環(huán)烷酸對淡水微藻生理生化特征的影響*

林治豪 張煥新 唐學(xué)璽, 3 王 影, 3

環(huán)烷酸對淡水微藻生理生化特征的影響*

林治豪1張煥新2唐學(xué)璽1, 3王 影1, 3①

(1. 中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院 山東青島 266003; 2. 山東師范大學(xué)地理與環(huán)境學(xué)院 山東濟南 250014; 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實驗室 山東青島 266237)

環(huán)烷酸是高酸原油的主要污染組分, 對水生生態(tài)系統(tǒng)造成潛在威脅。在不同濃度環(huán)烷酸處理下對兩種模式淡水微藻——萊茵衣藻()和小球藻()進行了96 h的連續(xù)培養(yǎng), 研究了環(huán)烷酸脅迫對兩種淡水微藻種群及生理生化特征的影響, 旨在為水生生態(tài)系統(tǒng)中環(huán)烷酸污染的生態(tài)風(fēng)險預(yù)測與規(guī)避提供前瞻性的研究資料。研究結(jié)果表明, 低濃度環(huán)烷酸(0.5～4 mg/L)會刺激淡水微藻的種群增長, 而高濃度環(huán)烷酸(8～16 mg/L)會抑制淡水微藻的種群增長, 造成急性毒性損傷。低濃度環(huán)烷酸處理下兩種微藻葉綠素含量上升, 脂質(zhì)積累, 高濃度環(huán)烷酸處理下兩種微藻葉綠素含量下降而多糖含量上升, 推測環(huán)烷酸劑量可能會影響淡水微藻能量存儲方式。兩種微藻在環(huán)烷酸脅迫下均會受到氧化損傷, 造成活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量上升, 兩種微藻抗氧化酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和過氧化氫酶(catalase, CAT)對環(huán)烷酸處理具有種屬差異; 高濃度環(huán)烷酸對淡水微藻的急性損傷具有時間效應(yīng), 毒性隨著脅迫時間的延長而逐漸增強。綜上, 環(huán)烷酸對淡水微藻的種群及生理過程具有明顯的劑量和時間效應(yīng), 研究結(jié)果可為淡水水生生態(tài)系統(tǒng)的環(huán)烷酸污染的風(fēng)險評估提供數(shù)據(jù)支撐。

環(huán)烷酸; 淡水微藻; 種群動態(tài); 生化特征; 抗氧化酶活性;毒物興奮效應(yīng)

隨著原油不斷開采, 世界優(yōu)質(zhì)原油的儲量逐漸下降。高酸原油由于儲量豐富, 價格低廉在國際市場上越來越受重視(童曉光等, 2018)。高酸原油在開采和運輸?shù)倪^程中, 不可避免地會導(dǎo)致高酸石油污染物的泄漏。環(huán)烷酸(naphthenic acids, NAs)天然存在于石油中, 是石油中主要的酸性成分, 在高酸原油中大量存在(田松柏, 2005)。作為石油中主要的毒性成分之一, 環(huán)烷酸的生態(tài)毒性研究成為了石油污染研究中重要的問題(Clemente, 2005)。了解環(huán)烷酸對水生生態(tài)環(huán)境的影響對環(huán)烷酸污染的風(fēng)險評估和生態(tài)修復(fù)具有重要的意義。

環(huán)烷酸是一類環(huán)烷基直鏈羧酸的統(tǒng)稱, 其分子中一般含有一個或多個飽和環(huán), 通用分子式為CH2n+zO2, 其中代表碳原子數(shù);代表不飽和度,的數(shù)值通常是-2的倍數(shù); 有些環(huán)烷酸還含有芳香酸、氮、硫等其他元素(Swigert, 2015)。環(huán)烷酸化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定, 具有低揮發(fā)性, 分子結(jié)構(gòu)中同時存在烷基憎水基團和羧基親水基團, 因而具有表面活性劑的特性, 能以分子或者環(huán)烷酸鹽的形式溶于水并在水環(huán)境中持久存在(Leung, 2001)。這種可溶性使得環(huán)烷酸具有生物積累性和生物放大效應(yīng), 大大提高了環(huán)烷酸在水環(huán)境中的擴散能力。環(huán)烷酸會從石油開采區(qū)滲透并污染附近的湖泊和濕地等水域環(huán)境, 研究表明在加拿大的阿爾伯塔采礦區(qū)附近的自然濕地中環(huán)烷酸的濃度可達10～60 mg/L(Clemente, 2005; Vander, 2021)。目前已在土壤、地下水、河流、湖泊、沉積物等環(huán)境介質(zhì)及蚯蚓、淡水魚等生物體內(nèi)檢測到環(huán)烷酸(Scott, 2020)。

環(huán)烷酸具有較強的生物毒性, 已有研究表明環(huán)烷酸對哺乳動物、鳥類、淡水魚類、兩棲類、細菌等具有很強的生物毒性, 影響個體的發(fā)育和繁殖、干擾內(nèi)分泌系統(tǒng), 甚至造成個體死亡(Li, 2017)。環(huán)烷酸低劑量長時間的水域毒性效應(yīng)近幾年受到越來越多的關(guān)注。最新研究表明, 環(huán)烷酸的低劑量長時間的暴露對斑馬魚等淡水魚、蚯蚓等具有生殖毒性、內(nèi)分泌干擾效應(yīng)和免疫阻斷效應(yīng)(Quinlan, 2015)。也有研究表明, 極低的環(huán)烷酸濃度(100 μg/L)長期暴露也會對蚍蜉等水生動物造成慢性損傷(Pomfret, 2021)。

