綠藻光合產(chǎn)氫的研究進(jìn)展

張亞琴，唐?？担R為民，熊威，徐旭榮

綠藻光合產(chǎn)氫的研究進(jìn)展

張亞琴1，2，唐?？?，2，馬為民3，熊威4，徐旭榮2*

（1.浙江大學(xué) 化學(xué)系，浙江 杭州 310027； 2.浙江大學(xué) 求是高等研究院，浙江 杭州 310027； 3.上海師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200234； 4.南昌大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，江西 南昌 330031）

綠藻光合產(chǎn)氫具有能量轉(zhuǎn)化效率高、環(huán)境友好、原料豐富等優(yōu)勢，在太陽能利用和氫能生產(chǎn)方面具有光明的應(yīng)用前景。從綠藻光合產(chǎn)氫的生物學(xué)機(jī)理出發(fā)，分析了限制綠藻光合產(chǎn)氫的潛在因素，總結(jié)了各類提升綠藻光合產(chǎn)氫效率的方法，并簡要評(píng)述了綠藻光合產(chǎn)氫實(shí)現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用所面臨的主要問題及發(fā)展趨勢，為未來綠藻光合產(chǎn)氫的大規(guī)模應(yīng)用提供參考。

綠藻；光合產(chǎn)氫；氫化酶；氧敏感性；電子源

0　引言

近年來，過度利用化石能源導(dǎo)致溫室效應(yīng)、空氣污染等環(huán)境問題［1］，開發(fā)安全的綠色能源以取代化石燃料顯得尤為重要。太陽能具有清潔、廣泛、可再生等優(yōu)勢，是實(shí)現(xiàn)碳達(dá)峰、碳中和目標(biāo)，構(gòu)建安全高效能源體系的重要組成部分［2］。為了克服太陽能的間歇性、能量密度低等缺陷，人類利用各種技術(shù)將太陽能轉(zhuǎn)化為通用能源，包括熱能、電能、生物質(zhì)燃料和氫能（H2）［3］。其中，氫能具有易儲(chǔ)存、能量密度高、應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)［4-6］，是未來可持續(xù)能源系統(tǒng)中利用和儲(chǔ)存太陽能的理想載體［7］。其中，綠藻光合產(chǎn)氫將［FeFe］-氫化酶作為催化劑，直接以水為電子供體，利用太陽能合成氫能，是一種理想的氫能綠色生產(chǎn)方法［8］。

GAFFRON等［9］最早發(fā)現(xiàn)了綠藻的光合產(chǎn)氫現(xiàn)象。綠藻中的［FeFe］-氫化酶的催化活性很高，具備優(yōu)異的產(chǎn)氫潛力。然而自然界中綠藻的光合產(chǎn)氫過程十分短暫，僅發(fā)生在綠藻光暗交替的幾分鐘［9］。這是因?yàn)榫G藻在光照下會(huì)釋放氧氣（O2），一定濃度的O2會(huì)抑制氫化酶的活性，導(dǎo)致產(chǎn)氫過程停止。因此，規(guī)避綠藻中氫化酶的氧敏感性，是目前提升綠藻光合產(chǎn)氫效率的重點(diǎn)研究方向之一。此外，保證充足的電子源、高效利用光系統(tǒng)產(chǎn)生的光合電子等也是提升綠藻光合產(chǎn)氫效率的重要因素。本文擬闡述綠藻光合產(chǎn)氫的研究進(jìn)展：首先重點(diǎn)分析限制綠藻光合產(chǎn)氫的氫化酶、電子競爭、環(huán)境條件等因素，然后總結(jié)各類提升綠藻光合產(chǎn)氫效率的方法，最后簡要評(píng)述綠藻光合產(chǎn)氫實(shí)現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用所面臨的主要問題及發(fā)展趨勢。

1　綠藻光合產(chǎn)氫途徑及其限制因素

1.1　綠藻光合產(chǎn)氫途徑

綠藻中2種與光合產(chǎn)氫有關(guān)的電子傳遞途徑均需在光照條件下進(jìn)行［10］。第1種是依賴光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）的直接生物光解途徑。電子來源于PSⅡ中發(fā)生的水氧化反應(yīng)，該反應(yīng)包括PSⅡ吸收光量子的能量，將水分子電解，產(chǎn)生O2、電子（e-）和氫離子（H+）。電子傳遞過程需要2個(gè)光系統(tǒng)的參與（圖1（a）途徑1），PSⅡ產(chǎn)生的e-通過電子傳遞鏈傳遞，依次經(jīng)過PSⅡ、質(zhì)體醌（PQ）、Cyt6復(fù)合體，由光系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ）傳遞至鐵氧還原蛋白（Fd），還原NADP+。同時(shí)此過程中產(chǎn)生的跨類囊體膜質(zhì)子梯度（?pH）可驅(qū)動(dòng)三磷酸腺苷（ATP）合成酶合成ATP，這樣的電子傳遞方式稱為線性電子傳遞鏈（LET）。Fd是光合系統(tǒng)的最終電子中介，將電子分配給不同的代謝途徑［11］。在厭氧條件下，一部分e-可由Fd傳遞至［FeFe］-氫化酶，在氫化酶的催化作用下與H+重組為H2［12］。

