應(yīng)用分子對接技術(shù)預(yù)測氟伐他汀對胰腺癌細胞作用的關(guān)鍵靶點

朱秀賢，楊舜娟，林菁紅，甘惠貞

0 引言

胰腺癌是消化道系統(tǒng)惡性程度最高的腫瘤之一，具有發(fā)病隱匿、進展迅速、病死率高等特點，其1年和5年相對生存率分別為27%和7%[1]，預(yù)后極差。手術(shù)是胰腺癌有效的治療手段，但只有15%～20%的患者在確診時符合手術(shù)條件[2]。對于不適合手術(shù)或轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者，目前尚無有效治療方式。

他汀類藥物是一類羥甲基戊二酰輔酶A(3-Hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A，HMG-CoA)還原酶抑制劑，廣泛應(yīng)用于調(diào)節(jié)膽固醇水平以及預(yù)防心血管疾病。近年來，越來越多的證據(jù)表明，他汀類藥物能夠通過抑制增殖、血管生成以及誘導(dǎo)凋亡或自噬等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[3-5]。辛伐他汀能夠通過降低線粒體電子載體輔酶Q的合成而干擾氧化還原穩(wěn)態(tài)，進而導(dǎo)致胰腺導(dǎo)管腺癌的氧化應(yīng)激和凋亡[6]；氟伐他汀可通過抑制p21ras和rhoA蛋白的異戊二烯化，增強吉西他濱對MiaPaCa-2細胞的毒性作用[7]；在多種轉(zhuǎn)基因胰腺癌小鼠模型中，辛伐他汀能夠延緩胰腺上皮內(nèi)瘤變的進展，部分抑制胰腺癌的形成[8]。上述研究表明，他汀類藥物在胰腺癌的治療或預(yù)防方面具有應(yīng)用前景，因此，探究他汀類藥物對胰腺癌細胞或組織基因表達譜的影響具有重要意義。然而，關(guān)于氟伐他汀防治胰腺癌的研究較少，基于目前的研究結(jié)果，氟伐他汀對胰腺癌細胞基因表達譜的影響仍不清晰。

分子對接是藥物篩選潛在靶點的不可缺少的手段之一，本研究選擇氟伐他汀作為目標藥物，通過生物信息學(xué)方法，分析氟伐他汀對胰腺癌細胞MiaPaCa-2和PANC-1基因表達譜的影響，篩選關(guān)鍵通路及核心靶點，將其與氟伐他汀進行分子對接打分，判斷氟伐他汀與核心靶點的結(jié)合活性，為胰腺癌的藥理學(xué)研究提供思路與參考。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)庫和軟件 關(guān)鍵基因篩選涉及的數(shù)據(jù)庫及軟件包括：通過基因芯片公共數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus,GEO)下載數(shù)據(jù)集，應(yīng)用R語言(4.1.1版本)edgeR程序包篩選差異表達的基因、pheatmap程序包繪制熱圖、ggplot2程序包繪制火山圖、VennDiagram程序包繪制共同的差異表達基因韋恩圖、clusterProfiler R包結(jié)合ggplot2程序包進行GO(Gene Ontology)分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析，并繪制柱狀圖展示富集結(jié)果。應(yīng)用Cytoscape軟件(版本3.7.2)中的cytoHubba插件篩選Hub基因，通過Genecards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)獲取基因的基本信息。在分子對接分析中應(yīng)用的數(shù)據(jù)庫和軟件包括：RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫-RCSB PDB(https://www.rcsb.org/pdb/home/sitemap.do)結(jié)合UniProt 數(shù)據(jù)庫查找蛋白質(zhì)分子的三維結(jié)構(gòu)、分辨率和種屬，PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫查找并下載氟伐他汀化學(xué)結(jié)構(gòu)，通過Chem3D 19.0 軟件進行能量最小化處理并轉(zhuǎn)換文件格式，通過Autodock Tools-1.5.6進行分子對接分析,結(jié)合Pymol V2.5.0 軟件進行可視化展示。