在前期的實驗中發(fā)現(xiàn)環(huán)烷酸會對三角褐指藻等海洋微藻造成急性毒性效應(yīng)(Zhang, 2018), 但是對淡水微藻的研究并未見相關(guān)報道。相比于海洋, 陸域石油的儲量更大, 環(huán)烷酸等石油污染物對淡水水域的潛在污染量更大, 污染傳播速率更快, 因此亟需了解環(huán)烷酸對淡水域生態(tài)系統(tǒng)的危害。淡水微藻是淡水域生態(tài)系統(tǒng)中重要的初級生產(chǎn)者, 在水域生態(tài)系統(tǒng)的營養(yǎng)傳遞、生產(chǎn)力水平穩(wěn)定及碳循環(huán)等方面均發(fā)揮重要作用。因此, 本實驗選用模式微藻——萊茵衣藻()和小球藻()作為受試生物, 研究環(huán)烷酸對微藻生理生化特征的效應(yīng)機制, 為環(huán)烷酸對微藻的毒性效應(yīng)和興奮效應(yīng)提供理論與實踐經(jīng)驗, 同時也為水生生態(tài)系統(tǒng)中環(huán)烷酸污染的生態(tài)風(fēng)險預(yù)測與規(guī)避提供前瞻性的研究資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗選用模式淡水微藻萊茵衣藻()和小球藻(), 由中國海洋大學(xué)藻種庫提供。藻種的培養(yǎng)使用蒸餾水, 培養(yǎng)基為f/2培養(yǎng)基(不含硅), 培養(yǎng)條件為光照強度80 μmol photons/(m2·s), 光照周期12 h / 12 h, 溫度(20±1) °C, pH=7.4±0.1。

根據(jù)文獻檢索及前期現(xiàn)場調(diào)查結(jié)果, 擬選擇水域環(huán)境和生物體內(nèi)廣泛存在的7碳環(huán)烷酸(C7H12O2)為污染因子。環(huán)烷酸購自Sigma公司(美國Sigma- Aldrich公司, CAS: 1338-24-5)。

1.2 環(huán)烷酸的配置及濃度測定

將環(huán)烷酸與蒸餾水按照1︰9的比例進行混合并倒入燒杯中, 然后使用磁力攪拌器在加蓋密封、避光的條件下連續(xù)攪拌24 h, 使環(huán)烷酸與蒸餾水充分混勻。避光靜置5 h后倒取下層水相, 為環(huán)烷酸母液。母液使用0.22 μm微孔濾膜進行抽濾和除菌, 靜置于4 °C冰箱內(nèi), 避光密封保存并在實驗期間保存使用。環(huán)烷酸能夠體現(xiàn)親水性, 因此可以分析出它在水中的濃度。

采用島津氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司GCMS-QP2020 NX)進行濃度分析。在這之后檢測環(huán)烷酸在水中的具體溶解度。樣品的前處理: 本研究先取一定量的樣品以丙酮︰正己烷為1︰1的混合溶劑萃取, 所有樣本上層的正己烷通過無水硫酸鈉進行干燥處理, 在這以后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā), 相應(yīng)的置換溶劑選擇的是正己烷, 并通過硅膠和氧化鉬構(gòu)建而成的多段柱進行凈化, 然后將樣品旋蒸, 通過氮吹儀進行濃縮處理之后, 將其放置到帶螺旋蓋樣品瓶內(nèi), 最后完成GC-MS分析。測定條件參數(shù): 色譜柱(TG-5MS, 15 m, 0.25 mm, 0.1 μm), 程序升溫: 160 °C (2 min), 35 °C/min升溫至320 °C (10 min), 檢測器根據(jù)實際需求選擇的是EI離子源, 并利用離子掃描的方式, 相應(yīng)的傳輸線溫度等于300 °C, 實際的離子源溫度等于250 °C。采用的載氣類型主要為氦氣, 具體的載氣流速等于l.5 mL/min。而對于進樣模式來說, 其主要為SSL進樣口, 其進樣量等于1 μL。結(jié)合GC-MS測定的數(shù)據(jù), 進而分析出三組環(huán)烷酸母液中所含環(huán)烷酸的實際濃度值, 見表1。

表1 環(huán)烷酸儲備液GC-MS分析結(jié)果表

1.3 實驗設(shè)計

將處于對數(shù)生長期的兩種淡水微藻接種入f/2培養(yǎng)基, 培養(yǎng)基盛于容量為500 mL的三角瓶中進行急性毒性試驗, 兩種微藻的起始濃度分別為236.5×104和550.6×104cells/mL。根據(jù)預(yù)實驗的模擬結(jié)果, 將實驗分為6個處理組, 每個處理組中環(huán)烷酸質(zhì)量濃度分別為0、0.5、2、4、8、16 mg/L, 其中0 mg/L為空白對照組, 每個實驗組設(shè)計三個平行實驗。實驗持續(xù)96 h, 每隔8 h搖藻一次, 防止藻細胞沉淀。在兩種微藻接種后的0、24、48、72 及96 h共5個階段在超凈工作臺內(nèi)進行藻細胞取樣。每個時間點分別檢測各個組的種群密度、葉綠素含量(chlorophyll,)、抗氧化酶過氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和過氧化氫酶(Catalase, CAT)活性, 活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)陽性率和生理生化指標(多糖、蛋白質(zhì)和粗脂的含量)。

1.4 實驗方法

1.4.1 種群密度及抑制率 兩種微藻的種群密度的檢測使用血球計數(shù)板計數(shù)法。每次取樣取1 mL藻液, 加入10 μL的魯格試劑固定并染色藻細胞。在光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司CX31)下, 使用血細胞計數(shù)板測定細胞密度, 并計算藻細胞的種群密度。然后根據(jù)OECD (1984)規(guī)定的方法分析環(huán)烷酸對兩種微藻的抑制率: 根據(jù)每次采樣時的藻細胞密度, 繪制出不同濃度環(huán)烷酸處理組的藻細胞密度隨時間變化的變化曲線, 即生長曲線。然后按照下列公式計算出抑制率:

式中,I表示特定濃度下藻類種群密度的抑制率(%);表示生長曲線所包圍的面積;0表示96 h空白對照組生長曲線所包圍的面積;A表示96 h處理組生長曲線所包圍的面積;1表示實驗開始后首次測定的時間(24 h);t表示第次測定的時間(h);t–1表示第–1次測定的時間(h);0表示藻類的起始細胞密度;N表示t時刻測定的藻細胞的密度(cells/mL);N–1表示t–1時刻測定的藻細胞的密度(cells/mL)。

1.4.2 光合色素含量的測定 使用丙酮浸提法檢測葉綠素的含量。每次取樣時取5 mL藻液, 藻細胞使用10 mL 體積分數(shù)為90%的丙酮浸提48 h。浸提后4 °C下離心15 min (4 000 r/min), 取上清液備用。葉綠素含量通過UV-8000紫外分光光度計(上海元析有限公司)進行測定。用體積分數(shù)為90%的丙酮作為空白標零, 對樣品進行350～700 nm的波長掃描, 讀取663和645 nm處的吸光度。重復(fù)取樣5次, 計算平均值。葉綠素的含量按照如下公式計算(Lichtenthaler, 1983):

式中,chl a代表葉綠素的含量(μg/cell),和分別代表663和645 nm波長下的吸光值,代表采樣時間點下的細胞密度(cells/mL)。

1.4.3 抗氧化酶活力的測定 粗酶液提取: 每次采樣后將150 mL藻液經(jīng)1.2 μm孔徑的微孔濾膜過濾后收集濾膜上的藻泥, 將藻泥移入冰浴預(yù)冷的研缽內(nèi)并加入1 mL磷酸緩沖液(pH=7.4)和適量石英砂, 在冰浴下將藻泥充分研磨。研磨后的勻漿液4 °C下10 000 r/min離心10 min, 提取上清液即為粗酶提取液, 放于4 °C冰箱保存?zhèn)溆谩？扇苄缘鞍缀康臏y定, 采用考馬斯亮藍G-250法進行。使用Sigma (美國Sigma-Aldrich公司)的SOD活性測定試劑盒和CAT活性測定試劑盒對粗酶液進行測定。

1.4.4 ROS陽性率的測定 微藻ROS陽性率的檢測采用2′7′-熒光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)染色法進行(Zhao, 2020)。DCFH-DA購買自美國Sigma-Aldrich公司, CAS 編號為4091-99-0, 實驗前配置為500 μmol/L的工作液。每次取樣時取20 mL藻液, 經(jīng)1.2 μm孔徑的微孔濾膜過濾后重懸于1 mL的蒸餾水中。取500 μL的重懸液并加入5 μL的DCFH-DA工作液, 搖床避光孵育40 min。隨后4 °C 4 000 r/min離心兩次, 并用500 μL蒸餾水重懸沉淀。

最后一次沖洗沉淀的重懸液避光保存在4 °C, 并在2 h內(nèi)完成檢測。使用CytoFLEX流式細胞儀(美國Beckman公司), 在FITC通道(激發(fā)光488 nm, 吸收光為525～565 nm)檢測單個藻細胞二氯熒光素(DCF)的熒光強度, 并根據(jù)細胞的染色程度計算出ROS陽性率。

1.4.5 粗脂含量的測定 本實驗用乙醚-石油醚法測定微藻粗脂的含量(馬帥等, 2010)。每次取樣時取50 mL藻液, 經(jīng)1.2 μm孔徑的微孔濾膜過濾后重懸于1 mL的蒸餾水中, 在4 °C下8 000 r/min離心10 min, 去掉上清, 保留藻泥。藻泥中加入3 mL蒸餾水, 超聲破碎20 min, 然后8 000 r/min 4 °C下離心10 min, 去掉沉淀, 保留上清液。按照水︰乙醚︰石油醚=3︰1︰2的比例加入乙醚和石油醚, 并在20 °C下浸提粗脂5 h。浸提后取上層有機層, 使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60 °C下蒸發(fā)有機溶劑, 蒸發(fā)完全后于95 °C干燥2 h烘干多余的水分, 冷卻后稱量得到粗脂干重。

1.4.6 蛋白質(zhì)含量的測定 采用考馬斯亮藍G-250法測定微藻蛋白質(zhì)的含量(趙英永等, 2006), 試劑盒購買自Sigma公司(美國Sigma-Aldrich)。每次取樣時取40 mL藻液, 經(jīng)1.2 μm孔徑的微孔濾膜過濾后收集藻泥, 并放入-21 °C的冰箱中使藻泥完全冷凍, 然后放入40 °C的溫水浴15 min使藻泥融化, 重復(fù)凍融步驟3次使細胞破碎。在藻泥中加入3 mL磷酸緩沖液, 超聲破碎細胞20 min。隨后在4 °C下6 000 r/min離心10 min, 取1 mL上清液, 加入5 mL考馬斯亮藍后混勻。以蒸餾水組作為空白標零, 在595 nm處測定吸光度, 并利用標準曲線算出待測藻液蛋白質(zhì)的含量。

