CRISPR/Cas9靶向敲除番茄SNAC4/9突變體的構(gòu)建、鑒定及分析

馮 源 劉燁方 寇曉虹 薛照輝

（天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300350）

果實(shí)成熟是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，受內(nèi)外因素的共同影響。在轉(zhuǎn)錄水平上，果實(shí)成熟受多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)，乙烯響應(yīng)因子（ethylene response factor，ERF）［3］、鋅指型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（WRKY）、含有高度保守的DNA結(jié)合區(qū)-MYB結(jié)構(gòu)域的一類轉(zhuǎn)錄因子（v-Myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog，MYB）、堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）、NAC（NAM、ATAF1/2、CUC2）等轉(zhuǎn)錄因子在果實(shí)成熟過(guò)程中顯著激活［4］。其中NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育、果實(shí)成熟和植株衰老等過(guò)程中發(fā)揮重要作用［5-7］。NOR-like1直接與乙烯生物合成、顏色變化和胞壁代謝基因的啟動(dòng)子結(jié)合，并正向調(diào)控上述基因的 表 達(dá)［8］。SlNAC1抑 制SlACS2、SlACS4、SlACO1和SlPSY1的表達(dá)，通過(guò)乙烯和脫落酸（abscisic acid，ABA）依賴途徑調(diào)控番茄果實(shí)成熟［9］。Kou等［10］從NAC家族中分離出與番茄成熟相關(guān)的SNAC4/9基因；還有研究表明SNAC4和SNAC9可以直接結(jié)合在ACS2、ACS4的啟動(dòng)子上，SNAC4/9在蛋白水平上與ABA和乙烯相關(guān)基因（SAPK3、SlPYL9、SlAREB1、SlACS2和SlACO1）存在互作，可能協(xié)同調(diào)控果實(shí)成熟［11］。SNAC4/9與植物激素互作，成為番茄果實(shí)成熟調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一部分［12-13］。

基因組編輯技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)一個(gè)或多個(gè)目的基因的敲除，也可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控目的基因的表達(dá)［14-15］。CRISPR/Cas9技術(shù)是在大腸桿菌的基因組中發(fā)現(xiàn)的，能在體內(nèi)精確地定向修改DNA序列，產(chǎn)生特異性突變并于2014年應(yīng)用于園藝作物［16］。CRISPR/Cas9技術(shù)目前已成功應(yīng)用于番茄、擬南芥和水稻等作物以誘導(dǎo)有價(jià)值的性狀［15，17］，在番茄中的應(yīng)用主要集中在果實(shí)品質(zhì)提高、品種馴化以及對(duì)生物和非生物脅迫抗性等方面［18］。

目前已經(jīng)成功鑒定了一些CRISPR/Cas9介導(dǎo)的番茄成熟調(diào)控突變體［19］。Li等［20］利用該技術(shù)研究了長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA1459）番茄功能缺失突變體，發(fā)現(xiàn)乙烯產(chǎn)生和番茄紅素積累受到顯著抑制。Ito等［21］應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)證實(shí)了RIN對(duì)果實(shí)完全成熟的重 要 性。Gao等［22］利 用CRISPR/Cas9技 術(shù) 獲 得 了SlNAM1缺陷型突變體，發(fā)現(xiàn)SlNAM1通過(guò)調(diào)節(jié)乙烯生物合成正向調(diào)節(jié)番茄果實(shí)成熟的開(kāi)始。Gao等［8］發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9-NOR-like1敲 除 和VIGS-NOR-like1沉默的番茄果實(shí)中番茄紅素積累降低，成熟延遲。天津大學(xué)化工學(xué)院果實(shí)品質(zhì)生物學(xué)課題組前期利用VIGS技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)沉默SNAC4/9基因?qū)е路压麑?shí)中的ABA含量和果實(shí)軟化速率呈現(xiàn)相反的變化規(guī)律［23］，推測(cè)SNAC4/9可能從不同的路徑調(diào)控番茄果實(shí)成熟，進(jìn)而導(dǎo)致硬度和激素含量出現(xiàn)差異，深入研究需要獲得遺傳穩(wěn)定、多靶點(diǎn)的突變體材料。