第2種是間接生物光解途徑，電子來自細(xì)胞內(nèi)有機(jī)物的氧化，而非PSⅡ。在NAD（P）H氧化還原酶作用下，葉綠體內(nèi)的NAD（P）H脫氫變?yōu)镹AD（P）+，釋放出的電子直接進(jìn)入PQ，再進(jìn)入電子傳遞鏈，經(jīng)過PSⅠ，最后由Fd傳遞至氫化酶進(jìn)行產(chǎn)氫［13］（圖1（a）途徑2）。

此外，萊茵衣藻中還存在第3種不依賴光的發(fā)酵產(chǎn)氫途徑，電子來自綠藻在暗發(fā)酵條件下淀粉的分解代謝［14］，類似于廣譜厭氧和兼性厭氧細(xì)菌的異源發(fā)酵（圖1（b）途徑3）。在此過程中，淀粉被淀粉酶分解產(chǎn)生糖，然后通過糖酵解轉(zhuǎn)化為丙酮酸。丙酮酸是萊茵衣藻發(fā)酵過程的底物，通過不同的代謝途徑得到各種產(chǎn)物，例如有機(jī)酸、乙醇（C2H5OH）、二氧化碳（CO2）和H2［15］。與依賴光的途徑相比，不依賴光的發(fā)酵途徑其產(chǎn)氫效率較低［16］。

圖1　綠藻產(chǎn)氫途徑示意［12］

1.2　限制因素

雖然綠藻光合產(chǎn)氫的潛在能量轉(zhuǎn)換效率理論值很高（約10%），但實(shí)際受限于多種因素，包括：（1）氫化酶的氧抑制，O2不僅會(huì)抑制氫化酶的活性，還會(huì)抑制氫化酶相關(guān)基因的表達(dá)和成熟因子；（2）碳同化等多種電子競爭途徑；（3）環(huán)境條件的限制。

1.2.1氫化酶的氧抑制

綠藻中［FeFe］-氫化酶的活性很高，約為其他氫化酶的100倍，并且太陽能的轉(zhuǎn)化效率相對(duì)較高（12%～14%）［10，17］。H-團(tuán)簇是［FeFe］-氫化酶獨(dú)特的活性中心，由一個(gè)［2Fe-2S］核心、硫橋和［4Fe-4S］簇組成［18-19］。［4Fe-4S］簇可以為［2Fe-2S］核心提供e-，［2Fe-2S］核心中的活性位點(diǎn)Fe原子捕獲H+后，可將H+還原為H2。［2Fe］中心的每個(gè)Fe原子分別與2個(gè)雙原子非蛋白配體CO—和CN—相連，2個(gè)鐵原子通過CO—配體連接［20-21］。由于CO—和CN—配體對(duì)O2敏感，H-團(tuán)簇的活性很容易被O2抑制［22］。如圖2所示，O2與Fe原子活性位點(diǎn)結(jié)合，形成活性氧（ROS）。ROS可以直接氧化［4Fe-4S］簇，也可以使［4Fe-4S］簇發(fā)生鍵電子轉(zhuǎn)移，從而發(fā)揮破壞性作用。

綠藻氫化酶的結(jié)構(gòu)基因通常由幾個(gè)同源基因組成，例如萊茵衣藻的1和2基因，分別編碼2種結(jié)構(gòu)相似的酶，目前相關(guān)的研究主要集中于1基因，因其酶活性顯著高于2基因。MEUSER等［16］報(bào)道，在光照條件下萊茵衣藻約75%的H2由1催化得到。此外，［FeFe］-氫化酶的成熟還需同時(shí)表達(dá)和等基因，和是氫化酶輔酶蛋白的基因，主要負(fù)責(zé)H-團(tuán)簇的合成和組裝。O2不僅會(huì)破壞［FeFe］-氫化酶的活性，還會(huì)通過抑制基因的表達(dá)和成熟來抑制綠藻的氫化酶活性［18， 21， 23］。