1.4.7 多糖含量的測定 采用硫酸-苯酚法測定微藻的多糖含量(孟迎迎等, 2017)。每次取樣時取藻液40 mL, 經(jīng)1.2 μm孔徑的微孔濾膜過濾后收集藻泥, 并放于-20 °C的冰箱中使藻泥完全冷凍, 然后放入40 °C的溫水浴15 min使藻泥融化, 重復(fù)以上凍融步驟3次使細胞破碎。在藻泥中加入3 mL磷酸緩沖液, 超聲破碎細胞20 min。隨后在4 °C下6 000 r/min離心10 min, 取1 mL上清液, 按照待測液︰苯酚︰濃硫酸=1︰1︰5的比例加入苯酚和濃硫酸, 混勻后靜置20 min; 取1 mL蒸餾水加入苯酚和濃硫酸, 混勻后靜置20 min作為蒸餾水組。待反應(yīng)完全后用蒸餾水組標零, 在490 nm處測定吸光度, 并利用標準曲線算出待測藻液蛋多糖的含量。

1.4.8 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析 使用IBM SPSS Statistics 25 (美國 SPSS公司)軟件對實驗中所有的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-way ANOVA), 檢驗處理組和對照組差異的顯著性。數(shù)據(jù)首先進行方差齊性檢驗, 數(shù)據(jù)等方差時使用LSD (Least Significant Difference, 最小顯著性差異法)分析和S-N-K (Student Newman Keuls)檢驗, 不等方差時使用塔姆黑尼T2檢驗差異顯著性, 顯著性水平設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度環(huán)烷酸對微藻種群增長的影響

如圖1a所示, 萊茵衣藻在48～72 h, 0.5～2 mg/L環(huán)烷酸脅迫組細胞密度明顯高于對照組 (<0.05); 8和16 mg/L環(huán)烷酸脅迫組細胞密度均低于對照組, 差異極顯著(<0.01)。在96 h, 8和16 mg/L環(huán)烷酸脅迫組細胞密度低于對照組, 差異極顯著(<0.01)。如圖1b所示, 小球藻在24～72 h, 0.5～4 mg/L環(huán)烷酸脅迫組細胞密度明顯高于對照組, 差異顯著(<0.05)。72～96 h, 8～16 mg/L環(huán)烷酸脅迫組細胞密度明顯低于對照組, 差異極顯著(<0.01)。如圖1c所示, 根據(jù)環(huán)烷酸對兩種微藻的種群抑制率結(jié)果, 低濃度劑量處理下(0.5～4 mg/L), 環(huán)烷酸能夠刺激兩種微藻的種群增長; 高濃度劑量處理下(8～16mg/L), 環(huán)烷酸則對兩種微藻表現(xiàn)出明顯的抑制效應(yīng)。

圖1 萊茵衣藻(a)和小球藻(b)在不同濃度劑量環(huán)烷酸脅迫下, 不同受試時間的生長曲線; 不同濃度環(huán)烷酸處理96 h下兩種微藻的種群抑制率(c)

2.2 不同濃度環(huán)烷酸對微藻葉綠素含量的影響

圖2描述了不同環(huán)烷酸濃度劑量脅迫下兩種微藻葉綠素含量隨著受試時間的變化。如圖2a所示, 與對照組相比, 24～96 h內(nèi)高濃度環(huán)烷酸 (8～16 mg/L)處理組萊茵衣藻的葉綠素含量顯著降低(<0.01), 且隨著時間的變化色素含量持續(xù)降低。96 h下, 萊茵衣藻色素含量呈現(xiàn)出劑量效應(yīng): 0.5～16 mg/L內(nèi), 環(huán)烷酸濃度越高, 對萊茵衣藻色素含量的呈現(xiàn)出越強的抑制趨勢。24～96 h內(nèi)高濃度環(huán)烷酸(8～16 mg/L)處理組小球藻的葉綠素含量表現(xiàn)出與萊茵衣藻相同的變化趨勢(圖2b), 均抑制了小球藻的葉綠素含量, 其中72和96 h與對照組相比差異極顯著(<0.01)。環(huán)烷酸濃度為0.5～4 mg/L的處理組對小球藻的葉綠素含量具有一定的促進作用, 其中48 h葉綠素的含量與對照組相比差異顯著(<0.05)。

圖2 不同環(huán)烷酸濃度劑量脅迫下萊茵衣藻(a)和小球藻(b)葉綠素a含量隨著受試時間的變化

注: **代表< 0.01(差異極顯著), *代表< 0.05(差異顯著)

2.3 不同濃度環(huán)烷酸對微藻SOD活性的影響

圖3描述了不同劑量的環(huán)烷酸脅迫下兩種微藻抗氧化酶活性的變化, 其中圖3a, 3b描述了兩種微藻SOD酶活力的變化; 圖3c, 3d描述了兩種微藻CAT酶活力的變化。如圖3a所示, 在24 h環(huán)烷酸暴露初期, 濃度為2～8 mg/L的環(huán)烷酸處理組萊茵衣藻的SOD活性呈現(xiàn)上升趨勢, 與對照組相比差異顯著(<0.05), 2 mg/L處理組表現(xiàn)出極顯著差異(<0.01)。隨著時間的推移, 濃度為2～4 mg/L的環(huán)烷酸處理組萊茵衣藻的SOD值明顯高于處理組, 差異極顯著(<0.01)。96 h下, 2～4 mg/L的環(huán)烷酸處理組萊茵衣藻的活性呈現(xiàn)上升趨勢, 8和16 mg/L的環(huán)烷酸處理組萊茵衣藻SOD活性呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(<0.01)。如圖3b所示, 與萊茵衣藻相同, 環(huán)烷酸在24 h暴露初期刺激小球藻的SOD活性, 其中8 mg/L處理組的小球藻SOD活性和對照相比顯著升高(<0.05)。在48 h下, 不同濃度的環(huán)烷酸對小球藻表現(xiàn)出顯著的刺激效應(yīng), 和對照組相比, 2和4 mg/L處理組小球藻的SOD活性顯著升高(<0.05); 8 mg/L和16 mg/L處理組小球藻的SOD活性極顯著升高(<0.01)。在環(huán)烷酸暴露的后期, 72和96 h內(nèi), 2和4 mg/L環(huán)烷酸對小球藻SOD活性的刺激效應(yīng)逐漸減弱, 而在96 h下高濃度環(huán)烷酸(8和16 mg/L)處理對小球藻SOD活性表現(xiàn)出顯著的抑制效應(yīng)(<0.01)。