本研究利用多靶點(diǎn)CRISPR/Cas9基因高效編輯系統(tǒng)構(gòu)建SNAC4/9單基因和雙基因敲除番茄突變體，T0和T1代種植收獲后，對(duì)靶修飾位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，解析CRISPR/Cas9技術(shù)定點(diǎn)編輯后敲除靶點(diǎn)的遺傳穩(wěn)定性和差異性，對(duì)敲除成功的植株和果實(shí)進(jìn)行分析，旨在為深入探究SNAC4/9調(diào)控番茄果實(shí)成熟的機(jī)制和構(gòu)建協(xié)同調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供科學(xué)依據(jù)和典型突變體材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料Micro-Tom品種番茄，保存于天津大學(xué)化工學(xué)院果實(shí)品質(zhì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒中間載體pYLgRNA和雙元載體pYLCRISPR/Cas9Pubi-H由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光課題組惠贈(zèng)；大腸感受態(tài)細(xì)胞DH10B和農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1SNAC4/9單靶點(diǎn)、雙靶點(diǎn)和多靶點(diǎn)的CRISPR載體構(gòu)建采用在線軟件CRISPR-GE（http：//skl.scau.edu.cn/home/）和CRISPR-P 2.0（http：//crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/）設(shè)計(jì)靶點(diǎn)?；罨衟YLCRISPR/Cas9Pubi-H載體的甘油菌和含有pYLgRNA中間載體的甘油菌，通過(guò)無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）和質(zhì)粒小提試劑盒（全式金生物技術(shù)股份有限公司，北京）提取質(zhì)粒。檢測(cè)質(zhì)粒質(zhì)量和BsaI限制性內(nèi)切酶活性［18］。采用帶有靶序列的引物（靶點(diǎn)引物U#-T#和gR-T#），利用重疊聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（overlapping PCR）法，將靶點(diǎn)引入至啟動(dòng)子和sgRNA骨架之間，構(gòu)成sgRNA表達(dá)盒（圖1）。主要通過(guò)兩輪PCR反應(yīng)［18］實(shí)現(xiàn)sgRNA表達(dá)盒的構(gòu)建（圖4-A）（引物見(jiàn)表1），反應(yīng)結(jié)束后，分別用瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物。采用金門分子（golden gate）克隆方法，將多個(gè)sgRNA表達(dá)盒以邊切邊連的形式克隆至pYLCRISPR/Cas9載體中（圖4-A）。將載體分別轉(zhuǎn)入DH10B和GV3101后，挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落，于3 mL含相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基中，于37℃（大腸）或28℃（農(nóng)桿菌）、180 r·min-1條件下培養(yǎng)至液體渾濁。取菌液進(jìn)行PCR反應(yīng)，體系程序參考文獻(xiàn)［18］。將經(jīng)菌液PCR鑒定后條帶大小符合預(yù)期的載體菌株進(jìn)行測(cè)序，采用引物SP-R和U#-T1檢測(cè)載體中第一個(gè)靶點(diǎn)，采用引物gR-T1和U#-T2檢測(cè)第二個(gè)靶點(diǎn)（圖2），以此類推，采用引物gR-Tn和SP-L1檢測(cè)最后一個(gè)靶點(diǎn)。

圖1 pYLgRNA和sgRNA表達(dá)盒示意圖Fig.1 Schematic diagram of pYLgRNA and sgRNA expression cassettes

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

表1 （續(xù)）

圖2 載體中靶點(diǎn)檢測(cè)策略Fig.2 Strategy for target sequencing in the construct

1.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄遺傳轉(zhuǎn)化選取SNAC4基因編輯載體（5號(hào)）和雙基因編輯載體（15號(hào)）委托陜西博瑞德生物科技有限公司進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，選取SNAC4基因編輯載體（11號(hào)）、SNAC9基因編輯載體（14號(hào)）和雙基因編輯載體（16號(hào)）委托武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化成功后，采用TransDirect Plant Tissue PCR Kit試劑盒（全式金生物技術(shù)股份有限公司，北京）以及Cas9基因特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，篩選陽(yáng)性植株。

1.2.3 突變體鑒定及脫靶位點(diǎn)檢測(cè)在每個(gè)靶點(diǎn)上下游100～300 bp處設(shè)計(jì)特異性引物（表2），用2×Rapid Taq Master Mix擴(kuò)增帶有靶序列的片段，PCR產(chǎn)物膠回收純化后，進(jìn)行Sanger測(cè)序，利用ContigExpress 9.1.0.424和DSDecodeM（http：//skl.scau.edu.cn/dsdecode/）軟件分析測(cè)序結(jié)果。將PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果解碼失敗的片段連T載體測(cè)序。利用CRISPR-P和CRISPR-GE進(jìn)行脫靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)，每個(gè)靶點(diǎn)選取脫靶分?jǐn)?shù)較高、位于基因區(qū)的2個(gè)脫靶位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。