圖2　CO、O2與H-團(tuán)簇的氧化態(tài)（Hox）的反應(yīng)模型示意［22］

1.2.2電子競爭

對(duì)綠藻而言，氫化酶可替代電子受體消除多余的還原當(dāng)量，起到保護(hù)細(xì)胞的安全閥作用［24］。一般情況下，只有較少的電子被傳遞給氫化酶產(chǎn)氫，其他代謝途徑競爭了大部分的電子。與氫化酶競爭電子的主要途徑是碳同化過程。在光合作用過程中，PSⅡ產(chǎn)生的大部分電子被鐵氧還原蛋白-NADP+氧化還原酶（FNR）用來將NADP+還原成NADPH，NADPH與ATP共同驅(qū)動(dòng)卡爾文-本森（CBB）循環(huán)進(jìn)行碳同化。此外，F(xiàn)d還向其他途徑，如圍繞PSⅠ的環(huán)式電子傳遞（CEF）、調(diào)節(jié)碳同化作用的硫氧還原蛋白、其他葉綠體的氧化還原代謝等［25-26］提供電子。環(huán)式電子傳遞途徑由PSⅠ單獨(dú)驅(qū)動(dòng)，電子經(jīng)過PSⅠ后未被傳遞給NADP+，而是又經(jīng)Cyt6/復(fù)合體或質(zhì)體醌傳遞回到PSⅠ，傳遞過程中只產(chǎn)生用于合成ATP的跨膜質(zhì)子梯度（?pH），而不產(chǎn)生NADPH。一些研究認(rèn)為，在氫化酶被氧氣滅活之前，競爭電子途徑已終止了產(chǎn)氫過程，這些競爭電子途徑依次是碳同化、環(huán)式電子傳遞鏈和葉綠體內(nèi)其他氧化還原反應(yīng)［27-29］。

1.2.3環(huán)境因素

氫化酶的催化產(chǎn)氫過程可逆，在頂空氫氣超壓的情況下，該反應(yīng)的平衡向吸收氫的方向移動(dòng)［30］。因此在產(chǎn)氫過程中，頂空氫氣分壓也會(huì)影響產(chǎn)氫效率。研究發(fā)現(xiàn)，用氬氣（Ar）等惰性氣體不斷掃除培養(yǎng)瓶中的氣體［31-32］或采用較大頂空體積的產(chǎn)氫瓶［33］，產(chǎn)氫效率會(huì)進(jìn)一步提升。此外在對(duì)綠藻光合產(chǎn)氫培養(yǎng)條件的研究［34-37］中發(fā)現(xiàn)，光照強(qiáng)度、溫度、pH、培養(yǎng)基營養(yǎng)成分以及細(xì)胞密度和細(xì)胞年齡等均會(huì)對(duì)綠藻光合產(chǎn)氫效率產(chǎn)生較大影響。

2　提升產(chǎn)氫效率的方法

針對(duì)這些限制因素，在過去的幾十年間，人們不斷地探究提升綠藻的光合產(chǎn)氫效率的方法，并取得了重要進(jìn)展（表1）。目前，綠藻光合產(chǎn)氫的研究方向主要集中在解決氫化酶的氧抑制問題上，包括：

（1）去除綠藻產(chǎn)氫環(huán)境中的O2。例如用惰性氣體吹掃排除O2［31-32］、添加消耗O2的除氧劑［50-52］，以及利用共培養(yǎng)細(xì)菌代謝消耗O2［40］等。

（2）限制綠藻代謝過程中的O2產(chǎn)生。例如通過代謝調(diào)控手段抑制PSⅡ的活性［53-54］，使綠藻無法通過光合作用釋放O2。

（3）采用基因工程方法構(gòu)建理想的產(chǎn)氫藻株。利用基因突變篩選耐氧性的藻株［45］，構(gòu)建減少電子競爭途徑或者降低O2的突變體；通過基因改造定向修飾綠藻［48］，將耐氧性高的細(xì)菌氫化酶基因植入綠藻中表達(dá)［55］。

然而，目前綠藻的太陽能—?dú)淠苻D(zhuǎn)換效率尚低于理論值10%，綠藻光合產(chǎn)氫有很大的提升空間［43］。

表1　各種光合產(chǎn)氫方法的產(chǎn)氫量

2.1　去除培養(yǎng)基中的O2

2.1.1氣體吹掃法

最早采用惰性氣體，如氦氣（He）［56］、氮?dú)猓∟2）［57］或氬氣（Ar）［32］沖洗綠藻體系，物理去除培養(yǎng)基中的O2。GREENBAUM等［31］用氮?dú)忾g歇性地吹掃密閉光生物反應(yīng)器中的氣體，并每隔一段時(shí)間添加CO2恢復(fù)綠藻的活力，產(chǎn)氫過程持續(xù)約60 d。然而，采用惰性氣體吹掃這種物理手段去除O2并不徹底，更多被用于產(chǎn)氫的預(yù)處理厭氧階段。

