大腸菌群間接計數(shù)法在水質(zhì)大腸菌群監(jiān)測中的應(yīng)用效果研究

熊璐

（江西省上高縣疾病預(yù)防控制中心，宜春 336400）

大腸菌群是一種用于監(jiān)測水質(zhì)衛(wèi)生情況的常用指示菌，快速、準(zhǔn)確監(jiān)測此菌群，衛(wèi)生學(xué)意義重大?，F(xiàn)階段，在快速監(jiān)測大腸菌群的各種方法中，多為以核酸為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)檢測，這些技術(shù)對于相關(guān)實(shí)驗(yàn)條件有著比較高的要求，并且價格貴，因而對其實(shí)際應(yīng)用造成了影響與限制[1]。當(dāng)前比較常用的水質(zhì)大腸菌群間接計數(shù)法（MPN法）與耐熱大腸菌群MPN法相比較，有較多的操作步驟，較為繁瑣，工作量較大[2]。本文在檢測水質(zhì)大腸菌群中采用大腸菌群MPN法，驗(yàn)證其在檢測大腸菌群中的效果，并與水質(zhì)大腸菌群MPN法的人力消耗、檢測時間、物力及大腸菌群檢出率進(jìn)行對比，旨在剖析耐熱大腸菌群MPN法的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器 在2020年1月至2021年1月間，對采集本地區(qū)各類水質(zhì)，即水庫水、水源水、農(nóng)村生活飲用水、城市生活飲用水等，試劑主要有煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯、伊紅美藍(lán)瓊脂、革蘭染色液及乳糖蛋白胨培養(yǎng)液等。儀器：諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司生產(chǎn)的JM-A電子天平，澳柯瑪股份有限公司生產(chǎn)的YC-180澳柯瑪冰箱，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)的BSC-1300ⅡA2生物安全柜，山東新華醫(yī)療器械廠生產(chǎn)的CJV1500T潔凈工作臺，山東新華醫(yī)療器械廠生產(chǎn)的LMQC立式滅菌器，DLAB Scientific Inc生產(chǎn)的5V電動移液槍。

1.2 方法 （1）檢測前的準(zhǔn)備。高壓滅菌消毒采水容器，向容器當(dāng)中置入水樣本，于6 h內(nèi)送檢。（2）檢測水質(zhì)大腸菌群。采用總大腸菌群MPN法[《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法微生物指標(biāo)》（GB/T5750.12-200）]。采用滅菌吸管精取水樣10 mL，接種至雙料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液當(dāng)中（10 mL），再用滅菌吸管精取水樣1 mL，接種至單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液當(dāng)中（10 mL），另取水樣1 mL，加入到生理鹽水當(dāng)中（9 mL），充分混勻；用滅菌吸管1 mL精取單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液當(dāng)中（10 mL），各稀釋度接種5管，一共為15管。把接種管置入到培養(yǎng)箱當(dāng)中（溫度設(shè)定為[（36±1）℃]，持續(xù)培養(yǎng)（24±2）h，若產(chǎn)酸、產(chǎn)氣管，那么接種至伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24 h，與深紫黑色，有金屬光澤相符；淡紫紅色，中心存在比較深的菌落，做革蘭染色、鏡檢以及證實(shí)實(shí)驗(yàn)。（3）檢測耐熱大腸菌群。用MPN法實(shí)施檢測[《耐熱大腸菌群檢驗(yàn)計數(shù)》（GB4789.3-2018）]。采用滅菌吸管精取水樣10 mL，接種至LST肉湯管培養(yǎng)液當(dāng)中（10 mL），另用滅菌吸管精取水樣1 mL，接種至LST培養(yǎng)液（10 mL）當(dāng)中，再去水樣1 mL，加入至生理鹽水當(dāng)中（9 mL），充分混勻；用滅菌吸管精取1 mL水樣，在LST培養(yǎng)液（10 mL）中接種，各稀釋度接種3管，一共為9管。把接種管置入到培養(yǎng)箱當(dāng)中，持續(xù)培養(yǎng)24~48 h，產(chǎn)氣管實(shí)施復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，取1環(huán)培養(yǎng)物，接種入BGLB管當(dāng)中，培養(yǎng)（48±12）h，對大腸菌群陽性管數(shù)進(jìn)行記錄，查MPN表，將大腸菌群MPN值得出。（4）兩種方法一致性檢驗(yàn)。用Kappa檢驗(yàn)驗(yàn)證MPN法與總大腸菌群MPN法對水質(zhì)當(dāng)中大腸菌群進(jìn)行檢驗(yàn)的一致性，證明兩方法都可以用作檢測水質(zhì)中大腸菌群。