1.2 芯片數(shù)據(jù)的來源 從基因芯片公共數(shù)據(jù)庫GEO中下載數(shù)據(jù)集GSE149566(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE149566)。該基因數(shù)據(jù)集由Illumina HiSeq 2000(Homo sapiens)平臺檢測獲得，共8 738個基因。該研究采用20 μM氟伐他汀處理胰腺癌細胞MiaPaCa-2和PANC-1，48 h后提取RNA，并進行mRNA表達譜測序分析。

1.3 差異表達基因的篩選和功能富集分析 根據(jù)|logFC|>1且P<0.05的篩選標準，利用R語言edgeR程序包分別篩選MiaPaCa-2和PANC-1經(jīng)氟伐他汀處理后差異表達的基因。利用pheatmap和ggplot2程序包,分別繪制熱圖和火山圖。將每種細胞的差異表達基因進行可視化展示，并利用韋恩圖尋找兩種胰腺癌細胞共同差異表達基因。利用clusterProfiler R包對篩選出的共同差異表達基因進行GO(Gene Ontology)分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析，并應(yīng)用ggplot2程序包繪制柱狀圖以展示富集結(jié)果。

1.4 關(guān)鍵基因篩選 將本研究篩選得到的共同差異表達基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，進行蛋白-蛋白相互作用(Protein-protein interaction,PPI)分析，篩選條件：互作最大值(Maximum number of interactors)=0，最小互作得分(Minimum required interaction score)≥0.40。將String分析得到的PPI網(wǎng)絡(luò)計算結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件(版本3.7.2)，利用cytoHubba插件篩選出處于網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵位置的Top10 Hub基因，并從Genecards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)獲取這10個Hub基因的基本信息。

1.5 蛋白受體和小分子配體結(jié)構(gòu)準備 在RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫-RCSB PDB(https://www.rcsb.org/pdb/home/sitemap.do)查找蛋白質(zhì)大分子，結(jié)合UniProt 數(shù)據(jù)庫查找蛋白三維結(jié)構(gòu)的分辨率和種屬，在PDB數(shù)據(jù)庫篩選適合的蛋白質(zhì)大分子，并下載.pdb格式文件。通過PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)查找氟伐他汀的基本信息，并保存其三維化學(xué)結(jié)構(gòu)的sdf格式文件。通過Chem3D 19.0 軟件進行能量最小化處理，保存小分子配體為mol2格式。

1.6 分子對接研究 通過Autodock Tools-1.5.6 對氟伐他汀與預(yù)測到的潛在重要作用靶點進行分子對接分析。將從PDB 數(shù)據(jù)庫下載的靶點蛋白的復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)(pdb格式)，導(dǎo)入AutodockTools-1.5.6，對靶蛋白進行去水、加氫和電荷，以及對不完整的殘基進行修飾。進行口袋搜索預(yù)測對接口袋，設(shè)置受體、配體分子以及對接盒子(Grid Box)大小。將氟伐他汀的3D 結(jié)構(gòu)與靶點蛋白依次進行Autogrid 4.0、Autodock 4.0對接計算分析,通過計算結(jié)合能評價結(jié)合作用，結(jié)合能<-7 kcal/mol表明結(jié)合作用良好。大分子蛋白質(zhì)與小分子藥物對接的最優(yōu)構(gòu)象的復(fù)合物以PDBQT 格式導(dǎo)出。最后，通過Pymol V2.5.0 進行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 氟伐他汀處理MiaPaCa-2和PANC-1后差異表達基因的篩選 經(jīng)過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，20 μM氟伐他汀處理胰腺癌細胞MiaPaCa-2和PANC-1 48 h后，MiaPaCa-2細胞共篩選出74個差異表達基因，其中47個mRNA上調(diào)，27個mRNA下調(diào)(圖1A)；PANC-1細胞共篩選出95個差異表達基因，其中70個mRNA上調(diào)，25個mRNA下調(diào)(圖1B)。利用火山圖觀察兩種細胞基因的總體表達情況，用節(jié)點的大小和顏色來表征-log10(pvalue)數(shù)值的大小(見圖1)。