表2 T0代靶點(diǎn)擴(kuò)增和測(cè)序引物Table 2 Primers used for targets amplification and sequencing in T0generation

2 結(jié)果與分析

2.1 SNAC4/9-CRISPR/Cas載體的構(gòu)建

為研究不同靶點(diǎn)的剪切效率以及構(gòu)建多靶點(diǎn)載體，在SNAC4的第一、第二外顯子區(qū)和SNAC9的3個(gè)外顯子區(qū)均設(shè)計(jì)了靶點(diǎn)（圖3）。在SNAC4/9基因的編碼區(qū)（coding sequence，CDS）分別設(shè)計(jì)了5和6個(gè)靶點(diǎn)（表3）。SNAC4靶點(diǎn)命名為4T1～4T5，SNAC9靶點(diǎn)命名為9T1～9T6。

表3 SNAC4/9靶點(diǎn)信息Table 3 Information of SNAC4/9 targets

圖3 SNAC4/9基因序列上的靶點(diǎn)分布Fig.3 Targets distribution on SNAC4/9 gene sequence

選取4T1～4T5和9T1～9T5靶點(diǎn)分別構(gòu)建10個(gè)單基因單靶點(diǎn)載體；組合靶點(diǎn)4T1/4T3、4T3/4T5、9T1/9T4和9T4/9T5分別構(gòu)建單基因雙靶點(diǎn)載體；組合靶點(diǎn)4T1/9T2和4T2/9T3分別構(gòu)建雙基因雙靶點(diǎn)載體；組合靶點(diǎn)4T1/4T5/9T6/9T5構(gòu)建雙基因四靶點(diǎn)載體（圖4-A）。由電泳結(jié)果（圖4-B）可知，pYLCRISPR/Cas9Pubi-H質(zhì)粒經(jīng)BsaI酶消化后，產(chǎn)物為2個(gè)線性化片段，分別為15 731和689 bp。pYLgRNA中間質(zhì)粒上存在3個(gè)BsaI酶切位點(diǎn)，酶切產(chǎn)物為3個(gè)線性化片段。從pYLsgRNAAtU3d/LacZ質(zhì)粒擴(kuò)增獲得單靶點(diǎn)載體的sgRNA表達(dá)盒以及雙靶點(diǎn)載體的第一個(gè)sgRNA表達(dá)盒（圖1），從pYLsgRNA-AtU3d質(zhì)粒擴(kuò)增獲得雙靶點(diǎn)載體的第二個(gè)sgRNA表達(dá)盒。啟動(dòng)子和靶點(diǎn)確定后，CRISPR-GE軟件可直接生成帶有靶點(diǎn)的引物U#-T#和gR-T#，用于第一輪PCR反應(yīng)。驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，各泳道均可見(jiàn)2條較為明亮的條帶，為第一輪PCR反應(yīng)的兩個(gè)產(chǎn)物（圖4-C）。第二輪PCR反應(yīng)后，單靶點(diǎn)載體的LacZ-AtU3dsgRNA表達(dá)盒條帶大小與預(yù)期的495 bp相符（圖4-D），雙靶點(diǎn)載體的LacZ-AtU3d-sgRNA表達(dá)盒和AtU3dsgRNA表達(dá)盒的條帶大小分別與預(yù)期的490和289 bp相符（圖4-E）。

圖4 SNAC4/9-CRISPR/Cas載體的構(gòu)建Fig.4 Construction of SNAC4/9-CRISPR/Cas vector

將純化后的表達(dá)盒與pYLCRISPR/Cas9Pubi-H質(zhì)粒進(jìn)行酶切連接反應(yīng)，使表達(dá)盒組裝至CRISPR/Cas9載體。陽(yáng)性克隆鑒定分析以LacZ-AtU3d-4T1-AtU3d-4T3-CRISPR載體為例（圖5）。菌液組條帶大小與預(yù)期的447、274和188 bp相符，對(duì)照組無(wú)條帶，表明連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成功（圖5-A）。由BLAST分析可知，CRISPR/Cas9載體中連入的兩個(gè)sgRNA表達(dá)盒測(cè)序結(jié)果與參考序列完全一致（圖5-B），載體構(gòu)建成功。其余9個(gè)單靶點(diǎn)載體、4個(gè)雙靶點(diǎn)載體和1個(gè)四靶點(diǎn)載體經(jīng)菌液PCR檢測(cè)和Sanger測(cè)序，確定構(gòu)建成功。進(jìn)一步轉(zhuǎn)化GV3101農(nóng)桿菌，菌液PCR檢測(cè)，鑒定陽(yáng)性克隆。雙靶點(diǎn)載體和兩個(gè)單靶點(diǎn)載體的檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，單克隆1和2的兩條帶大小均與預(yù)期的447和188 bp相符，單克隆3的三條帶大小均與預(yù)期的447、274和188 bp相符，表明質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌成功，且表達(dá)盒結(jié)構(gòu)在農(nóng)桿菌中未發(fā)生變化。綜上，本研究成功構(gòu)建了15個(gè)CRISPR/Cas9基因編輯載體（表4）。