如圖3c和圖3d所示, 24～96 h低濃度環(huán)烷酸處理(0.5～4 mg/L)和高濃度環(huán)烷酸處理(8和16 mg/L)下萊茵衣藻和小球藻的CAT酶活力與SOD酶活力的變化基本趨勢一致。96 h下低濃度處理組(2和4 mg/L)萊茵衣藻的CAT酶活性顯著高于空白對照組, 高濃度環(huán)烷酸處理組(8和16 mg/L)萊茵衣藻和小球藻的CAT酶活性顯著低于空白對照組。

2.4 不同濃度環(huán)烷酸對微藻活性氧陽性率的影響

圖4描述了不同濃度的環(huán)烷酸脅迫下兩種微藻ROS陽性率的變化。如圖4a所示, 2 mg/L和4 mg/L環(huán)烷酸處理下在24 h和48 h會降低萊茵衣藻ROS的陽性率, 72 h 和96 h不會顯著影響萊茵衣藻的ROS陽性率。8和16 mg/L環(huán)烷酸處理下在24～96 h均會造成萊茵衣藻的ROS陽性率顯著上升(<0.05),

其中48 h和96 h下兩種濃度處理組的萊茵衣藻的ROS陽性率表現(xiàn)為極顯著上升(<0.01)。如圖4b所示, 0～96 h, 0.5～4 mg/L環(huán)烷酸對小球藻的ROS陽性率沒有顯著變化。8和16 mg/L環(huán)烷酸處理下在24～48 h造成小球藻ROS陽性率的下降, 其中8 mg/L處理組的小球藻ROS陽性率和對照組相比表現(xiàn)出顯著下降(<0.05); 8和16 mg/L環(huán)烷酸處理在72和96 h造成小球藻ROS陽性率逐漸上升, 96 h兩種濃度處理下小球藻ROS陽性率和對照組相比極顯著上升(<0.01)。

圖3 不同濃度環(huán)烷酸劑量脅迫下萊茵衣藻(a, c)、小球藻(b, d)抗氧化酶的活性在不同時間下的變化

注: **代表< 0.01(差異極顯著), *代表< 0.05(差異顯著)

圖4 不同濃度環(huán)烷酸劑量脅迫下萊茵衣藻(a)、小球藻(b)的ROS陽性率在不同時間下的變化

注: **代表< 0.01(差異極顯著), *代表< 0.05(差異顯著)

2.5 不同濃度環(huán)烷酸對微藻粗脂含量的影響

處理濃度為0.5～4 mg/L的環(huán)烷酸在24～48 h對萊茵衣藻的粗脂含量表現(xiàn)出抑制作用, 其中48 h下0.5 mg/L和2 mg/L處理組和對照組相比表現(xiàn)出顯著差異(<0.05); 在72～96 h對萊茵衣藻的粗質(zhì)含量表現(xiàn)出刺激效應(yīng), 96 h下0.5～4 mg/L的環(huán)烷酸處理組萊茵衣藻的粗脂含量極顯著高于對照組(<0.01)。8 mg/L的環(huán)烷酸在24 h顯著刺激萊茵衣藻粗脂的含量(<0.05), 在72 h和96 h對萊茵衣藻的粗脂含量則表現(xiàn)出抑制效應(yīng)(<0.05)。16 mg/L的環(huán)烷酸在24～ 96 h對萊茵衣藻的粗質(zhì)含量均表現(xiàn)出顯著的抑制效應(yīng)(<0.01)。圖5b描述了不同濃度的環(huán)烷酸處理對小球藻粗脂含量的影響, 不同濃度環(huán)烷酸處理組小球藻的粗脂含量與萊茵衣藻表現(xiàn)出了相同的變化趨勢。不同的是4 mg/L的環(huán)烷酸處理下在24 h和96 h對小球藻粗脂含量表現(xiàn)出刺激效應(yīng)(<0.05)。

2.6 不同濃度環(huán)烷酸對微藻蛋白質(zhì)含量的影響

如圖6a所示, 在24 h環(huán)烷酸暴露初期, 濃度為8 和16 mg/L環(huán)烷酸處理組的萊茵衣藻的蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)上升趨勢, 和對照組相比差異極顯著(<0.01)。暴露48 h后, 濃度為0.5～16 mg/L的環(huán)烷酸表現(xiàn)出刺激萊茵衣藻蛋白質(zhì)含量的趨勢, 其中2 mg/L處理組表現(xiàn)為顯著差異(<0.01), 4～16 mg/L處理組表現(xiàn)為極顯著差異(<0.05)。隨著時間的增加, 在96 h下, 各個處理組的萊茵衣藻蛋白質(zhì)的含量呈現(xiàn)出下降的趨勢, 和對照相比差異極顯著(<0.01)。如圖6b所示, 24 h下, 2、8和16 mg/L環(huán)烷酸處理會刺激小球藻蛋白質(zhì)的含量(<0.05)。而在48～96 h, 所有濃度的環(huán)烷酸處理均會抑制小球藻的蛋白質(zhì)的含量, 其中8 mg/L環(huán)烷酸處理組的小球藻在72和96 h的蛋白質(zhì)含量顯著低于對照組(<0.05), 48 h下蛋白質(zhì)含量極顯著降低(<0.01); 16 mg/L的環(huán)烷酸處理組的小球藻在48～96 h蛋白質(zhì)含量顯著低于對照組(<0.01)。