2.1.2添加除氧劑

一些酶及其催化底物也經(jīng)常作為除氧劑使用。NAGY等［59］通過向培養(yǎng)物中加入葡萄糖、葡萄糖氧化酶和抗壞血酸鹽去除O2。但是為了長期維持厭氧環(huán)境，需加入高濃度的葡萄糖氧化酶和葡萄糖，這會(huì)使培養(yǎng)體系迅速轉(zhuǎn)化為酸性環(huán)境，導(dǎo)致氫化酶失活并嚴(yán)重破壞綠藻細(xì)胞活性。為解決這一問題，CHEN等［39］設(shè)計(jì)了一個(gè)由葡萄糖、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶和氫氧化鎂組成的化學(xué)酶級(jí)聯(lián)（CEC）系統(tǒng)。氫氧化鎂的添加不僅解決了高濃度葡萄糖氧化酶和高濃度葡萄糖造成的培養(yǎng)液pH下降的問題，還能持續(xù)誘導(dǎo)綠藻細(xì)胞的絮凝，有助于長期維持厭氧環(huán)境。如圖3所示，SU等［60］通過在單個(gè)細(xì)胞周圍構(gòu)建漆酶調(diào)節(jié)的厭氧層，利用蛋白核小球藻產(chǎn)氫建立了一個(gè)由多巴胺、漆酶和單寧酸組成的類似三明治厭氧層，實(shí)現(xiàn)了連續(xù)8 d產(chǎn)氫。

圖3　通過構(gòu)建漆酶調(diào)節(jié)的厭氧層，利用蛋白核小球藻產(chǎn)氫［60］

2.1.3綠藻-細(xì)菌共培養(yǎng)

“老姐姐，你也許知道我的心，十九歲守寡，守了幾十年，守這個(gè)兒子；……我那些挨餓的日子呀！我跟孩子到山坡去割茅草，大雨來了，雨從山坡把娘兒兩個(gè)拍滾下來，我的頭，在我想是碎了，誰知道？還沒死……早死早完事?！?/p>

綠藻和細(xì)菌的共培養(yǎng)可以通過細(xì)菌的呼吸作用建立厭氧條件。如圖4所示，細(xì)菌可以在消耗O2的同時(shí)產(chǎn)生乙酸（CH3COOH），從而促進(jìn)萊茵衣藻產(chǎn)氫，而藻類可以消耗乙酸的代謝物，從而有利于細(xì)菌生長，形成協(xié)同的產(chǎn)氫系統(tǒng)［40，61］。LAKATOS等［61］選用大腸桿菌和幾種不同的綠藻進(jìn)行共培養(yǎng)，探索了共培養(yǎng)過程中綠藻產(chǎn)氫的影響因素，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)氣液比為1∶1，藻細(xì)胞密度為3.96×108個(gè)·mL-1，在50 μmol·m-2·s-1光照條件下產(chǎn)氫量最高。其中sp. MACC 360組的產(chǎn)氫量達(dá)88.98±2.19 mL·L-1·d-1（表1）。

圖4　藻-菌共培養(yǎng)物（衣藻和大腸桿菌共培養(yǎng)物）的光合和發(fā)酵產(chǎn)氫原理［61］

微生物群落的不穩(wěn)定性是限制綠藻-細(xì)菌共培養(yǎng)可持續(xù)產(chǎn)氫的主要因素之一。因?yàn)榇蠖鄶?shù)細(xì)菌的增殖速度比藻類快，細(xì)菌密度可能超過藻類密度，引發(fā)培養(yǎng)環(huán)境中度酸化和營養(yǎng)物質(zhì)缺乏的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致綠藻失活和產(chǎn)氫停止。此外，綠藻-細(xì)菌共培養(yǎng)物的產(chǎn)氫效率取決于其他參數(shù)，例如細(xì)菌種類、初始藻細(xì)胞濃度和氣液體積比［62］。因此，藻菌共培養(yǎng)產(chǎn)氫需要為綠藻尋找合適的細(xì)菌伴侶以及優(yōu)化生長條件。應(yīng)用較多的有發(fā)酵細(xì)菌和光氧細(xì)菌，如大腸桿菌、紅假單胞菌、紅細(xì)菌屬、紅螺菌等［63-64］。

2.2　限制O2產(chǎn)生

2.2.1控制光照法

控制光照條件可抑制O2的釋放，誘導(dǎo)綠藻光合產(chǎn)氫。例如，利用高強(qiáng)度光（2 000 μmol·m-2·s-1）抑制萊茵衣藻的光合放氧［65］，利用特定光譜選擇性激活PSⅠ和抑制PSⅡ［66］等。KOSOUROV等［41］采用光暗交替（1 s光照/9 s黑暗）的光脈沖，保持低O2濃度，CBB循環(huán)未被激活，光合電子直接傳遞給氫化酶產(chǎn)氫，大幅提升了光合產(chǎn)氫效率。