表4 載體信息匯總表Table 4 The information of vectors

圖5 LacZ-AtU3d-4T1-AtU3d-4T3-CRISPR載體轉(zhuǎn)化DH10B的陽(yáng)性克隆鑒定Fig.5 Identification of DH10B positive clone transformed with LacZ-AtU3d-4T1-AtU3d-4T3-CRISPR vector

圖6 LacZ-AtU3d-4T1-AtU3d-4T3-CRISPR載體轉(zhuǎn)化GV3101的陽(yáng)性克隆鑒定Fig.6 Identification of GV3101 positive clone transformed with LacZ-AtU3d-4T1-AtU3d-4T3-CRISPR vector

2.2 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗的獲得

以5號(hào)載體為例，番茄子葉作為外植體，與載體農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生愈傷組織，再經(jīng)分化培養(yǎng)長(zhǎng)出再生芽，進(jìn)而生根形成幼苗（圖7）。對(duì)生根后的幼苗葉片進(jìn)行Cas9基因PCR檢測(cè)。載體轉(zhuǎn)化成功的陽(yáng)性苗PCR產(chǎn)物大小為572 bp。5號(hào)載體轉(zhuǎn)化番茄共得到12株陽(yáng)性苗（圖8）。11、14、15和16號(hào)載體轉(zhuǎn)化的番茄株系分別獲得16、15、12和14株陽(yáng)性苗。

圖7 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄遺傳轉(zhuǎn)化Fig.7 Tomato transformation by Agrobacterium

圖8 陽(yáng)性苗檢測(cè)Fig.8 The identification of positive transgenic plants

2.3 靶位點(diǎn)序列突變類型分析

兩條染色體突變結(jié)果相同代表純合突變。將靶點(diǎn)測(cè)序結(jié)果與野生型序列（wild type，WT）比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建的CRISPR/Cas9載體在PAM基序上游約3 bp處進(jìn)行剪切，產(chǎn)生多種類型的突變體（圖9）。具體基因突變類型為單個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)的缺失、替換和插入。例如，在5號(hào)載體轉(zhuǎn)化的12株陽(yáng)性苗中，有3株不同數(shù)量堿基對(duì)缺失的純合子5（SNAC4）-8、5（SNAC4）-9和5（SNAC4）-11，1株雙等位基因突變體5（SNAC4）-12，7株嵌合體。特別是，14（SNAC9）-20和14（SNAC9）-57突變體的9T4靶點(diǎn)發(fā)生了大片段序列的缺失。5、11、14和16號(hào)載體在番茄植株體內(nèi)編輯后分別產(chǎn)生11、7、9和7株突變體。16號(hào)雙基因編輯載體產(chǎn)生的7株突變體中，16（SNAC9）-20號(hào)為雙基因突變體。

圖9 載體轉(zhuǎn)化陽(yáng)性苗的部分測(cè)序結(jié)果Fig.9 Partial sequencing results of positive seedlings

2.4 脫靶位點(diǎn)的檢測(cè)

為保證突變苗相對(duì)于對(duì)照苗的差異由目的基因被編輯引起，隨機(jī)選取了靶點(diǎn)被成功編輯的突變苗進(jìn)行突變靶點(diǎn)的2個(gè)可能脫靶位點(diǎn)檢測(cè)（表5）。結(jié)果表明，SNAC4靶點(diǎn)（4T2/4T3/4T5）和SNAC9靶點(diǎn)（9T3/9T4/9T5）的可能脫靶位點(diǎn)均未被編輯，說(shuō)明構(gòu)建的CRISPR/Cas9載體系統(tǒng)在番茄中具有較高的特異性。

表5 可能的脫靶位點(diǎn)檢測(cè)Table 5 Detection of mutations on putative off-target sites