圖5 不同劑量濃度環(huán)烷酸脅迫下萊茵衣藻(a)、小球藻(b)粗脂含量在不同時間下的影響

注: ** 代表< 0.01(差異極顯著), *代表< 0.05(差異顯著)

圖6 不同劑量濃度環(huán)烷酸脅迫下萊茵衣藻(a)、小球藻(b)蛋白質(zhì)含量在不同時間下的影響

注: ** 代表< 0.01(差異極顯著), *代表< 0.05(差異顯著)

2.7 不同濃度環(huán)烷酸對微藻多糖含量的影響

圖7描述了不同濃度環(huán)烷酸脅迫下, 兩種微藻多糖含量的變化。如圖7a所示, 8 mg/L環(huán)烷酸在24～96 h對萊茵衣藻多糖含量表現(xiàn)出刺激效應(yīng), 其中24 h和96 h表現(xiàn)為顯著刺激(<0.05), 72 h表現(xiàn)為極顯著刺激(<0.01)。16 mg/L環(huán)烷酸在24～96 h對萊茵衣藻多糖含量表現(xiàn)出極顯著的刺激效應(yīng)(<0.01)。0.5～ 4 mg/L環(huán)烷酸在24～96 h不會顯著影響萊茵衣藻多糖的含量。不同濃度環(huán)烷酸在24 h會刺激小球藻多糖含量, 2和8 mg/L處理組表現(xiàn)為顯著刺激(<0.05), 4和16 mg/L處理組表現(xiàn)為極顯著刺激(<0.01)。48 h下8和16 mg/L環(huán)烷酸處理會極顯著刺激小球藻多糖含量(<0.01)。在72～96 h不同濃度環(huán)烷酸對小球藻多糖含量無顯著變化, 但2 mg/L環(huán)烷酸處理在96 h顯著刺激小球藻多糖含量(<0.01)。

圖7 不同劑量濃度環(huán)烷酸脅迫下萊茵衣藻(a)、小球藻(b)多糖含量在不同時間下的影響

注: ** 代表< 0.01(差異極顯著), *代表< 0.05(差異顯著)

3 討論

本研究根據(jù)環(huán)境濃度設(shè)置了實驗濃度為0.5、2、4、8和16 mg/L的環(huán)烷酸處理組, 發(fā)現(xiàn)0～96 h所有劑量的環(huán)烷酸均對萊茵衣藻和小球藻的種群增長和生理生化特征造成了一定的影響。在96 h下, 不同濃度環(huán)烷酸脅迫下兩種淡水微藻均表現(xiàn)出了高度一致的毒性效應(yīng): 96 h內(nèi)低濃度環(huán)烷酸脅迫(0.5～4 mg/L)對淡水微藻造成持續(xù)的毒性興奮效應(yīng), 刺激了微藻種群的增長; 96 h下高濃度環(huán)烷酸脅迫(8～16 mg/L)會對淡水微藻造成急性毒性效應(yīng), 抑制種群增長。研究結(jié)果表明環(huán)烷酸對淡水微藻的種群及生理過程具有明顯的劑量和時間效應(yīng), 高酸原油污染能對水生生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定造成潛在威脅, 因此, 環(huán)烷酸應(yīng)作為高酸石油泄漏風(fēng)險區(qū)的重點監(jiān)測對象。

伴隨著實驗濃度的增加, 環(huán)烷酸對淡水微藻的抑制效應(yīng)也相應(yīng)地增加。8和16 mg/L環(huán)烷酸處理組中萊茵衣藻和小球藻的種群增長幾乎停滯。在溢油事故區(qū)或原油開采區(qū)環(huán)烷酸的濃度為10～60 mg/L (Clemente, 2005; Vander, 2021), 遠高于實驗設(shè)置的濃度, 說明石油污染事故中, 環(huán)烷酸是造成生態(tài)破壞的重要組分之一。在低濃度環(huán)烷酸處理組中(0.5、2和4 mg/L), 環(huán)烷酸可以促進萊茵衣藻和小球藻的種群生長, 這種低濃度、短時間引起生物體產(chǎn)生刺激性的毒性效應(yīng), 被稱為毒物興奮效應(yīng)(Calabrese, 1999)。這種反應(yīng)主要根據(jù)生物體內(nèi)自身的毒物適應(yīng)機制所決定, 一般表現(xiàn)在低濃度毒物刺激下造成生物體某些生理生化過程過度表達, 并對其生長發(fā)育起到積極的作用。歐曉明等(2003)發(fā)現(xiàn)較低濃度(1 mg/L)的新型除草劑HNPC-C9908作用于小球藻時表現(xiàn)出明顯的生長刺激作用, 而高濃度(>25 mg/L)則使藻細胞生長緩慢, 細胞葉綠體解體。低濃度的多溴聯(lián)苯醚處理海水小球藻(0.1～3 μg/L)、牟氏角毛藻(0.1～5 μg/L)和赤潮異彎藻(0.1～1 μg/L)對藻體生長具有短暫的促進作用(李卓娜, 2009)。溢油事故中, 環(huán)烷酸經(jīng)過長期的稀釋降解后, 由高濃度抑制效應(yīng)轉(zhuǎn)為低濃度刺激效應(yīng), 可能導(dǎo)致溢油后藻華頻繁的爆發(fā)(周利等, 2013)。

