新型冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白14的表達(dá)及酶活性分析

陳 雙，徐婧雯，丁開(kāi)云，劉建生，彭小忠,3，劉紅旗*

1.昆明醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)系，云南 昆明 650500；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650118；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京 100005

新型冠狀(新冠)病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2/2019 novel coronavirus, SARS-CoV-2/2019-nCoV)屬于β屬冠狀病毒，是一種具有包膜的單股正鏈RNA病毒[1]。SARS-CoV-2的暴發(fā)給全球公共衛(wèi)生與健康帶來(lái)了巨大的威脅(https://covid19.who.int/)。因此，嚴(yán)格預(yù)防和控制SARS-CoV-2的感染與流行是全球亟待解決的事情。病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后，基因組的開(kāi)放閱讀框1a/b在胞質(zhì)內(nèi)翻譯并合成十幾個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structure proteins, Nsps)，nsps組成病毒基因組復(fù)制所必需的復(fù)制-轉(zhuǎn)錄復(fù)合體[2]。其中nsp14是復(fù)制-轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的組成部分之一，在病毒基因組復(fù)制過(guò)程中具備3′-5′核酸外切酶活性和鳥(niǎo)嘌呤N7-甲基轉(zhuǎn)移酶活性，發(fā)揮雙重酶活性功能，分別維持病毒基因組高保真性復(fù)制和參與mRNA的加帽修飾過(guò)程[3-4]。除了以上功能外，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2 Nsp14在抑制宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)翻譯[5]和調(diào)控宿主細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路[6]等過(guò)程具有重要的作用。此外，Nsp14還在減毒滅活疫苗的研發(fā)中展現(xiàn)出較好的潛力[7]。因此，Nsp14在維持子代病毒正常擴(kuò)增所發(fā)揮的重要功能使其成為了抗病毒治療藥物研發(fā)的潛在靶點(diǎn)。本研究通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)成功地表達(dá)并純化出具有酶活性的SARS-CoV-2 Nsp14，為靶向Nsp14的抗病毒治療藥物的篩選提供有利的條件。

1 材料與方法

1.1 材料

pET-30a(+)和pGEX-6P-1質(zhì)粒(本實(shí)驗(yàn)室保存)；大腸桿菌密碼子偏好性?xún)?yōu)化后的SARS-CoV-2原始株nsp14序列(Genewiz公司)，保存于pET-30a(+)質(zhì)粒中，命名為pET30a-linker-OPTI-Nsp14。linker-sumo序列保存于pUC57質(zhì)粒中，命名為pUC57-linker-sumo(Sangon公司)；大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(Angyubio公司)；限制性?xún)?nèi)切酶和T4 DNA連接酶(NEB公司)；In-Fusion HD Cloning Kit、PrimeSTAR?Max DNA Polymerase和RNase A核酸酶(TaKaRa公司)；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(Tiangen公司)；溶菌酶(Solarbio公司)；谷胱甘肽高速層析介質(zhì)(4FF)預(yù)裝柱(Biodragon公司)；Superdex200 Increase 10/300GL 層析柱(GE公司)。

1.2 方法

1.2.1 序列分析和引物設(shè)計(jì)：利用MEGA7軟件分析SARS-CoV-2原始株nsp14的核苷酸序列和其編碼的氨基酸序列。設(shè)計(jì)質(zhì)粒的引物如表1所示。

1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定：使用表1的引物和限制性?xún)?nèi)切酶獲取目的基因和線性化的載體。目的片段經(jīng)純化后連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α細(xì)胞，接種于氨芐抗性(Amp:100 μg/mL)或卡那抗性(Kana:50 μg/mL)的LB平板上培養(yǎng)過(guò)夜。挑取多個(gè)單克隆菌落至培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，取1 μL菌液作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)PCR鑒定陽(yáng)性的菌液提取其質(zhì)粒，再進(jìn)行質(zhì)粒雙酶切(37 ℃，1 h)，酶切的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。雙酶切鑒定正確的質(zhì)粒送Sangon公司進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定。

1.2.3 目的蛋白的可溶性表達(dá)與鑒定：將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)細(xì)胞。挑取單克隆菌落至培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，取5 mL菌液轉(zhuǎn)接至250 mL培養(yǎng)基中，于37 ℃、220 r/min搖床中培養(yǎng)至菌液的A600值為0.4～0.6，隨后將菌液溫度降至20 ℃，再加入IPTG(0.5 mmol/L)誘導(dǎo)表達(dá)16 h。離心(4 ℃，10 000×g)收集菌體后用25 mL超聲緩沖液重懸菌體沉淀，于冰水浴中超聲(40% 功率，超聲5 s，停頓10 s，超聲1 h)，超聲后離心30 min分離上清液和沉淀(4 ℃，18 000×g)，再用等體積的超聲緩沖液重懸沉淀。取等體積的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE，利用考馬斯亮藍(lán)染色和Western blot(His-tag/GST-tag抗體)驗(yàn)證目的蛋白質(zhì)的表達(dá)量。用ExPASy Prot Param tool 計(jì)算表達(dá)產(chǎn)物的分子大小。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