2.5 T0代突變體果實(shí)表型鑒定

觀察破色期（breaker，B）至破色后19 d（B+19）果實(shí)的表型（圖10）發(fā)現(xiàn)，由B+3至B+19時(shí)期，對(duì)照果實(shí)由黃轉(zhuǎn)紅，而各突變體的果實(shí)顏色由黃變橙，對(duì)照果實(shí)不同成熟時(shí)期的顏色明顯深于突變體，表明SNAC4/9基因的敲除影響果實(shí)中番茄紅素的積累。在B+10時(shí)期，對(duì)照果實(shí)處于完全成熟狀態(tài)呈深紅色，而敲除果實(shí)呈橙色，且后期顏色并未加深，表明敲除番茄中SNAC4或SNAC9基因?qū)е路压麑?shí)不能完全成熟。此外，本研究發(fā)現(xiàn)16-20雙基因敲除果實(shí)在B+3時(shí)期的顏色明顯黃于其他4種突變體和對(duì)照組，推測(cè)SNAC4/9調(diào)控類胡蘿卜素代謝機(jī)制不同，導(dǎo)致SNAC4/9雙基因敲除對(duì)果實(shí)色素積累的影響更大。

圖10 T0代突變體果實(shí)不同成熟時(shí)期表型Fig.10 Phenotypes of T0mutant fruits during different ripening stages

2.6 篩選CRISPR-SNAC4/9-T1代番茄穩(wěn)定遺傳株系

T0代突變體收種后，擬篩選穩(wěn)定遺傳的SNAC4/9基因敲除突變體進(jìn)行分析。通過(guò)比較T0代果實(shí)種子數(shù)量發(fā)現(xiàn)，CRISPR-SNAC9#13-3、13-5、14-57、14-61的種子數(shù)量較多（圖11）。通過(guò)比較T0代果實(shí)種子大小發(fā)現(xiàn)，CRISPR-SNAC4種子略小于野生型，飽滿度低 于WT和CRISPR-SNAC9#13-3/5組；CRISPRSNAC9#14-57組種子小于野生型，飽滿度更低。挑選SNAC4基因編輯載體（5和16號(hào)）的T0代突變體（5-11、5-12、16-22）和SNAC9基因編輯載體（13和14號(hào)）的T0代突變體（13-3、14-57、14-61）的種子進(jìn)行種植，獲得了SNAC4/9-T1代敲除突變體，統(tǒng)計(jì)不同種子的發(fā)芽率、結(jié)實(shí)率和植株生長(zhǎng)情況，篩選發(fā)芽率高、穩(wěn)定遺傳的植株及果實(shí)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，WT種子的發(fā)芽率為86.67%，13-3的發(fā)芽率為92.59%，CRISPR-SNAC4種子的發(fā)芽率較低，CRISPR-SNAC9-13種子的發(fā)芽率最高。說(shuō)明SNAC4/9基因的敲除在不同程度上影響種子形態(tài)和發(fā)芽率，不同載體之間也存在差異。

圖11 T0代番茄果實(shí)種子Fig.11 Seeds of T0generation tomato fruit

對(duì)5株T1代CRISPR-SNAC4突 變 體 和32株CRISPR-SNAC9突變體進(jìn)行鑒定。比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)（圖12），5（SNAC4）-11-1（簡(jiǎn)作5-11，下同）植株中有2株為純合突變，具體突變?yōu)?個(gè)堿基對(duì)的缺失。16-22雜合子的2株后代被鑒定為純合突變，具體突變?yōu)?個(gè)堿基對(duì)的插入。13號(hào)載體中，共成活29株植株，有23株突變體被鑒定為純合突變，其中，有10株為雙靶點(diǎn)突變，值得注意的是，13-3后代的9T1和9T4靶點(diǎn)發(fā)生了大片段序列的缺失。14號(hào)載體中，有3株植株被鑒定為純合突變，其中，14-57-1的T4靶點(diǎn)發(fā)生了41 bp的缺失，T5靶點(diǎn)發(fā)生了1個(gè)堿基對(duì)的插入；14-61-1具體突變?yōu)?T5靶點(diǎn)，有1個(gè)堿基對(duì)的插入；14-61-2具體突變?yōu)?T4靶點(diǎn)，有1個(gè)堿基對(duì)的缺失。其中，編號(hào)14-57-1、13-3-1、13-3-6、13-3-7、13-3-8、13-3-9、13-3-17、13-3-18、13-3-19、13-3-23、13-3-27為雙靶點(diǎn)突變。說(shuō)明CRISPR/Cas9基因編輯番茄的靶修飾位點(diǎn)在代際之間得到了穩(wěn)定遺傳。

