等多種生命活動(dòng)的調(diào)控［7］；此外，ROP基因同樣參與植物對(duì)逆境脅迫的應(yīng)激反應(yīng)：馬鈴薯（Solanum tuberosum）ROP基因通過介導(dǎo)過氧化氫（H2O2）的積累正向調(diào)控對(duì)疫霉病菌的抗性［8］；小麥（Triticum aestivumL.）TaROP10蛋白通過與TaTrxh9蛋白互作，負(fù)調(diào)控小麥抗條銹病反應(yīng)［9］；干涉MtROP9基因表達(dá)可增強(qiáng)苜蓿（Medicago falcata）對(duì)根瘤菌的敏感性［10］；枇杷（Eriobotrya japonica）ROP基因的轉(zhuǎn)錄本受低溫誘導(dǎo)，可能參與耐寒反應(yīng)［11］；低溫同樣誘導(dǎo)蘋果（Malus pumila）ROP基因表達(dá)，導(dǎo)致其果實(shí)中活性氧（reactive oxygen species，ROS）和乙烯（ethylene，ET）含量顯著降低［12］；香蕉（Musa paradisiaca）MaROP5g基因的過表達(dá)通過上調(diào)耐鹽相關(guān)基因（SOS1、SOS2和SOS3）及鈣信號(hào)通路蛋白基因（CBL、CIPK和CDPK）的表達(dá)，增強(qiáng)了植株的耐鹽性［13］；擬南芥（Arabidopsis thaliana）AtROP11基因介導(dǎo)ABA調(diào)控氣孔開閉及干旱脅迫反應(yīng)［14］；茶樹（Camellia sinensis）ROP基因CsRAC1的超表達(dá)減弱了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)鹽脅迫及苗期對(duì)干旱脅迫的抗性，但增強(qiáng)了成株擬南芥的耐旱性，表明ROP基因?qū)χ参锏钟煌巧锩{迫反應(yīng)的調(diào)控方式存在一定的差異［15］。

棉花（Gossypiumhirsutum）是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，同時(shí)也是重要的農(nóng)產(chǎn)品和戰(zhàn)略物資，在國民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。但作為固著生物，棉花在生長過程中會(huì)遭受多種逆境脅迫，其中干旱、高鹽和極端溫度等非生物脅迫日漸成為影響棉花生長、制約棉花產(chǎn)量及纖維品質(zhì)的重要因素［16］。目前關(guān)于ROP基因在棉花抗逆反應(yīng)中的功能研究相對(duì)較少。因此，本研究利用同源克隆的方法獲得1個(gè)棉花ROP基因GhROP6，利用實(shí)時(shí)熒光定量（quantification real-time PCR，qRT-PCR）技術(shù)探究其在棉花不同組織及不同非生物逆境和外源激素處理下的表達(dá)模式，同時(shí)構(gòu)建該基因的病毒介導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）載體并獲得沉默植株，以期為進(jìn)一步探究該基因的生物學(xué)功能提供材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

陸地棉（Gossypium hirsutum）新陸早26的種子及農(nóng)桿菌菌株GV3101均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；VIGS載體TRV∶ RNA1、TRV∶RNA2、TRV∶GhCLA1均由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所黃全生教授饋贈(zèng)。

