鵪鶉MITF 基因多態(tài)性與羽色性狀的關(guān)聯(lián)性分析

袁兵杰，張奕菲，劉 佩，王 娜，鄭騰飛，祁艷霞,2*

（1.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽 471003；2.洛陽市動(dòng)物遺傳育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南洛陽 471003）

小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Microphthalmia-Associtated Transcription Factor，MITF)最早由德國科學(xué)家Hertwig 于1942 年在突變小鼠后代中發(fā)現(xiàn)，并將該突變位點(diǎn)命名為mi，突變個(gè)體表現(xiàn)為毛色、虹膜色素退減、小眼畸形和耳聾。在1993 年，最先由Hodgkinso從小鼠中克隆得到對(duì)應(yīng)的mi 位點(diǎn)基因MITF[1]。MITF屬于MITF 轉(zhuǎn)錄因子家族，該基因編碼區(qū)有9 個(gè)外顯子，編碼419 個(gè)氨基酸，MITF 基因編碼的蛋白具有基本-螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈（basic-Helix-Loop-Helix-LeucineZip-per，bHLHZip)結(jié)構(gòu)[2]，該結(jié)構(gòu)橫跨90 個(gè)氨基酸，基礎(chǔ)部分由11 個(gè)氨基酸組成，是MITF 蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)功能區(qū)，另外在N-末端和C-末端分別具有一個(gè)強(qiáng)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)功能區(qū)和一個(gè)富含絲氨酸的激活域[3]。本實(shí)驗(yàn)的目的是通過PCR-SSCP 方法尋找多態(tài)性位點(diǎn)，探索MITF 基因與朝鮮鵪鶉羽色之間的關(guān)聯(lián)性。

MITF 蛋白是一種核蛋白，參與并調(diào)節(jié)成黑色素細(xì)胞和黑色素細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育。試驗(yàn)證明，MITF 基因突變使得黑色素合成受阻，小鼠毛色表型呈現(xiàn)為白色皮毛[4]。本實(shí)驗(yàn)選取北京白羽鵪鶉和栗羽朝鮮鵪鶉，提取DNA 后對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增并檢測(cè)，利用不對(duì)稱PCR-SSCP 聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)比分析以確定突變位點(diǎn)，分析各SNP 位點(diǎn)與羽色性狀的關(guān)聯(lián)性，用以后續(xù)總結(jié)分析，得到此項(xiàng)內(nèi)容具有一定的研究?jī)r(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

北京白羽鵪鶉和栗羽朝鮮鵪鶉取自河科大鵪鶉種業(yè)有限公司。隨機(jī)選取300 枚北京白羽鵪鶉和朝鮮鵪鶉（栗羽)受精蛋，于2020 年9 月份進(jìn)行孵化，在孵化10d 時(shí)[5]采其翅組織樣品，迅速投入液氮中保存用于提取DNA。

1.2 朝鮮鵪鶉基因組DNA 提取

DNA 提取采用上海生工生物工程有限公司的試劑盒，進(jìn)行室溫離心后收集DNA 溶液，可立即進(jìn)行下一步試驗(yàn)或置于冰箱-20℃保存。

1.3 朝鮮鵪鶉MITF 基因不對(duì)稱PCR-SSCP 分析

PCR 擴(kuò)增分兩次進(jìn)行，第一次擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×Taq Master-Mix 10μL，上下游引物各0.7μL，DNA 模板1μL 和ddH2O 7.6μL，總體積20μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4min；95℃變性30s，退火30s，72℃延伸1min，36 個(gè)循環(huán)；72℃10min。反應(yīng)所需的引物分別為MF3S、MF4S、MF5S（表1)。將目的基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物于110V 電壓下，通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，隨后將所得的產(chǎn)物置于冰箱保存?zhèn)溆?。第二次PCR 反應(yīng)體系：第一次PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物1μL，上游引物或下游引物0.7μL，2×Taq Master-Mix10μL，最后加水至20μL。反應(yīng)條件同第一次PCR，20 個(gè)循環(huán)。對(duì)目的基因PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并置于冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 朝鮮鵪鶉MITF 基因引物信息