1.2.4 pGEX6P1-GST-OPTI-Nsp14表達(dá)溫度的優(yōu)化：按照1.2.3步驟準(zhǔn)備250 mLE.coliBL21(DE3)表達(dá)菌液，分別在37、30、20和13 ℃誘導(dǎo)表達(dá)。按照谷胱甘肽親和柱的說(shuō)明書(shū)純化超聲上清液，用洗脫緩沖液(40 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，150 mmol/L NaCl，5 %甘油(v/v)，0.5 mmol/L PMSF，20 mmol/L還原型谷胱甘肽)進(jìn)行洗脫。洗脫液用10 ku超濾管濃縮至2 mL。取上清液和洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE，利用考馬斯亮藍(lán)染色驗(yàn)證蛋白質(zhì)表達(dá)量。

1.2.5 pGEX6P1-GST-OPTI-Nsp14表達(dá)產(chǎn)物的純化：準(zhǔn)備1LE.coliBL21 (DE3)表達(dá)菌液，離心(4 ℃，10 000×g)收集菌體后用50 mL超聲緩沖液重懸，超聲液中加入溶菌酶(500 μg/mL)，于4 ℃緩慢振蕩0.5 h后進(jìn)行超聲(40%功率，超聲15 s，停頓30 s，超聲90 s)和親和純化。將洗脫液的緩沖液更換為保存緩沖液(25 mmol/L HEPES pH 7.5，150 mmol/L NaCl，5%甘油(v/v)，0.5 mmol/L PMSF)，測(cè)定其總蛋白量后，每100 mg蛋白質(zhì)加入1 mg 3C蛋白酶(本實(shí)驗(yàn)室制備)，于4 ℃緩慢振蕩16 h。酶切液經(jīng)親和純化后收集流穿液，再用分子篩柱進(jìn)行純化，最終得到不含標(biāo)簽的Nsp14(-80 ℃保存)，用已知濃度的BSA標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)灰度分析測(cè)定其蛋白質(zhì)濃度。

1.2.6 非結(jié)構(gòu)蛋白14(Hsp14)核酸酶活性的分析：dsRNA序列(Oligo ii+ Oligo iii)見(jiàn)參考文獻(xiàn)[8]，用無(wú)酶水將dsRNA稀釋至0.5 μmol/L。用反應(yīng)緩沖液(25 mmol/L HEPES pH 7.5，20 mmol/L NaCl，0.02% Tween-20，5% 甘油，5 mmol/L MgCl2，0.1 mg/mL BSA，0.5 mmol/L PMSF，2 mmol/L DDT)配制反應(yīng)體系(20 μL)：1)2 μL dsRNA(0.5 μmol/L)；2)Nsp14終濃度為0、50、75、100、200、250、500和1 000 nmol/L；3)反應(yīng)緩沖液補(bǔ)充至20 μL。RNase A(1 g/L)作為對(duì)照替代Nsp14組分，其余組分不變。反應(yīng)體系于37 ℃水浴鍋中孵育45 min后加入20 μL終止液(98%甲酰胺，10 mmol/L EDTA)，于95 ℃變性2 min后冰上放置。取20 μL反應(yīng)物進(jìn)行尿素(7 mol/L)聚丙烯酰胺凝膠電泳(180 V電泳1.5 h)。電泳結(jié)束后，利用Odyssey紅外激光掃描程序系統(tǒng)對(duì)凝膠進(jìn)行掃描(激發(fā)波長(zhǎng)：700 nm)。

2 結(jié)果

2.1 Nsp14氨基酸序列和核苷酸序列的分析

分析發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2 Nsp14由527個(gè)氨基酸組成，含有26個(gè)脯氨酸和23個(gè)半胱氨酸(紅色標(biāo)記的氨基酸)，蛋白分子大小為59.97 ku(圖1)。如圖1所示的nsp14序列(proto sequence)包含較多不利于大腸桿菌表達(dá)的密碼子，同時(shí)，一些主要的稀有密碼子(黑色方框)呈現(xiàn)近距離分布和串聯(lián)分布。經(jīng)分析后，將這些密碼子優(yōu)化為利于大腸桿菌表達(dá)的偏好性密碼子(OPTI sequence)。

proto sequence.nucleotide sequence of SARS-CoV-2 proto strain nsp14; OPTI sequence, nucleotide sequence of SARS-CoV-2 proto strain nsp14 with optimization of codon preference in E.coli; the letters in black box, the main rare codons and their encoded amino acids