Trans-T1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、高保真DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、克隆載體pEASY Blunt-Zero、DNA Marker均購于北京全式金公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、RNase A及質(zhì)粒小提試劑盒均購于南京諾維贊公司；植物多糖多酚總RNA提取試劑盒購于杭州博日公司；qRT-PCR及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于加拿大愛必夢(mèng)公司；抗生素及脫落酸（ABA）、生長素（IAA）、2-嗎啉乙磺酸（2-morpholinoethanesulfonicacid，MES）、乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）等均購于北京索萊寶公司；XbaⅠ和KpnⅠ限制性內(nèi)切酶購于美國賽默飛公司；PCR所用引物的合成及DNA測序均由上海杰李公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 棉花種植及脅迫處理 選取顆粒飽滿、大小一致的新陸早26種子，經(jīng)濃硫酸脫絨后，參照Zhao等［17］的方法進(jìn)行種植、培育及脅迫處理。待其長至第二片真葉完全展開時(shí)，挑取生長狀態(tài)一致的棉苗，將其根部土壤用清水洗凈后，進(jìn)行干旱（15% PEG 6000）、高鹽（200 mmol·L-1NaCl）、低溫（4 ℃）及高溫（37 ℃）脅迫處理，干旱和高鹽的對(duì)照組均為水處理，高低溫的對(duì)照組均為室溫（25 ℃）處理；取處理前（0 h）及脅迫處理后和相應(yīng)對(duì)照組1、3、6、12和24 h等時(shí)間段的棉花真葉組織，用于不同脅迫處理下的表達(dá)模式分析；參照Ni等［18］和Yu等［19］的方法進(jìn)行外源激素（100 μmol·L-1的ABA和IAA）處理，對(duì)照組為加入微量無水乙醇的水溶液，分別于處理前（0 h）及處理后3、6、9和12 h對(duì)棉株真葉進(jìn)行取樣，用于不同激素處理下的表達(dá)模式分析；同時(shí)對(duì)未處理棉花幼苗的根部、莖部、真葉和子葉等組織進(jìn)行取樣，用于不同組織表達(dá)模式分析。上述取樣均取3組不同重復(fù)，每組取3株樣本，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2GhROP6基因的克隆 根據(jù)擬南芥AtROP1（AT2G17800）基因序列，在棉花基因組數(shù)據(jù)庫（http：∕∕www.phytozome.net）中進(jìn)行blast比對(duì)，獲得1個(gè)棉花ROP基因，將其命名為GhROP6，并在基因文庫（gene bank）中為其申請(qǐng)檢索號(hào)；根據(jù)該基因的CDS（coding sequence）序列設(shè)計(jì)相應(yīng)克隆引物（表2），以新陸早26的葉片cDNA為模板，參照胡子曜等［20］的方法，利用PCR技術(shù)進(jìn)行特異性擴(kuò)增，回收目的片段進(jìn)行克隆及測序。

1.2.3GhROP6基因生物信息學(xué)分析 在線生物信息學(xué)分析工具參見表1；利用DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，同時(shí)選取擬南芥AtROP1（NP_190698.1）、AtROP3（NP_179371.1）、AtROP6（NP_195228.1）、AtROP9（NP_194624.1）、AtROP10（NP_566897.1）和AtROP11（NP_201093.1），煙草NtROP9（CAA10815.2），水稻OsRac1（XP_015621645.1），玉米ZmROP1（XP_008644256.1），大 麥HvRac1（CAD57743.1），香 蕉MaROP1（ABQ15204.1），辣椒CaROP1（ABB71820.1）及枇杷EjROP1（ACM68949.1），利用MEGA7軟件采用鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，采用Bootstrap檢驗(yàn)各分支的可靠性。

表1 生物信息學(xué)分析工具Table 1 Bioinformatics analysis tools and corresponding functions

1.2.4GhROP6基因的表達(dá)模式分析 將1.2.1所取樣品用液氮研磨成白色粉末狀態(tài)，利用植物多糖多酚總RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA提??；使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成。以cDNA為模板，選取棉花多聚泛素酶基因GhUBQ7為內(nèi)參，參照胡子曜等［20］的反應(yīng)體系及程序進(jìn)行qRT-PCR，每個(gè)樣本均設(shè)3組技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)基因的Ct值，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算其表達(dá)量。相關(guān)引物見表2。