2.2.2細(xì)胞聚集法

細(xì)胞聚集法利用藻細(xì)胞自身的呼吸作用消耗O2。XIONG等［42］構(gòu)建了一種硅材料-綠藻復(fù)合體，利用陽離子聚電解質(zhì)聚二甲基二烯丙基氯化銨（PDADMAC）的“橋聯(lián)”作用，在誘導(dǎo)小球藻仿生硅礦化的同時(shí)，將小球藻細(xì)胞聚集成一種在光照下具有產(chǎn)氫功能的聚集體，能夠以0.20 mmol·h-1·（mg chlorophyll）-1的速度至少產(chǎn)氫48 h。如圖5所示，其產(chǎn)氫機(jī)制是構(gòu)建一個(gè)空間功能化的聚集體，建立局部厭氧的環(huán)境，激活氫化酶產(chǎn)氫。暴露在外界環(huán)境的表層細(xì)胞獲得足夠的光進(jìn)行正常的光合作用，而聚集體內(nèi)部的藻類細(xì)胞由于缺乏光照，只能靠呼吸作用消耗聚集體內(nèi)的O2，實(shí)現(xiàn)凈耗氧。在此基礎(chǔ)上，SHU等［67］通過添加一定濃度的二甲基亞砜（DMSO），增強(qiáng)了小球藻的呼吸作用，進(jìn)一步降低了聚集體內(nèi)的O2含量，提高了小球藻聚集體的產(chǎn)氫量，其光合產(chǎn)氫效率從0.42%提高至0.69%。

圖5　小球藻聚集體空間功能分化產(chǎn)氫示意［42］

2.2.3代謝調(diào)控法

缺硫培養(yǎng)是應(yīng)用最廣泛的綠藻產(chǎn)氫代謝調(diào)控方法之一。WYKOFF等［68］和MELIS等［69］發(fā)現(xiàn)，去除萊茵衣藻培養(yǎng)基中的硫元素會(huì)阻礙D1蛋白生物合成，影響PSⅡ修復(fù)周期，進(jìn)而抑制PSⅡ的活性，降低綠藻細(xì)胞的放氧水平，但不會(huì)影響線粒體呼吸速率，逐漸建立厭氧環(huán)境。然而，PSⅡ的活性被抑制會(huì)使傳遞給氫化酶的光合電子逐漸減少，最終導(dǎo)致產(chǎn)氫過程停止。為了進(jìn)一步優(yōu)化缺硫培養(yǎng)產(chǎn)氫的方法，MELIS等［70］設(shè)計(jì)了缺硫培養(yǎng)產(chǎn)氫的兩階段工藝：在階段1進(jìn)行有機(jī)物的積累，用正常含硫的TAP培養(yǎng)基培養(yǎng)藻類細(xì)胞。藻類細(xì)胞通過正常的放氧光合作用進(jìn)行CBB循環(huán)，合成所需的有機(jī)物。當(dāng)有機(jī)物積累到足夠量時(shí)，使用缺硫（TAP-S）培養(yǎng)基進(jìn)行缺硫培養(yǎng)，過渡至PSⅡ活性被抑制的階段2，開始產(chǎn)氫（如圖6所示）。階段2產(chǎn)氫的電子來自階段1合成的內(nèi)源底物（淀粉等有機(jī)物）的氧化，能量轉(zhuǎn)換效率相對(duì)較低。當(dāng)內(nèi)源底物耗盡時(shí)，產(chǎn)氫過程也將停止。此時(shí)需要使用正常的TAP培養(yǎng)基使萊茵衣藻重新進(jìn)入階段1。

圖6　硫充足條件下和無硫條件下細(xì)胞內(nèi)過程和通路示意［71］

淺灰色箭頭和文字表示不活躍的途徑或過程。

在缺硫培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，固定化培養(yǎng)方法［72-73］進(jìn)一步提升了綠藻光合產(chǎn)氫效率。固定化培養(yǎng)的細(xì)胞所占空間更小，所需生長介質(zhì)體積更小，比懸浮液中的游離細(xì)胞更有優(yōu)勢［74］。此外，還有培養(yǎng)基中缺氮［75-76］、缺磷［77-78］、缺鎂［79］和缺鉀［80］等代謝調(diào)控法。代謝調(diào)控法常與基因工程方法結(jié)合，共同提高光合產(chǎn)氫效率，在產(chǎn)氫時(shí)間和總量上都有很大突破。由于代謝調(diào)控法在實(shí)驗(yàn)過程中需反復(fù)離心，操作較為煩瑣且實(shí)驗(yàn)成本較高，故其大規(guī)模應(yīng)用面臨一定挑戰(zhàn)。

2.3　基因工程方法

隨著分子生物學(xué)的進(jìn)展，已經(jīng)有一系列利用基因工程方法提高綠藻光合產(chǎn)氫效率的研究。較為常見的方法是通過基因突變篩選出理想的光合產(chǎn)氫綠藻，或?qū)G藻進(jìn)行定向基因改造。