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

利用pET-30a(+)、pET30a-linker-sumo和pGEX-6P-1載體構(gòu)建pET30a-linker-Nsp14、pET30a-linker-OPTI-Nsp14、pET30a-linker-sumo-OPTI-Nsp14和pGEX6P1-GST-OPTI-Nsp14重組表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建策略如圖2 A所示。pET30a-linker-Nsp14 和pET30a-linker-OPTI-Nsp14質(zhì)粒的經(jīng)NdeⅠ和SalⅠ雙酶切后的片段大小為5 257和1 616 bp，pET30a-linker-sumo-OPTI-Nsp14質(zhì)粒經(jīng)NotⅠ和XbaⅠ雙酶切后的片段大小為5 204和1 963 bp，pGEX-6P1-GST-OPTI-Nsp14質(zhì)粒經(jīng)NcoⅠ和EcoRⅤ雙酶切后的片段大小為3 387和3 154 bp，4個(gè)重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果均與預(yù)期結(jié)果符合(圖2B)。4個(gè)質(zhì)粒經(jīng)DNA測(cè)序鑒定的結(jié)果也均正確(結(jié)果未展示)。

2.3 鑒定目的蛋白的可溶性表達(dá)

計(jì)算4個(gè)重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物的分子大小分別為60.97、60.97、72.40和86.38 ku。4個(gè)質(zhì)粒經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后得到了與預(yù)期大小一致的目的蛋白條帶(圖3)。鑒定結(jié)果顯示，4個(gè)質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物大部分以包涵體的形式存在于超聲沉淀中(圖3A～D左圖，pellet泳道)。除了pGEX6P1-GST-OPTI-Nsp14質(zhì)粒的超聲上清液中可檢測(cè)到預(yù)期蛋白條帶外(圖3D右圖，supernatant泳道)，其他質(zhì)粒均未能檢測(cè)到明顯的目的蛋白條帶(圖3A～C 右圖，supernatant泳道)。

2.4 優(yōu)化表達(dá)溫度

pGEX6P1-GST-OPTI-Nsp14質(zhì)粒表達(dá)溫度優(yōu)化的結(jié)果顯示，當(dāng)誘導(dǎo)表達(dá)的溫度為37 ℃時(shí)，可明顯降低目的蛋白的可溶性表達(dá)量(圖4，泳道2)。將表達(dá)溫度降到20 ℃和13 ℃后，可溶性表達(dá)量的差異不明顯(圖4，泳道6；泳道8)。相較于以上的表達(dá)溫度，當(dāng)pGEX6P1-GST-OPTI-Nsp14誘導(dǎo)表達(dá)于30 ℃時(shí)，可檢測(cè)到較高的可溶性表達(dá)量(圖4，泳道4)。

A.construction strategy of the four Nsp14 recombinant plasmids; B.enzyme digestion of the recombinant plasmids: M.DNA marker; 1.enzyme digestion of pET30a-linker-Nsp14(Nde Ⅰ, Sal Ⅰ); 2.enzyme digestion of pET30a-linker-OPTI-Nsp14(Nde Ⅰ, Sal Ⅰ); 3.enzyme digestion of pET30a-linker-sumo-OPTI-Nsp14(Not Ⅰ, Xba Ⅰ); 4.enzyme digestion of pGEX6P1-GST-OPTI-Nsp14(Nco Ⅰ, EcoR Ⅴ)

M.protein marker; A.expression identification of pET30a-linker-Nsp14(left: Coomassie Brilliant blue staining, right: Western blot of His-tag antibody); B.expression identification of pET30a-linker-OPTI-Nsp14 (left: coomassie brilliant blue staining, right: Western blot of His-tag antibody); C.expression identification of pET30a-linker-sumo-OPTI-Nsp14 (left: coomassie Brilliant blue staining, right: Western blot of His-tag antibody); D.expression identification of pGEX6P1-GST-OPTI-Nsp14 (left: Coomassie Brilliant blue staining, right: Western blot of GST-tag antibody)