1.2.5GhROP6基因的VIGS載體構(gòu)建 根據(jù)GhROP6基因的CDS序列，利用在線軟件SGN-VIGS（https：∕∕vigs.solgenomics.net∕）設(shè)計(jì)特異性沉默靶序列，設(shè)計(jì)合適的特異性引物并在其上、下游5′端分別加入XbaⅠ和KpnⅠ的酶切位點(diǎn)（表2），以陸地棉新陸早26真葉的cDNA為模板，克隆目的片段，方法同1.2.3；將測序正確的重組質(zhì)粒及VIGS載體TRV2用XbaⅠ和KpnⅠ進(jìn)行酶切回收，T4連接酶連接4～5 h后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行雙酶切鑒定，取10～15 μL重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.6 VIGS侵染及沉默效率檢測 選取葉綠素合成相關(guān)基因GhCLA1作為陽性對(duì)照，檢驗(yàn)TRV-VIGS技術(shù)體系。將TRV∶RNA1、TRV∶RNA2、TRV∶GhCLA1和TRV∶GhROP6等載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后，參照Li等［21］的方法進(jìn)行菌液的活化、重懸及侵染棉花。待棉花幼苗生長至兩片子葉完全展開且真葉剛露尖時(shí)，利用注射法進(jìn)行侵染。將包含TRV∶GhROP6和TRV∶RNA1、TRV∶GhCLA1和TRV∶RNA1、TRV∶RNA2和TRV∶RNA1的重懸菌液所侵染的棉株分別作為試驗(yàn)組TRV∷GhROP6、陽性對(duì)照TRV∷GhCLA1和陰性對(duì)照TRV∷00。侵染大約16 d，當(dāng)陽性對(duì)照TRV∷GhCLA1出現(xiàn)葉綠素缺失的白化表型時(shí)，對(duì)TRV∷00、TRV∷GhCLA1和TRV∷GhROP6植株第二片真葉及根部進(jìn)行取樣并進(jìn)行RNA提取及cDNA合成，利用qRT-PCR技術(shù)檢測相關(guān)基因的沉默效率，體系、程序同1.2.4。每個(gè)樣本均取3個(gè)技術(shù)重復(fù)。相關(guān)引物見表2。

表2 引物及用途Table 2 Primer and application

2 結(jié)果與分析

2.1 GhROP6基因的克隆及生物信息學(xué)分析

利用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，得到產(chǎn)物大小為597 bp，符合預(yù)期（圖1-A），測序結(jié)果與目標(biāo)序列完全相符，表明已成功克隆出GhROP6基因的CDS序列；在基因文庫為其申請(qǐng)檢索號(hào)：MK955932。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，GhROP6基因的開放閱讀框（open reading frame，ORF）為597 bp，編碼198個(gè)氨基酸，分子式為C988H1575N263O284S6，相對(duì)分子質(zhì)量為21.87 kDa。理化性質(zhì)分析顯示（表3），GhROP6蛋白均定位于細(xì)胞膜，無信號(hào)肽，屬于堿性、親水性、非跨膜蛋白；蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示該蛋白含有一個(gè)RHO結(jié)構(gòu)域（圖1-B）。磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果顯示，該蛋白分別含有14個(gè)絲氨酸（Ser）、12個(gè)蘇氨酸（Thr）和7個(gè)酪氨酸（Tyr）的磷酸化位點(diǎn)（圖2）。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示該蛋白含有5個(gè)α螺旋和8個(gè)β折疊，三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果完全符合二級(jí)結(jié)構(gòu)特征（圖3-A、B）。多序列比對(duì)結(jié)果顯示，該蛋白含有5個(gè)GTP∕GDP結(jié)合位點(diǎn)、1個(gè)Rho插入序列和1個(gè)C末端多變區(qū)等結(jié)構(gòu)域，符合ROP蛋白結(jié)構(gòu)特征（圖4）。進(jìn)化樹聚類分析結(jié)果顯示，GhROP6蛋白與擬南芥AtROP6蛋白同源性最高，屬于Ⅰ類ROP蛋白（圖5）。

圖1 GhROP6基因的克隆與蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.1 Cloning and protein domain prediction of GhROP6 gene

圖2 GhROP6蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測Fig.2 The prediction of potential phosphorylation site of GhROP6 protein

圖3 GhROP6蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 The prediction secondary and tertiary structure of of GhROP6 protein