1.3 觀察指標(biāo) 就兩種方法對各項(xiàng)陽性標(biāo)本進(jìn)行檢測的人力、物力、費(fèi)用、時間進(jìn)行對比，另對兩種檢測效果進(jìn)行評價，且分析其大腸菌群的陽性率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理SPSS 24.0處理數(shù)據(jù)，t、χ2分別對計量、計數(shù)資料進(jìn)行檢驗(yàn)，Kappa值檢驗(yàn)一致性，若≥0.75，即一致性好；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法對水質(zhì)大腸菌群進(jìn)行檢測的一致性兩種方法對水質(zhì)大腸菌群進(jìn)行檢驗(yàn)，有著較好的一致性，Kappa=0.91，見表1。

表1 2種方法檢驗(yàn)水質(zhì)大腸菌群的一致性（MPN/100 mL）

2.2 兩種MPN法對水質(zhì)菌群陽性率進(jìn)行檢測對比兩種方法在對水質(zhì)大腸菌群陽性率進(jìn)行檢測上，經(jīng)對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 對比2種方法檢測水質(zhì)菌群陽性率的結(jié)果

2.3 兩種方法所耗成本對比 耐熱大腸菌群MPN法相對應(yīng)的消耗人力費(fèi)用、試劑費(fèi)用、儀器耗損費(fèi)用均較水質(zhì)大腸菌群MPN法低（P＜0.05），消耗時間較水質(zhì)大腸菌群MPN法短（P＜0.05），見表3。

表3 對比2種方法所耗成本

3 討論

大腸菌群在人、動物糞便中廣泛存在，人、畜糞便對環(huán)境所造成的污染，實(shí)為大腸菌群在自然界當(dāng)中長久生存的原因所致，因此，將其當(dāng)做糞便污染指標(biāo)，對水的衛(wèi)生質(zhì)量進(jìn)行評價，對其有無被腸道致病菌污染的可能進(jìn)行推斷[3]。若在水質(zhì)當(dāng)中存在大腸菌群，提示水質(zhì)沒有能夠做到廣泛性的消毒處理，在加工之后，如果保存條件不理想，容易遭受污染[4]。對大腸菌群進(jìn)行檢驗(yàn)，對水的衛(wèi)生管理有利，并且能夠?yàn)槿藗兊慕】怠踩峁┣袑?shí)維護(hù)。

大腸菌群是一類比較常用的水質(zhì)衛(wèi)生監(jiān)測指示菌，廉價、快速且便利的檢測方法對于保證水質(zhì)衛(wèi)生，起到至關(guān)重要的作用[5]?，F(xiàn)階段，在檢測大腸菌群上，國內(nèi)外已出現(xiàn)許多方法，其中比較常用的有核酸雜交技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、以16Sr RNA與GyaB為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)等，但需要指出的是，這些方法盡管比較精確、快捷，但需要用到一些高精密儀器或設(shè)備，而且檢測費(fèi)用也比較昂貴，因而對于基層疾控中心并不適用[6]。

通常情況下，在檢測水質(zhì)大腸菌群時，多采用國標(biāo)當(dāng)中的MPN檢測方法，但需要強(qiáng)調(diào)的是，此種方法耗費(fèi)的人力、物力多，而且還有著較長的操作時間。本文用國標(biāo)GB4789.3-2016當(dāng)中的MPN方法，對水質(zhì)的大腸菌群進(jìn)行檢測，通過兩種方法對大腸菌群的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行檢驗(yàn)，最終結(jié)果得知，兩種MPN法對水質(zhì)大腸菌群進(jìn)行檢測的一致性較好，表明兩種方法都能夠用作檢測大腸菌群，并且通過兩種方法大腸菌群的檢出率對比發(fā)現(xiàn)，兩種方法對水質(zhì)大腸菌群陽性率進(jìn)行檢測對比，差異并不明顯。表明耐熱大腸菌群MPN法用作檢測水質(zhì)大腸菌群，具有一定的可行性[7-8]。另從本文得知，耐熱大腸菌群MPN法無論是在儀器耗損費(fèi)上，還是在消耗人力費(fèi)用、試劑費(fèi)用上，均較水質(zhì)大腸菌群MPN法低，另外，在消耗時間上，較水質(zhì)大腸菌群MPN法短，表明耐熱大腸菌群MPN法無論是在時間效益上，還是在經(jīng)濟(jì)效益上，均較好。

綜上，兩種方法在檢測大腸菌群陽性率上，基本相當(dāng)，而GB/T5750.12-2006當(dāng)中的MPN檢測方法與GB4789.3-2018當(dāng)中的MPN檢測方法相比較，需要投入更多的人、物、財力，并且操作也比較繁瑣，需要花費(fèi)較長的時間。所以，針對基層疾控單位而言，選用GB4789.3-2018當(dāng)中的MPN法對GB/T5750.12-2006當(dāng)中的MPN法進(jìn)行替代，借此對水質(zhì)當(dāng)中的大腸菌群進(jìn)行檢測，操作簡便，能夠因地制宜且節(jié)省時間與開支。