1.4 不對(duì)稱PCR-SSCP 聚丙烯酰胺凝膠電泳及分析

取8μL 第二次擴(kuò)增產(chǎn)物和2μL 6×loading buffer混合均勻，4℃下在12%的聚丙烯酰胺凝膠[V（丙烯酰胺)∶V（亞甲雙丙烯酰胺)=29∶1]上200V 電泳15min 后，調(diào)整電壓至100V，電泳10h，（具體電泳時(shí)間根據(jù)片段大小不同可進(jìn)行調(diào)整)。電泳完畢后，取下玻璃板，進(jìn)行染色，拍照保存，進(jìn)行分析。每個(gè)基因型個(gè)體分別選取3 份PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，送去測(cè)序，對(duì)比分析以確定突變位點(diǎn)。

1.5 SNP 位點(diǎn)與羽色性狀的關(guān)聯(lián)性分析

計(jì)算基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量（PIC)，并運(yùn)用皮爾遜卡方檢驗(yàn)檢測(cè)朝鮮鵪鶉群體是否處于Hardy-Weinberg 平衡。利用SPSS13.0 進(jìn)行χ2獨(dú)立性檢驗(yàn)，分析各SNP 位點(diǎn)與羽色性狀的關(guān)聯(lián)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

圖1 為北京白羽鵪鶉和栗羽朝鮮鵪鶉MITF 基因外顯子4、外顯子5 和3′UTR 的PCR 擴(kuò)增結(jié)果，其片段長(zhǎng)度分別為199、191 和185bp。產(chǎn)物條帶清晰、無雜帶，可以用于后續(xù)測(cè)序分析。

圖1 鵪鶉MITF 基因PCR 產(chǎn)物的電泳檢測(cè)

2.2 MITF 基因不對(duì)稱PCR-SSCP 電泳分析

經(jīng)不對(duì)稱PCR-SSCP 分析，MITF 基因擴(kuò)增片段中均有2 個(gè)等位基因：A 和B，有3 種基因型：AA、BB 和AB，如圖2 所示。

圖2 鵪鶉MITF 基因擴(kuò)增產(chǎn)物不對(duì)稱PCR-SSCP 分析

2.3 不對(duì)稱PCR-SSCP 測(cè)序結(jié)果分析

選取AA 型、AB 型和BB 型個(gè)體PCR 產(chǎn)物各3份進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示有3 個(gè)突變位點(diǎn)，如圖3 所示，分別為c.589A＞G、c.761A＞G 和位于3′UTR 的c.2275C＞T，其中c.589A＞G 堿基的突變使得賴氨酸變?yōu)楣劝彼幔鐖D4 所示，且在3′UTR C＞T 的突變可能改變MicroRNA 結(jié)合，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄活性改變，具有一定的研究?jī)r(jià)值。

圖3 鵪鶉MITF 基因3 個(gè)突變位點(diǎn)的序列比對(duì)分析

圖4 MITF 基因c.589A＞G 突變導(dǎo)致編碼蛋白氨基酸的改變

2.4 鵪鶉MITF 基因突變位點(diǎn)的遺傳信息分析

在鵪鶉群體中MITF 基因的3 個(gè)SNP 中的優(yōu)勢(shì)等位基因頻率分別為0.68、0.68 和0.65，其中c.589A＞G 和c.761G ＞A 位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)锳，c.2275C＞T 位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)锽。對(duì)群體多態(tài)信息含量分析發(fā)現(xiàn)，3 個(gè)突變位點(diǎn)均表現(xiàn)為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5)（見表2)。對(duì)3 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)，鵪鶉群體在c.589A＞G、c.761A ＞G 和 c.2275C ＞T 3 個(gè)位點(diǎn)都達(dá)到Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05)（見表3)。

表2 MITF 基因不同基因型的群體遺傳學(xué)分析

表3 MITF 基因不同突變位點(diǎn)的Hardy-Weinberg 平衡檢測(cè)