圖4 多重序列比對(duì)Fig.4 Multiple sequence alignment

圖5 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis

表3 GhROP6基因的生物信息學(xué)分析Table 3 Bioinformatics analysis of GhROP6 gene

2.2 GhROP6基因的表達(dá)模式分析

利用qRT-PCR技術(shù)檢測GhROP6基因的表達(dá)模式，結(jié)果顯示，GhROP6基因在不同組織中均表達(dá)且存在一定的組織特異性，在真葉中的表達(dá)量最高，顯著高于其余部位，約為根部和莖部的2倍，表達(dá)量第二高為子葉（圖6-A）；GhROP6基因的轉(zhuǎn)錄本在干旱處理1和3 h相比于對(duì)照顯著上調(diào)，6和24 h顯著下調(diào)，12 h無顯著差異（圖6-B）；高鹽處理1 h其表達(dá)量顯著上調(diào)，6、12和24 h顯著下調(diào)，3 h無顯著差異（圖6-C）；低溫處理1、3和24 h其表達(dá)量均顯著下調(diào)，6和12 h無顯著差異（圖6-D）；高溫處理3 h其表達(dá)量顯著上調(diào)，24 h顯著下調(diào)，其余處理無顯著差異（圖6-E）；外源ABA處理3和12 h其表達(dá)量均顯著下調(diào)，24 h顯著上調(diào)，6 h無顯著差異（圖6-F）；外源IAA處理3、12和24 h時(shí) 表 達(dá) 量 均 顯 著 上 調(diào)，6 h無 顯 著 差 異（圖6-G）。

圖6 GhROP6基因的表達(dá)模式分析Fig.6 Expression pattern analysis of GhROP6 gene

2.3 GhROP6基因的VIGS載體構(gòu)建

載體構(gòu)建示意圖如圖7-A所示，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增抑制GhROP6基因表達(dá)的靶序列，產(chǎn)物為314 bp，其大小符合預(yù)期（圖7-B）；回收目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行克隆并測序，結(jié)果與目標(biāo)序列一致，未發(fā)生錯(cuò)配現(xiàn)象。測序正確的陽性質(zhì)粒經(jīng)XbaⅠ和KpnⅠ酶切與TRV2連接載體并進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果呈現(xiàn)為一條大于8 000 bp的載體條帶和一條大小在250～500 bp之間的目標(biāo)條帶（圖7-C），其大小均符合預(yù)期，表明GhROP6基因的VIGS載體構(gòu)建成功。

圖7 GhROP6基因VIGS載體構(gòu)建Fig.7 Construction of GhROP6 gene VIGS vector

2.4 GhROP6基因沉默效率檢測

將TRV∶GhROP6、TRV∶GhCLA1和TRV∶RNA2分別與TRV∶RNA1混合后分別侵染棉花子葉，約16 d后，陽性對(duì)照TRV∶GhCLA1的葉片及莖部出現(xiàn)明顯的白化現(xiàn)象（圖8-A）。利用qRT-PCR技術(shù)檢測GhCLA1和GhROP6在根部及真葉中的表達(dá)量，結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照相比，GhCLA1和GhROP6基因的表達(dá)均顯著降低（圖8-B、C），表明本研究所用TRV-VIGS系統(tǒng)可以在植株體內(nèi)正常工作，同時(shí)成功沉默GhROP6基因。