不同濃度環(huán)烷酸處理對兩種淡水微藻的生理生化特征的影響與種群密度的影響一致, 低濃度環(huán)烷酸下(0.5、2和4 mg/L)在96 h對兩種淡水微藻表現(xiàn)出促進脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等物質(zhì)積累的趨勢; 高濃度環(huán)烷酸處理下(8～16 mg/L)在96 h對萊茵衣藻和小球藻則表現(xiàn)出抑制效應(yīng), 葉綠素的含量和脂質(zhì)的含量下降而多糖含量上升。葉綠素是植物體內(nèi)重要的捕光色素, 其含量可以直接影響光合效率。蔡卓平(2009)在研究微藻的毒性興奮效應(yīng)時發(fā)現(xiàn)低濃度有機磷農(nóng)藥會刺激微藻體內(nèi)的葉綠素含量升高, 提高植物的固碳效率并刺激蛋白質(zhì)的合成轉(zhuǎn)運, 進而使得藻細胞生長旺盛、分裂速度加快。不同濃度的環(huán)烷酸在96 h內(nèi)通過抑制或者促進淡水微藻體內(nèi)葉綠素的含量上升, 影響淡水微藻光合固碳的能力, 進而影響種群增長速率。低濃度環(huán)烷酸脅迫會刺激葉綠素的含量增加從而加強光合固碳效率, 而高濃度環(huán)烷酸脅迫則會抑制葉綠素的含量, 降低光合固碳的效率。光合效率在脂質(zhì)合成中也發(fā)揮了重要的作用。脂質(zhì)是高度還原的化合物, 合成時需要大量光合作用中的產(chǎn)物還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)作為還原劑(Li-Beisson, 2019)。低濃度環(huán)烷酸刺激淡水微藻的光合效率上升, 產(chǎn)生大量的NADPH和三磷酸腺苷(ATP)可用于葉綠體中脂質(zhì)的合成, 導(dǎo)致脂質(zhì)過量積累。但是高濃度環(huán)烷酸刺激下, 光合作用受到抑制, NADPH等光合作用中間產(chǎn)物含量下降, 導(dǎo)致脂質(zhì)合成受阻。在高濃高度環(huán)烷酸脅迫下, 微藻細胞的ROS陽性率上升, 細胞受到嚴重的氧化損傷, 細胞也可能通過減少脂質(zhì)的合成以對抗氧化損傷。研究表明由于脂質(zhì)是高度還原的化合物, 機體內(nèi)過多的ROS會介導(dǎo)脂質(zhì)的氧化, 形成丙二醛等脂質(zhì)過氧化物對細胞造成嚴重損傷, 因此當藻類細胞受到嚴重的氧化應(yīng)激時, 細胞內(nèi)會協(xié)調(diào)脂質(zhì)儲存在塑球蛋白中并從葉綠體運往胞質(zhì)進行降解等行為以減少胞內(nèi)脂質(zhì)的含量(Xu, 2020)。在環(huán)烷酸的脅迫下, 兩種淡水微藻多糖的含量在高濃度環(huán)烷酸刺激下顯著上升, 說明多糖類物質(zhì)在淡水微藻適應(yīng)環(huán)烷酸脅迫時發(fā)揮了重要的作用。淀粉性多糖是植物體重要的儲能物質(zhì)。和脂質(zhì)相比, 多糖類物質(zhì)沒有還原性, 且合成時不需要大量的NADPH提供還原力,可能是淡水微藻應(yīng)對高濃度環(huán)烷酸時主要的儲能物質(zhì)。同時, 功能性多糖的增加可以幫助淡水微藻調(diào)節(jié)胞內(nèi)滲透壓、提高抗氧化活性從而適應(yīng)高濃度環(huán)烷酸的脅迫?？扇苄远嗵鞘侵参矬w內(nèi)進行滲透調(diào)節(jié)的重要物質(zhì), 并具有清除植物體內(nèi)ROS、激活抗氧化酶活性的作用(張露, 2020)。研究表明慈姑多糖、枸杞多糖等多糖類物質(zhì)具有抗氧化活性和抑制細胞凋亡等作用, 在面對金屬離子脅迫和抵抗細菌污染等發(fā)揮了重要的作用 (Liu, 2022a, 2022b)。因此多糖類物質(zhì)在儲能和抗氧化活性上對淡水微藻適應(yīng)高濃度環(huán)烷酸脅迫都可能發(fā)揮了重要的作用。

所有環(huán)烷酸處理組中, 兩種海洋微藻都表現(xiàn)出了顯著的氧化應(yīng)激效應(yīng)。低濃度環(huán)烷酸處理組(0.5、2和4 mg/L)的萊茵衣藻和小球藻SOD和CAT酶活性顯著上升, ROS水平維持在相對穩(wěn)定的狀態(tài), 說明抗氧化酶在微藻體內(nèi)對環(huán)烷酸造成的氧化損傷發(fā)揮了積極的作用。高濃度環(huán)烷酸處理組(8～16 mg/L)的萊茵衣藻和小球藻SOD和CAT活性顯著降低且ROS含量上升, 說明高濃度環(huán)烷酸會對淡水微藻造成嚴重的氧化損傷并破壞微藻體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng), 對微藻造成不可恢復(fù)的氧化損傷。在適應(yīng)環(huán)烷酸造成的氧化脅迫時, 萊茵衣藻和小球藻的抗氧化酶酶活表現(xiàn)出了種屬差異, 小球藻SOD和CAT活性的增加幅度顯著低于萊茵衣藻; 低濃度環(huán)烷酸脅迫下, 小球藻表現(xiàn)出了更穩(wěn)定的ROS水平說明小球藻比萊茵衣藻更容易適應(yīng)環(huán)烷酸造成的氧化損傷。SOD和CAT是生物體抗氧化機制的中心酶之一, SOD和CAT活性的增加表示氧化損傷的增加, 幾乎所有的氧化脅迫都可以誘導(dǎo)SOD活性的顯著增加(楊國遠等, 2012)。在石油中其他的多環(huán)芳烴的研究中同樣發(fā)現(xiàn): 低濃度刺激微藻生長時, 會造成氧化應(yīng)激反應(yīng); 高濃度抑制反應(yīng)時, 造成氧化損傷(洪有為等, 2008), 與本實驗結(jié)果一致。