圖1 胰腺癌細胞MiaPaCa-2和PANC-1暴露于氟伐他汀48 h后差異表達基因火山圖注：A.MiaPaCa-2;B.PANC-1

進一步將兩種細胞的差異基因的表達變化利用熱圖(heatmap)分別進行可視化展示(圖2A、圖2B)，其中紅色代表表達量高，藍色代表表達量低。韋恩圖篩選出兩種胰腺癌細胞共同差異表達基因共27個，其中3個mRNA上調(diào)，24個mRNA下調(diào)。

圖2 胰腺癌細胞MiaPaCa-2(A)和PANC-1(B)暴露于氟伐他汀48 h后差異表達基因的聚類熱圖和韋恩圖注：A.MiaPaCa-2細胞；B.PANC-1細胞；C.差異表達基因韋恩圖

2.2 功能富集分析和關(guān)鍵靶點篩選 利用clusterProfiler R包對篩選出的共同差異表達基因進行GO分析和KEGG分析，并應(yīng)用ggplot2程序包繪制柱狀圖以展示富集結(jié)果。如圖3所示，20 μM氟伐他汀處理48 h后，兩種細胞共同差異基因的生物學(xué)途徑(Biological process，BP)主要涉及DNA復(fù)制、染色體分離等，說明氟伐他汀可能抑制促癌基因的合成；KEGG通路富集分析顯示，27個共同差異基因主要與嘧啶代謝、p53信號通路、核苷酸代謝和細胞周期等相關(guān)(見圖3)，說明氟伐他汀可能通過這些通路抑制胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。利用String數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件(版本3.8.2)對27個共有的差異基因進行PPI分析(圖3B)；應(yīng)用Cytoscape軟件中的cytoHubba插件篩選出的Top 10 hub基因如圖3C所示，即MCM10、KIF14、CDC45、NCAPH、EXO1、DLGAP5、NUF2、PBK、MKI67和RRM2，圖中顏色的深淺代表該蛋白在網(wǎng)絡(luò)中的作用關(guān)鍵程度。應(yīng)用Genecards數(shù)據(jù)庫獲取這10個Hub基因的基本信息(見表1)，發(fā)現(xiàn)這10個關(guān)鍵基因涉及DNA復(fù)制、DNA錯配修復(fù)與重組、染色體凝縮、胞質(zhì)分裂等細胞周期與細胞增殖的作用。

圖3 差異表達基因的功能富集分析和關(guān)鍵靶點篩選注：A.KEGG和BP分析；B.蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖；C.Top 10關(guān)鍵基因

表1 Top 10 Hub基因的基本信息

2.3 分子對接結(jié)果 上述篩選出的10個關(guān)鍵靶點與氟伐他汀對接的構(gòu)象結(jié)果見圖4，由于DLGAP5無蛋白晶體結(jié)構(gòu)，NCAPH為單鏈線性結(jié)構(gòu)，無法形成活性口袋，故未納入對接。結(jié)果顯示，大部分蛋白靶點與氟伐他汀主要以氫鍵形式結(jié)合，其中氟伐他汀與EXO1蛋白結(jié)合的親和力為-7.9 kcal/mol，EXO1蛋白中的CYS80、THR81、LEU82、LYS85和GLU150這5個氨基酸與氟伐他汀形成5個氫鍵，此外加上疏水作用，以及π-π共軛作用，使得兩者對接的能量數(shù)值較小。分子對接結(jié)果認為score 值<-7 kcal/mol，配體與受體結(jié)合的親和力大，配體受體具有較強的結(jié)合活性，構(gòu)象更為穩(wěn)定。此外，MCM10和CDC45這兩個蛋白的對接能量值也很低，分別為-7.6、-7.5 kcal/mol，分別形成4個和5個氫鍵。對接的詳細信息見表2。