圖8 GhROP6基因沉默效率檢測Fig.8 Silencing efficiency test result of GhROP6 gene

3 討論

棉花在推動(dòng)我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展及社會(huì)穩(wěn)定方面扮演著重要角色，然而近年來全球環(huán)境的惡化及異常氣候的增多，導(dǎo)致棉花在生長過程中所遭受的各種逆境脅迫加劇，干旱、高鹽和極端溫度等非生物脅迫越來越成為影響棉花生長、制約棉花產(chǎn)量及纖維品質(zhì)的重要因素［16］，因此挖掘、鑒定棉花相關(guān)抗逆基因尤為重要。作為植物特有的一種Rho類小G蛋白，ROP蛋白以“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子開關(guān)”的形式參與細(xì)胞各項(xiàng)生命活動(dòng)調(diào)控［3］。近年來對(duì)ROP基因的功能研究已成為基因功能鑒定的熱點(diǎn)問題，但目前關(guān)于棉花ROP基因的功能研究主要集中在棉花纖維發(fā)育的調(diào)控：李先碧等［22］克隆了2個(gè)陸地棉ROP基因GhRacA和GhRacB，其在纖維起始和伸長時(shí)期表達(dá)顯著上調(diào)，可能參與棉花纖維早期發(fā)育的調(diào)控；Delmer等［23］克隆出2個(gè)在棉花纖維初生和次生壁合成時(shí)期優(yōu)勢表達(dá)的基因GhRac9和GhRac13，可能介導(dǎo)棉花次生壁的合成；Kim等［24］從棉籽中克隆獲得1個(gè)在棉花纖維伸長時(shí)期優(yōu)勢表達(dá)的GhRAC1基因，該基因通過介導(dǎo)細(xì)胞骨架的組裝，調(diào)控棉花纖維的伸長；Zhang等［25］發(fā)現(xiàn)IAA可誘導(dǎo)GhRAC13基因的表達(dá)，促進(jìn)棉纖維中次生細(xì)胞壁沉積。對(duì)于ROP基因參與棉花抗逆反應(yīng)調(diào)控的相關(guān)研究較少：Yang等［26］在棉蚜誘導(dǎo)葉片的抑制差減雜交文庫中篩選出了1個(gè)GhRac6基因，超表達(dá)該基因后增強(qiáng)了棉株的抗蚜性，表明ROP基因參與棉花抵御生物脅迫反應(yīng)，但對(duì)其介導(dǎo)非生物脅迫應(yīng)激反應(yīng)的相關(guān)研究報(bào)道較少。本研究根據(jù)擬南芥AtROP1基因的氨基酸序列在棉花基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blast比對(duì)，同源克隆獲得1個(gè)棉花ROP基因，命名為GhROP6，將該基因所編碼蛋白序列與上述基因的蛋白序列比對(duì)，結(jié)果顯示均存在一定的差異性，相似性在70%～85%之間，表明該基因是未報(bào)道的新棉花ROP基因。多序列比對(duì)結(jié)果顯示該蛋白含有5個(gè)GTP∕GDP結(jié)合位點(diǎn)、1個(gè)Rho插入序列和1個(gè)C末端多變區(qū)等結(jié)構(gòu)域，與已報(bào)道的ROP蛋白結(jié)構(gòu)相同，符合植物ROP蛋白基本結(jié)構(gòu)特征（圖4）。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明GhROP6蛋白與擬南芥AtROP6蛋白具有較高的同源性，聚類分析結(jié)果顯示其屬于Ⅰ類ROP蛋白（圖5）。Ⅰ類ROP蛋白主要參與調(diào)控植物的生長發(fā)育及抗逆反應(yīng)：如AtROP6蛋白通過參與SA信號(hào)通路的調(diào)控介導(dǎo)擬南芥抵御白粉病菌反應(yīng)，同時(shí)通過介導(dǎo)ROS爆發(fā)參與缺鐵應(yīng)激反應(yīng)［27-28］；MaROP1蛋白正向調(diào)節(jié)植株的抗旱及耐鹽性［29］；AtROP1基因是調(diào)控植株耐旱反應(yīng)的重要基因，其在保衛(wèi)細(xì)胞中優(yōu)勢表達(dá)，ABA通過滅活A(yù)tROP1蛋白，誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉［30］；AtROP3蛋白參與調(diào)控花粉管伸長及胚芽和根部發(fā)育［31］；NtROP1基因響應(yīng)高鹽脅迫，在植株耐鹽反應(yīng)中扮演負(fù)調(diào)控因子的角色［32］；CaROP1蛋白作為信號(hào)分子開關(guān)，通過參與茉莉酸（JA）∕ET信號(hào)通路介導(dǎo)辣椒抵御病原菌侵染反應(yīng)［33］。GhROP6蛋白與上述蛋白同屬Ⅰ類，與其序列同源性在89%～94%之間，推測GhROP6蛋白可能在介導(dǎo)棉花抗逆反應(yīng)中具有重要功能。