盡管96 h下高濃度處理組的萊茵衣藻和小球藻的各項生理指標都表現(xiàn)出抑制效應(yīng), 但是通過不同時間下的生理指標可以發(fā)現(xiàn): 8 mg/L處理組的萊茵衣藻和小球藻的SOD活性、CAT活性、粗脂含量和蛋白質(zhì)含量, 16 mg/L處理組的萊茵衣藻和小球藻蛋白質(zhì)含量在暴露初期都表現(xiàn)出了刺激效應(yīng)。這說明高濃度環(huán)烷酸對微藻的毒性抑制具有時間效應(yīng)。高濃度環(huán)烷酸暴露的初期, 萊茵衣藻和小球藻的抗氧化系統(tǒng)和脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等也會受到毒性興奮效應(yīng), 積極抵御環(huán)烷酸造成的氧化損傷。但是隨著暴露時間的推移, 高濃度環(huán)烷酸造成的毒性逐漸增強, ROS含量升高, 導(dǎo)致兩種微藻抗氧化系統(tǒng)被破壞, 并進一步造成種群抑制的現(xiàn)象。

4 結(jié)論

低濃度的環(huán)烷酸(0.5～4 mg/L)會造成淡水微藻96 h持續(xù)的毒物興奮效應(yīng), 刺激種群增長; 高濃度的環(huán)烷酸(8～16 mg/L)會造成淡水微藻急性毒性效應(yīng), 抑制種群生長。不同濃度的環(huán)烷酸脅迫均會影響淡水微藻的生理活性。低濃度環(huán)烷酸處理會刺激淡水微藻的葉綠素含量積累, 導(dǎo)致光合效率升高, 脂質(zhì)積累量上升, 有利于種群增長。高濃度環(huán)烷酸處理會抑制葉綠素的含量并受到急性的過氧化損傷, 導(dǎo)致脂質(zhì)含量下降, 并積累多糖類物質(zhì)用于儲能和抵抗環(huán)烷酸脅迫。環(huán)烷酸會對淡水微藻造成氧化損傷, 造成ROS含量上升, 且兩種微藻的抗氧化酶SOD和CAT對環(huán)烷酸處理具有種屬差異。研究還發(fā)現(xiàn)高濃度環(huán)烷酸對淡水微藻的急性損傷具有時間效應(yīng), 毒性隨著脅迫時間的延長而逐漸增強。綜上, 本研究發(fā)現(xiàn)低濃度環(huán)烷酸對浮游植物具有興奮效應(yīng); 高濃度環(huán)烷酸對浮游植物具有時間依賴的急性毒性效應(yīng), 原因可能是環(huán)烷酸劑量影響了淡水微藻的能量存儲方式。

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EFFECT OF NAPHTHENIC ACID ON PHYSIOLOGICAL AND BIOCHEMICAL CHARACTERISTICS OF FRESHWATER MICROALGAE

LIN Zhi-Hao1, ZHANG Huan-Xin2, TANG Xue-Xi1, 3, WANG Ying1, 3

(1. College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. College of Geography and Environment, Shandong Normal University, Jinan 250014, China; 3. Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, China)

Two models of freshwater microalgae,and, were continuously cultured for 96 h under different concentrations of naphthenic acids (NAs). The effects of NAs stress on the population and physiological and biochemical characteristics of two freshwater microalgae were studied. Results show that low concentrations of NAs (0.5～4 mg/L) stimulated the population growth of microalgae, while high concentrations of NAs (8～16 mg/L) inhibited the population of microalgae growth, causing acute toxic damage. Treatment of NAs could change the physiological activity of microalgae. In low-concentration NAs treatment, content of chlorophyllin the two microalgae increased and lipids accumulated, and in the treatment with high concentration of NAs, the content of chlorophyllin the two microalgae decreased and the content of polysaccharide increased. Both microalgae were subjected to oxidative damage under NAs stress, causing an increase in reactive oxygen species (ROS) content; and two microalgal antioxidant enzymes, i.e., superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) showed species-specific differences in the response to NAs treatment. In addition, high concentrations of NAs had a time effect on the acute injury of freshwater microalgae, and the toxicity gradually increased with the increase of experimental duration. Therefore, low concentrations of NAs have stimulant effects on microalgae and high concentrations of NAs have time-dependent acute toxic effects on microalgae growth. This study provided a data-support for the risk assessment of NAs pollution in freshwater environments.

Naphthenic acid; freshwater microalgae; population dynamics; biochemical characteristics; antioxidant enzyme activity; stimulant effect

X55

10.11693/hyhz20220400096

*國家自然科學(xué)基金, 41976132號, 61902368號, 42176204號; 中央高校基本科研專項資金, 201964025號; 國家自然科學(xué)基金-山東省聯(lián)合基金, U1606404號。林治豪, 碩士研究生, E-mail: linzhihao@stu.ouc.edu.cn

王 影, 碩士生導(dǎo)師, 副教授, E-mail: ywang@ouc.edu.cn

2022-04-13,

2022-05-27