在這8個蛋白中，EXO1、MCM10、CDC45和KIF14對接的能量值<-7 kcal/mol，提示這幾個蛋白很有可能是氟伐他汀作用的關(guān)鍵靶點。

圖4 氟伐他汀與預(yù)測到的8個潛在的關(guān)鍵靶點對接示意圖

表2 氟伐他汀與潛在的關(guān)鍵靶點對接分析結(jié)果

3 討論

他汀類藥物是一類HMG-CoA還原酶抑制劑，通過競爭性抑制甲羥戊酸代謝途徑抑制甲羥戊酸及其下游產(chǎn)物的生成，影響胞膜完整性、蛋白合成以及細胞周期等諸多生物學(xué)功能，抑制腫瘤細胞的生長、增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移等[9]，在胰腺癌的治療或預(yù)防方面具有應(yīng)用前景。

本研究通過對胰腺癌細胞MiaPaCa-2和PANC-1 mRNA表達譜進行數(shù)據(jù)挖掘與分析，發(fā)現(xiàn)與氟伐他汀相關(guān)的共同差異基因主要與DNA復(fù)制、細胞有絲分裂等生物學(xué)途徑密切相關(guān)，涉及p53信號通路、嘧啶代謝和細胞周期等通路，這與Chen等[4]和Gbelcová等[10]的研究結(jié)果基本一致。p53是一種重要的抑癌基因，其編碼蛋白p53通過多種機制參與調(diào)節(jié)細胞生長和凋亡、DNA修復(fù)以及細胞周期等[11]，突變型p53與肝癌、胰腺癌、乳腺癌等多種腫瘤相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，突變型p53的穩(wěn)定性與甲羥戊酸代謝途徑中的中間產(chǎn)物甲羥戊酸-5-磷酸酯有關(guān)[12]，他汀類藥物可通過抑制甲羥戊酸代謝途徑或激活LKB1-AMPK-p38MAPK-p53-survivin信號通路抑制腫瘤增殖[13]。嘧啶是DNA復(fù)制和RNA合成的重要分子，其代謝過程十分復(fù)雜，包括核苷的回收、從頭合成以及催化降解等，在細胞增殖、腫瘤分化以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等均發(fā)揮著重要作用，嘧啶代謝異常與諸多癌癥密切相關(guān)[14]，然而目前尚未發(fā)現(xiàn)文獻報道他汀類藥物對嘧啶代謝的影響。此外，Huang等[15]通過對2 142例胰腺導(dǎo)管腺癌患者的病歷資料進行回顧性分析，發(fā)現(xiàn)辛伐他汀和阿托伐他汀能夠降低胰腺癌的死亡率，國內(nèi)外其他學(xué)者也有相同發(fā)現(xiàn)[16-17]。由此可見，在治療方面，他汀類藥物對胰腺癌的治療作用是確切的，然而在預(yù)防方面，對于他汀類藥物是否能夠降低胰腺癌的發(fā)生風(fēng)險仍存在爭議[18-19]，需進一步研究。

差異基因相互作用網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20 μM氟伐他汀處理48 h后，MiaPaCa-2和PANC-1兩種細胞中EXO1(核酸外切酶1)的表達均顯著下調(diào)。已有研究顯示，EXO1是胰腺癌易感性的潛在候選基因[20]。EXO1的DNA錯配修復(fù)可以作為胰腺癌患者總體生存的重要預(yù)測因子，是臨床胰腺癌放化療反應(yīng)的潛在預(yù)測指標[21]。本研究通過關(guān)鍵靶點預(yù)測到EXO1蛋白，分子對接結(jié)果發(fā)現(xiàn)氟伐他汀與EXO1蛋白結(jié)合的親和力較強，可能是氟伐他汀發(fā)揮抑制胰腺癌作用的重要靶點，目前暫未發(fā)現(xiàn)氟伐他汀和EXO1相關(guān)性的研究，關(guān)于兩者的作用機制有待進一步探索。