2.5 表達(dá)與純化目的蛋白

pGEX6P1-GST-OPTI-Nsp14重組質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后發(fā)現(xiàn)，通過(guò)考馬斯亮藍(lán)色不能明顯地檢測(cè)到超聲上清液中的Nsp14融合蛋白(圖5A，泳道1)，經(jīng)親和純化后可觀察到目的蛋白條帶(圖5A，泳道2)。3C蛋白酶作用后，Nsp14融合蛋白被剪切為2個(gè)蛋白條帶，其分子質(zhì)量與Nsp14(59.97 ku)和標(biāo)簽蛋白(26.43 ku)的預(yù)期大小相符合(圖5A，泳道3)。酶切液經(jīng)親和純化后可明顯去除標(biāo)簽蛋白(圖5A，泳道4)。分子篩進(jìn)一步純化后，可見(jiàn)一個(gè)含Nsp14融合蛋白的紫外吸收峰(圖5B)，測(cè)得其蛋白濃度為0.24 mg/mL(圖5A，泳道5)。

2.6 Nsp14核酸酶活性的分析

純化后的Nsp14酶活性分析結(jié)果表明，Nsp14對(duì)dsRNA具有核酸酶活性(圖6)。酶切Nsp14 dsRNA的程度與其終濃度成正相關(guān)。如圖6黑色箭頭所示，隨著Nsp14的終濃度增大，dsRNA被酶切后形成的小片段數(shù)量增多。當(dāng)Nsp14的終濃度為500 nmol/L以上，可觀察到明顯的核酸酶作用。

M.protein marker; A.identification of the target protein in processes of purification: 1.supernatant; 2.the fusion protein with a GST tag purified through glutathione affinity column; 3.the fusion protein with GST tag was excised by 3C protease; 4.the protein liquid of the lane of 3 purified through glutathione affinity column; 5.concentrated protein solution of 13-16 samples from Fig 5B; B.the protein liquid of the lane of 4 in Fig 5A purified through a molecular sieve column (Superdex200 Increase 10/300 GL)

+.1 mg/mL RNase A substituted Nsp14 as a control圖6 7 mol/L尿素的PAGE分析Nsp14的核酸酶活性分析Fig 6 Analysis of nuclease activity of Nsp14 by PAGE with 7 mol/L urea

3 討論

非結(jié)構(gòu)蛋白14(Nsp14)在冠狀病毒中保守性較高，是研發(fā)廣譜抗病毒治療藥物的潛在靶點(diǎn)。現(xiàn)有的部分酶抑制劑藥物可明顯的抑制Nsp14的酶活性功能，在細(xì)胞水平展現(xiàn)出協(xié)同抑制病毒基因組復(fù)制的作用[9]。但作為廣譜抗病毒藥物的研發(fā)，還需要進(jìn)一步明確Nsp14的結(jié)構(gòu)特征，為藥物的作用機(jī)制研究提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。國(guó)內(nèi)外研究已通過(guò)定點(diǎn)突變、反向遺傳學(xué)和構(gòu)建融合蛋白等方法，對(duì)Nsp14進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造研究，以期進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Nsp14的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系。

對(duì)于大腸桿菌而言，SARS-CoV-2 Nsp14的序列中稀有密碼子較多，且稀有密碼子呈現(xiàn)串聯(lián)分布，這可能不利于Nsp14的表達(dá)[10]，需要對(duì)Nsp14序列進(jìn)行優(yōu)化?；赟ARS-CoV-2與SARS-CoV的Nsp14氨基酸序列同源性為90%以上[11]，本文參考了SARS-CoV Nsp14 序列表達(dá)所使用的linker(MGHHHHHHGS)和sumo融合標(biāo)簽[8, 12]，以構(gòu)建SARS-CoV-2 Nsp14蛋白的表達(dá)質(zhì)粒。然而，這些融合標(biāo)簽在本文中均不能顯著地提高可溶性表達(dá)量。最終，本文利用GST融合標(biāo)簽構(gòu)建的pGEX6P1- GST-OPTI-Nsp14質(zhì)?？娠@著地提高Nsp14的可溶性，這提示不同融合標(biāo)簽的促溶效果可能不同。pGEX6P1-GST-OPTI-Nsp14重組質(zhì)粒表達(dá)的Nsp14融合蛋白攜帶GST標(biāo)簽，可被3C蛋白酶特異性的剪切并去除[13]，再通過(guò)分子篩純化后得到了純度較高的Nsp14。本文中Nsp14的表達(dá)量較低，1 L的表達(dá)菌液可獲得約0.1 mg Nsp14，這可能因Nsp14自身含有大量脯氨酸和半胱氨酸以及分子量較大等特性，降低了其在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)[14]。本研究經(jīng)純化后的Nsp14對(duì)dsRNA具有核酸酶活性，下一步試驗(yàn)中將通過(guò)構(gòu)建MERS-CoV和SARS-CoV病毒的Nsp14重組表達(dá)質(zhì)粒，以制備不同冠狀病毒的Nsp14，為廣譜抗病毒藥物的研發(fā)提供有利的條件。