2.5 鵪鶉MITF 基因突變位點(diǎn)與羽色的關(guān)聯(lián)性分析

對(duì)朝鮮鵪鶉和北京白羽鵪鶉2 個(gè)群體的3 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行個(gè)體基因分型，計(jì)算各個(gè)突變位點(diǎn)的基因頻率和等位基因頻率，利用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，并分析兩種羽色群體各突變位點(diǎn)基因型與羽色性狀的關(guān)聯(lián)，結(jié)果見表4。由表4 可知，在c.589A＞G 位點(diǎn)，兩個(gè)羽色群體之間基因型分布存在極顯著差異（P＜0.01)。同時(shí)，在c.2275C＞T 位點(diǎn)，兩個(gè)羽色群體之間基因型分布存在顯著差異（P＜0.05)。由此可以推斷，MITF 基因的c.589A＞G 和c.2275C＞T 突變位點(diǎn)可能與朝鮮鵪鶉羽色性狀具有一定的關(guān)聯(lián)性。

表4 朝鮮鵪鶉MITF 基因多態(tài)性與羽色性狀的關(guān)聯(lián)性分析

3 討論

動(dòng)物不同的被毛顏色與羽毛顏色一直是育種工作者關(guān)注的主要問題。動(dòng)物黑色素變異性沉著是肉眼可見的表型性狀[6]，是眾多基因共同作用的結(jié)果。黑色素的合成是酪氨酸酶催化體內(nèi)酪氨酸羥化而啟動(dòng)的一系列反應(yīng)過程。酪氨酸酶、酪氨酸相關(guān)蛋白1 和多巴色素互變異構(gòu)酶功能紊亂會(huì)導(dǎo)致黑色素沉著失調(diào)[7]。本試驗(yàn)通過設(shè)計(jì)3 對(duì)引物，分別擴(kuò)增MITF 基因外顯子4、外顯子5 和3′UTR 的DNA 序列片段，利用不對(duì)稱PCR-SSCP 技術(shù)分析，于外顯子4、外顯子5和3′UTR 的DNA 序列片段均發(fā)現(xiàn)三種基因型，即AA、AB 和BB，測(cè)序后經(jīng)DNAMAN 軟件比對(duì)發(fā)現(xiàn)3 個(gè)突變位點(diǎn)，皮爾遜卡方檢驗(yàn)表明朝鮮白羽鵪鶉群體在c.589A ＞G、c.761G ＞A 和c.2275C ＞T位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)（P＞0.05)。在c.589A＞G和c.2275C＞T 位點(diǎn)處栗羽朝鮮鵪鶉的3 種基因型（AA、AB 和BB)的頻率分布與北京白羽鵪鶉的3 種基因型頻率分布存在顯著差異（P＜0.01)，說明該突變位點(diǎn)與鵪鶉羽色之間存在一定的關(guān)聯(lián)性。這與黃晶[8]研究結(jié)果相一致，另有學(xué)者研究表明，純合子日本鵪鶉和雜合子日本鵪鶉羽色性狀的差異是由MITF 基因第11 外顯子的缺失[9]引起的，推測(cè)可能是MITF 基因的突變導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄和翻譯效率降低，引起蛋白功能、活性和空間構(gòu)象的改變，另外由于MITF 基因調(diào)控黑色素合成過程[10]，雖然非編碼區(qū)突變不會(huì)引起氨基酸的改變，但因改變了堿基組成，有可能影響轉(zhuǎn)錄，也可能存在對(duì)基因表達(dá)的影響，因此推測(cè)朝鮮鵪鶉群體中被毛顏色表現(xiàn)較深可能與群體中等位基因A 或B為優(yōu)勢(shì)基因有關(guān)。3′UTR 區(qū)域SNP 位點(diǎn)的同義突變雖未改變氨基酸結(jié)構(gòu)，但可能改變MicroRNA 結(jié)合，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄活性發(fā)生改變，因此具有進(jìn)一步的研究?jī)r(jià)值。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)朝鮮鵪鶉MITF 基因的部分序列進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果顯示，位于MITF 基因外顯子4 的突變位點(diǎn)（c.589A＞G)使得賴氨酸變?yōu)楣劝彼幔撏蛔兣c朝鮮鵪鶉的羽色存在顯著關(guān)聯(lián)性，另外位于3′UTR 處的c.2275C＞T 突變也與朝鮮鵪鶉的羽色存在顯著關(guān)聯(lián)性，但其具體的影響機(jī)制需進(jìn)行下一步深入研究。