以往的研究表明，基因的表達(dá)模式通常是其功能的指標(biāo)［34］。本研究利用qRT-PCR技術(shù)探究了GhROP6基因在不同組織及干旱等4種非生物脅迫下的表達(dá)模式，結(jié)果顯示GhROP6基因在不同組織中的均有表達(dá)且存在一定的組織特異性（圖6-A），推測其在不同組織中所發(fā)揮的調(diào)控功能有所差異；GhROP6基因的轉(zhuǎn)錄本受干旱、高鹽、低溫和高溫處理影響，且在不同脅迫下的表達(dá)模式存在差異（圖6-B～E），推測GhROP6基因可能在植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫適應(yīng)過程中作為連接多個(gè)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控因子，該基因響應(yīng)干旱和高鹽脅迫程度更強(qiáng)，因此后續(xù)研究應(yīng)更多關(guān)注GhROP6基因在棉花耐旱及抗鹽反應(yīng)的中的功能。作為近年來興起的一種反向遺傳學(xué)技術(shù)，VIGS因具有快速、高效等優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用于植物靶基因的功能鑒定［35］。TRV載體因具有廣泛的寄主、效果持久且毒性輕等優(yōu)勢，已成為應(yīng)用最多的VIGS載體之一，TRV-VIGS系統(tǒng)現(xiàn)已普遍用于植物抗逆相關(guān)基因功能的探究［36］。本研究選用TRV-VIGS系統(tǒng)，成功構(gòu)建了GhROP6基因的VIGS載體并轉(zhuǎn)化棉花，定量檢測結(jié)果顯示已成功抑制GhROP6基因表達(dá)（圖8-C），為后續(xù)進(jìn)一步探究GhROP6基因的分子生物學(xué)功能及棉花抗逆相關(guān)基因的挖掘奠定了基礎(chǔ)。

植物在生命周期中會(huì)不可避免地遭受各種逆境脅迫的影響，因此自身進(jìn)化出了多種調(diào)控機(jī)制以適應(yīng)各種逆境，激素調(diào)節(jié)是重要途徑之一［37］，即植物通過調(diào)控自身內(nèi)源激素含量的變化（降低IAA濃度、提高ABA濃度等），達(dá)到對(duì)逆境的適應(yīng)［37］。前人研究發(fā)現(xiàn)，ROP基因是ABA信號(hào)途徑的負(fù)調(diào)節(jié)因子，同時(shí)也是IAA信號(hào)通路的正調(diào)節(jié)因子［38］。本研究利用qRT-PCR技術(shù)探究了GhROP6基因在外源ABA和IAA處理下的表達(dá)模式，結(jié)果顯示GhROP6基因響應(yīng)ABA和IAA處理（圖6-F、G），可知GhROP6基因可能參與ABA和IAA信號(hào)通路，介導(dǎo)棉花抗逆反應(yīng)。本研究為后續(xù)進(jìn)一步深入研究GhROP6基因的生物學(xué)及相關(guān)調(diào)控機(jī)制提供了重要的理論研究，也首次揭示了棉花ROP基因通過參與ABA和IAA等激素信號(hào)通路介導(dǎo)棉花抗逆反應(yīng)。

4 結(jié)論

本研究克隆獲得了1個(gè)陸地棉小GTP結(jié)合蛋白基因GhROP6，其開放閱讀框?yàn)?97 bp，編碼198個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為21.87 kDa，定位于細(xì)胞膜，為堿性、親水性、非跨膜蛋白；含有5個(gè)GTP∕GDP結(jié)合位點(diǎn)、1個(gè)Rho插入序列和1個(gè)C末端多變區(qū)，與擬南芥AtROP6蛋白同源性最高，屬于Ⅰ類ROP蛋白。GhROP6基因在棉花根、莖、真葉和子葉中均有表達(dá)且在真葉中表達(dá)量最高；該基因響應(yīng)干旱、高鹽、低溫和高溫等逆境脅迫及外源ABA和IAA處理。本試驗(yàn)還構(gòu)建了GhROP6基因的VIGS載體并轉(zhuǎn)化至棉花，獲得了沉默植株。