2.3.1基因突變法

GHIRARDI等［81］和STAPLETON等［82］分別通過體內(nèi)隨機(jī)突變和體外隨機(jī)突變方法嘗試改造氫化酶，提升其耐氧性。遺憾的是，這些工作在提升耐氧性方面并沒有帶來較大的提升，只能尋找其他突變靶點(diǎn)篩選產(chǎn)氫的優(yōu)勢藻株。RüHLE等［83］篩選了一種光合作用/呼吸作用比率較低的1突變體，在光照充足且硫足量的條件下建立了厭氧環(huán)境并誘導(dǎo)氫化酶的合成。在添加CBB循環(huán)抑制劑乙醇醛（GA）后，1突變體的產(chǎn)氫量是野生型缺硫條件下的2倍。KRUSE等［45］篩選了一種6萊茵衣藻突變體，證明其具有優(yōu)化的呼吸代謝、大量的淀粉儲(chǔ)備和較低的溶解氧濃度（野生型的40%）等特性，持續(xù)產(chǎn)氫14 d，產(chǎn)氫量約540 mL·L-1。D1蛋白是PSⅡ反應(yīng)中心的一部分，D1中S155和D170之間的大多數(shù)氨基酸在介導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，有望成為使PSⅡ部分失活的突變靶點(diǎn)［84］。TORZILLO等［47］篩選了雙氨基酸取代的D1蛋白突變株L159I-N230Y，L159亮氨酸被異亮氨酸取代，N230天冬氨酸被酪氨酸取代。在缺硫培養(yǎng)條件下，該突變株與CC124相比，表現(xiàn)出更高的D1蛋白質(zhì)含量、更高的呼吸作用效率、更高的碳水化合物儲(chǔ)存能力以及較高的PSⅡ活性［85］。且該突變株的產(chǎn)氫量是野生型的20倍，持續(xù)時(shí)間更長，證實(shí)了PSⅡ部分失活可以促進(jìn)產(chǎn)氫。同樣，以PSⅡ活性為目標(biāo)，BATYROVA等［86］構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因突變體62.49能周期性地激活光合作用，只在厭氧狀態(tài)下才開啟光合放氧過程。因此，該突變株的光合放氧過程不連續(xù)，有效降低了O2濃度，而且產(chǎn)氫量隨光照周期的增加逐漸增加，最終產(chǎn)氫量比野生型高4.5倍。

CBB循環(huán)是氫化酶產(chǎn)氫所需電子的主要競爭對(duì)手［27］，而1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（RuBisCO）在CBB循環(huán)過程中起關(guān)鍵作用。HEMSCHEMEIER等［87］發(fā)現(xiàn)，在缺硫培養(yǎng)條件下，碳同化過程受損的CC2803（RuBisCO大亞基缺失）產(chǎn)氫效率比野生型更高。同樣地，PINTO等［88］篩選了RuBisCO小亞基酪氨酸突變體，CBB循環(huán)受到了抑制，產(chǎn)氫量比野生型高10～15倍。

除了光合作用的線性電子傳遞途徑外，圍繞PSⅠ的環(huán)式電子傳遞途徑（CEF）可以將PSⅠ受體側(cè)的電子傳遞給PQ池或Cyt6/復(fù)合體。CEF已被證明能產(chǎn)生類囊體跨膜質(zhì)子梯度，誘導(dǎo)非光化學(xué)猝滅（NPQ）的產(chǎn)生。在高光條件下，PSⅠ周圍的環(huán)式電子傳遞途徑產(chǎn)生的質(zhì)子梯度嚴(yán)重限制了綠藻產(chǎn)氫過程的電子供應(yīng)［89］。CHEN等［90］篩選了一種環(huán)式電子傳遞途徑受損的5突變體（也稱91），能夠持續(xù)產(chǎn)氫25 d，產(chǎn)氫量比野生型高30倍以上。在缺硫培養(yǎng)條件下，91突變體的活性氧（ROS）清除能力增強(qiáng)，能保護(hù)光合線性電子傳遞免受光氧化的損傷，使PSⅡ保持更高的活性，向氫化酶提供充足的電子。類似的結(jié)果也發(fā)生在環(huán)式電子傳遞途徑被破壞的1突變體中，STEINBECK等［46］報(bào)道的質(zhì)子梯度突變體5在缺硫培養(yǎng)條件下產(chǎn)氫量比野生型高10倍，產(chǎn)氫總量約850 mL·L-1。