此外，MCM10(微染色體維持蛋10)和CDC45(細胞分裂周期45)也是預(yù)測到的關(guān)鍵靶點且與氟伐他汀具有較強的親和力。CDC45與GINS、MCM2-7形成CMG解旋酶，MCM10可通過與單鏈或雙鏈DNA直接作用激活其活性，參與起始DNA復(fù)制以及延伸。MCM10過表達可使細胞擺脫周期控制,致使DNA無限復(fù)制，可作為腫瘤預(yù)后生物標志物或潛在治療靶點[22-23]，然而目前尚無文獻報道MCM10在胰腺癌中的作用。此外，氟伐他汀還能夠下調(diào)KIF14(驅(qū)動蛋白家族成員14)、NCAPH(非SMC凝集蛋白1復(fù)合物亞基H)和細胞分裂相關(guān)基因NUF2的表達，這些基因參與染色體的凝縮、分離與穩(wěn)定，其異常表達均可誘發(fā)腫瘤的形成[24-26]。KIF14是一種新發(fā)現(xiàn)的驅(qū)動蛋白超家族成員，其異常表達可導(dǎo)致基因缺失、染色體易位或重復(fù)、雙核或多核細胞形成。多項研究均發(fā)現(xiàn)，KIF14與胰腺導(dǎo)管腺癌患者的總生存期相關(guān)，能夠預(yù)測胰腺癌的進展和預(yù)后，可作為潛在的治療靶點[27-29]。NCAPH是凝縮蛋白中真正發(fā)揮作用的亞基，參與維持染色體的穩(wěn)定和凝縮。NCAPH在胰腺癌臨床樣本和細胞中過表達，當其表達降低時，細胞克隆的形成和增殖受到抑制，細胞周期阻滯在S和G2/M期，激活caspase-3和PARP裂解并啟動凋亡程序[30]。此外，氟伐他汀能夠下調(diào)DLGAP5、PBK、MKI67和RRM2的表達，這些基因涉及DNA的錯配修復(fù)和細胞周期的調(diào)節(jié)。

盡管包含虛擬篩選在內(nèi)的分子對接不可避免地會產(chǎn)生假陽性和假陰性，多種因素例如由配體結(jié)合引起的微小蛋白質(zhì)構(gòu)象變化也可能影響對接結(jié)果的質(zhì)量，但綜合大量文獻驗證結(jié)果，發(fā)現(xiàn)分子對接對于預(yù)測或者驗證小分子化合物與蛋白大分子或者蛋白大分子之間的作用具有重要的作用，將小分子“?？俊钡酱蠓肿影袠私Y(jié)構(gòu)中，并對其與結(jié)合位點的潛在互補性進行"評分"的計算方法被廣泛用于靶點確認和先導(dǎo)化合物的優(yōu)化[31]。目前,分子對接除了主要用于虛擬篩選預(yù)測與靶點結(jié)合的潛在藥物分子外，在基于藥物小分子的靶點預(yù)測方面也發(fā)揮著不可或缺的作用，尤其是目前對單獨的中藥或者中藥處方體內(nèi)藥物靶點預(yù)測應(yīng)用較多[32-33]。徐朦等[32]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和AutoduckTools分子對接方法，篩選到益氣解毒方對治療肝癌起關(guān)鍵作用的DDX5和HNRNPK等8個核心基因；田薇等[33]結(jié)合AutoduckTools分子對接方法，預(yù)測β-谷甾醇、豆甾醇、金合歡素可能是板藍根發(fā)揮藥效的主要活性成分，CASP3、PTGS2和TNF 等蛋白可能是板藍根發(fā)揮抑菌作用的關(guān)鍵靶點。由此可知，分子對接在藥物篩選和靶點預(yù)測中具有重要的作用。

上述研究結(jié)果表明，氟伐他汀能夠影響胰腺癌MiaPaCa-2和PANC-1細胞基因表達譜，共同差異表達基因主要涉及嘧啶代謝、P53信號通路、核苷酸代謝和細胞周期等通路，分子對接結(jié)果提示EXO1、MCM10、CDC45和KIF14這幾個蛋白很有可能是氟伐他汀作用的關(guān)鍵靶點。本研究為他汀類藥物用于胰腺癌的治療提供分子生物學(xué)上的理論依據(jù)。然而，本課題未進行相應(yīng)分子生物學(xué)實驗的驗證，具有一定的局限性，后續(xù)我們將進行進一步的機制探究。