2.3.2基因改造法

與基因突變技術(shù)不同，基因改造技術(shù)可以定向修飾綠藻，解決氫化酶的O2敏感性問題。HWANG等［91］通過在YSL01和YSL16中過表達(dá)氫化酶基因（），實(shí)現(xiàn)了有氧條件下的光自養(yǎng)產(chǎn)氫。XU等［92］將大腸桿菌丙酮酸氧化酶基因和長聚球藻（）PCC7942的過氧化氫化酶基因?qū)肴R因衣藻的葉綠體，用低強(qiáng)度光照射，轉(zhuǎn)基因萊因衣藻細(xì)胞消耗的O2比野生型更多，營造了O2濃度較低的環(huán)境，顯著提高了產(chǎn)氫量。WU等［48，93］將豆血紅蛋白的基因?qū)肴R因衣藻葉綠體并成功表達(dá)，由于豆血紅蛋白可以結(jié)合O2，因此具有基因的萊茵衣藻消耗O2的速率比野生型更快，并持續(xù)產(chǎn)氫5 d。鑒于萊茵衣藻葉綠體基因組中強(qiáng)烈的密碼子偏好性，WU等［94］將合成的密碼子優(yōu)化的-基因?qū)肴R茵衣藻的葉綠體并表達(dá)。結(jié)果表明，-蛋白的表達(dá)水平比非優(yōu)化組提高了6.8倍，產(chǎn)氫量提高了22%，呼吸速率提高了44%，1和2的轉(zhuǎn)錄水平比對(duì)照藻更穩(wěn)定、更高，從而獲得了產(chǎn)氫更理想的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻。由于一些細(xì)菌中［FeFe］-氫化酶的耐氧性比綠藻更強(qiáng)，在綠藻中表達(dá)這些細(xì)菌的氫化酶基因也是一種有效提高產(chǎn)氫效率的方法，比如梭狀芽孢桿菌［95］和丙酮丁醇梭菌的［FeFe］-氫化酶［96］。

除了氫化酶的氧敏感問題，光合電子利用效率低也是光合產(chǎn)氫效率不高的主要原因。為了解決此問題，YACOBY等［27］、EILENBERG等［97］、WEINER等［98］將電子供體Fd融合到氫化酶上，在萊茵衣藻中成功表達(dá)［27，97-98］，研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)d-氫化酶融合酶能攔截光合電子，將其用于產(chǎn)氫過程，并證實(shí)了融合酶的O2敏感性比天然氫化酶低。因此，F(xiàn)d-氫化酶融合酶對(duì)光合產(chǎn)氫具有雙重積極作用。此外，BEN-ZVI［49］在萊茵衣藻中表達(dá)了氫化酶-超氧化物歧化酶（SOD）融合酶。表達(dá)氫化酶-SOD酶的藻類在產(chǎn)氫效率和時(shí)間上都超過了表達(dá)Fd-氫化酶的藻類，可以連續(xù)產(chǎn)氫長達(dá)14 d。

基因改造依賴于通過非法重組將隨機(jī)插入基因組的轉(zhuǎn)基因成功表達(dá)?；蚋脑斓闹饕系K是缺乏在綠藻中插入靶向基因的工具，需要開發(fā)可控的基因工程系統(tǒng)，通過同源重組替換目標(biāo)基因。此外，通過核基因靶向和定點(diǎn)突變實(shí)現(xiàn)對(duì)綠藻產(chǎn)氫的精細(xì)控制是必要的。

3　總結(jié)與展望

光合產(chǎn)氫被認(rèn)為是替代化石燃料能源最具前景的技術(shù)之一。在過去幾十年間，研究者們對(duì)綠藻光合產(chǎn)氫代謝進(jìn)行了大量探索，建立了很多重要的理論和實(shí)用技術(shù)方法，在綠藻光合產(chǎn)氫領(lǐng)域奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，如圖7所示。［FeFe］-氫化酶氧敏感性和光合放氧過程的相互矛盾限制了綠藻光合產(chǎn)氫的發(fā)展。此外，光合產(chǎn)氫存在多種競爭電子代謝途徑，在保持氫化酶活性的情況下使更多的電子流向氫化酶，是高效光合產(chǎn)氫的關(guān)鍵。

圖7　提升光合產(chǎn)氫的方法總結(jié)

“+”數(shù)量越多，代表提升產(chǎn)氫效率的潛力值越高。

The more the number of " + "， the higher the potential of improving hydrogen production efficiency.

目前已經(jīng)開發(fā)了多種方法針對(duì)性地規(guī)避這些限制因素，綠藻光合產(chǎn)氫的穩(wěn)定性和效率均得到一定的提升。其中，缺硫培養(yǎng)被認(rèn)為是光合產(chǎn)氫最成功的方法之一，在時(shí)間和空間上分離了光合放氧和光合產(chǎn)氫的過程，但是仍需繼續(xù)優(yōu)化，降低其操作復(fù)雜性并進(jìn)一步控制產(chǎn)氫成本。與缺硫培養(yǎng)方法相比，添加除氧劑可以使綠藻更易進(jìn)入光合產(chǎn)氫過程，需添加的化學(xué)試劑具有高O2清除能力和良好生物相容性。此外，藻菌共培養(yǎng)方法使用活細(xì)胞作為除氧劑，在產(chǎn)氫時(shí)間和成本上明顯優(yōu)于添加化學(xué)試劑，是一種具有潛力的產(chǎn)氫方法。與此同時(shí)，通過基因工程方法構(gòu)建理想的高產(chǎn)氫藻株，有望徹底消除綠藻限制產(chǎn)氫的因素，是實(shí)現(xiàn)綠藻光合產(chǎn)氫商業(yè)化應(yīng)用的有力手段。盡管綠藻光合產(chǎn)氫技術(shù)已經(jīng)發(fā)展得比較成熟，但距離大規(guī)模應(yīng)用仍有一定差距，許多科學(xué)和工程問題亟待解決。筆者認(rèn)為，未來實(shí)現(xiàn)綠藻光合產(chǎn)氫的大規(guī)模應(yīng)用可以從以下方面入手：

（1）篩選或者構(gòu)建適合工業(yè)化的高效產(chǎn)氫的綠藻藻株。由于大自然的生物多樣性可能存在大量的高產(chǎn)氫優(yōu)異藻株，需研究者不斷發(fā)現(xiàn)和篩選，利用現(xiàn)有的分子生物學(xué)技術(shù)快速、高效地篩選高產(chǎn)氫的野生型藻株。同時(shí)利用基因工程手段獲得高效穩(wěn)定的光合產(chǎn)氫藻株，進(jìn)一步提升突變技術(shù)的篩選效率和穩(wěn)定性是重要的研究方向。

（2）探究能消耗O2且能重復(fù)利用的試劑。目前已經(jīng)探索出很多能直接與O2結(jié)合，且不會(huì)對(duì)綠藻的活性產(chǎn)生明顯危害的還原試劑，但其大規(guī)模應(yīng)用仍需關(guān)注試劑的消耗、成本以及對(duì)環(huán)境的影響等問題。如果能研究出可重復(fù)使用且可批量應(yīng)用的試劑，則有望解決消耗O2的問題。

（3）進(jìn)一步加深對(duì)綠藻內(nèi)部的機(jī)理探究。不僅要考慮氫化酶的激活，還要重點(diǎn)關(guān)注CBB循環(huán)電子競爭途徑和其他造成電子損失的微觀生物學(xué)機(jī)理，探究控制競爭代謝途徑之間電子的分配，在此基礎(chǔ)上尋找理想的方法，在保證綠藻有良好光合活性的同時(shí)，讓更多的電子能高效流向產(chǎn)氫的代謝途徑。

（4）開發(fā)經(jīng)濟(jì)可行的光生物反應(yīng)器系統(tǒng)。藻類生物質(zhì)的商業(yè)生產(chǎn)已成功應(yīng)用于室外，但對(duì)生物氫而言，露天場所不適合產(chǎn)生和收集擴(kuò)散性的氣體產(chǎn)物。因此，開發(fā)封閉的光生物反應(yīng)器系統(tǒng)也是綠藻光合產(chǎn)氫大規(guī)模應(yīng)用的硬性條件。通過光生物反應(yīng)器精確地控制產(chǎn)氫過程中的光照、溫度、pH等條件，達(dá)到有效回收和分離H2的應(yīng)用目標(biāo)。

筆者有理由相信，在提高產(chǎn)氫工藝效率、產(chǎn)量以及工藝操作的實(shí)用性和可持續(xù)性基礎(chǔ)上，光合產(chǎn)氫將從基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)向應(yīng)用研究，未來綠藻光合產(chǎn)氫有望達(dá)到商業(yè)化應(yīng)用的要求，最終取代化石能源，建立一個(gè)安全可持續(xù)的能源系統(tǒng)。

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Progress of photobiological hydrogen production by green algae

ZHANG Yaqin1,2, TANG Ruikang1,2, MA Weimin3, XIONG Wei4, XU Xurong2

（1，，310027，；2，，310027，；3，，200234，；4，，330031，）

Photobiological hydrogen production by green algae exhibits a bright application prospect in solar energy utilization and hydrogen energy production due to the advantages of high energy conversion efficiency, environmental friendliness as well as abundant raw materials. This paper analyzes the potential factors limiting photobiological hydrogen production by green algae based on the mechanism, and summarizes various methods to improve the efficiency of photobiological hydrogen production by green algae. The main problems and development trends in the commercial application of photobiological hydrogen production by green algae are briefly reviewed, which are referable for the large-scale application of photobiological hydrogen production by green algae in the future.

green algae; photobiological hydrogen; hydrogenase; O2sensitivity; electronic sources

Q 949

A

1008?9497（2023）01?069?14

2022?03?30.

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21875215）.

張亞琴（1994—），ORCID：https：//orcid.org/0000-0003-2456-9704，碩士研究生，主要從事綠藻光合產(chǎn)氫研究，E-mail： 11837050@zju.edu.cn.

通信作者，ORCID：https：//orcid.org/0000-0002-0626-0597，E-mail： xrxu@zju.edu.cn.