圖12 T1代突變體測(cè)序結(jié)果Fig.12 Sequencing results of T1generation mutants

T1代轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)發(fā)育及開(kāi)花坐果如圖13所示。野生型果實(shí)于花后17 d結(jié)果，40 d破色，CRISPR-SNAC4/9敲除果實(shí)的結(jié)果期和破色期均比野生型晚，且顏色變化緩慢。CRISPR-SNAC9突變體的坐果率小于野生型；與CRISPR-SNAC9突變體相比，CRISPR-SNAC4發(fā)芽率和結(jié)實(shí)率低，說(shuō)明SNAC4對(duì)植株長(zhǎng)勢(shì)的影響更大。推測(cè)SNAC4/9可能通過(guò)影響植株生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)而影響坐果和果實(shí)成熟。對(duì)比果實(shí)表型，可以看出SNAC4/9的敲除延緩了果實(shí)成熟。B+12時(shí)期WT果實(shí)已明顯紅變，SNAC4敲除果實(shí)呈黃色，SNAC9敲除果實(shí)呈橙色。表明SNAC4/9基因的敲除影響果實(shí)中類胡蘿卜素代謝。

圖13 T1代CRISPR-SNAC4、CRISPR-SNAC9和野生型植株表型Fig.13 T1 generation CRISPR-SNAC4，CRISPR-SNAC9 and WT plant phenotypes

3 討論

本研究通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)敲除番茄SNAC4/9，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)傳遞Cas9核酸酶和sgRNA進(jìn)入番茄細(xì)胞，部分植株實(shí)現(xiàn)了SNAC4/9基因靶點(diǎn)的DNA堿基或片段的缺失、替換和插入（圖9）。sgRNA的序列、高級(jí)結(jié)構(gòu)以及表達(dá)方式對(duì)CRISPR/Cas9的基因編輯效率有顯著影響［24-26］，本研究選擇了能形成完整、穩(wěn)定的sgRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的靶點(diǎn)，包含莖環(huán)RAR、莖環(huán)1和莖環(huán)2（圖14），T0代植株的編輯效率達(dá)到49.27%，但純合突變率還有待提高（圖15）。目前有許多關(guān)于優(yōu)化sgRNA和Cas蛋白啟動(dòng)子的研究，提出了提高基因打靶效率的新方法［27］。如Yang等［28］使用附加型sgRNA質(zhì)粒和穩(wěn)定的整合Cas9調(diào)整了CRISPR/Cas9系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了100%的基因組編輯效率。未來(lái)可以嘗試CRISPR/Cas9系統(tǒng)優(yōu)化的新技術(shù)，提高基因敲除效率。

圖14 4T1靶點(diǎn)形成的sgRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)圖Fig.14 Secondary structure of sgRNA with 4T1

通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，本研究共獲得T0代SNAC4基 因 突 變 體24株，SNAC9基 因 突 變 體21株，SNAC4/9雙基因突變體1株。不同靶點(diǎn)的編輯效率存在差異（圖15-A），4T5和9T5靶點(diǎn)具有較高的純合突變率；4T5的靶點(diǎn)突變率最高，高達(dá)91.7%；4株T1代SNAC4和26株SNAC9突變體均為純合突變（圖15-B）。T1代13-3中10株番茄的9T1靶點(diǎn)突變，突變率為34.48%；9T4靶點(diǎn)突變23株，突變率為79.31%，9T4靶點(diǎn)突變率較高。而且從發(fā)芽率看，T1代CRISPR-SNAC9-13植株的發(fā)芽率比野生型高出5.92%。故篩選13-3為穩(wěn)定遺傳株系作為后續(xù)重點(diǎn)研究材料。特別是，16-22株系為雜合子，T0代編輯效率為50%，其T1代株系均為純合子，說(shuō)明4T2靶點(diǎn)在代際之間可以穩(wěn)定遺傳。來(lái)源于純合突變體T0-5-11的所有后代群體的靶修飾位點(diǎn)序列都與親代保持一致；在雙靶點(diǎn)編輯T0-13-3的后代中，T1靶點(diǎn)突變均為32個(gè)堿基的缺失，而T4靶點(diǎn)突變植株中，有18株是9 bp的缺失，和T0代相同；有4株是41 bp的缺失，除靶點(diǎn)之外還有其他堿基的突變。說(shuō)明CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯后的突變序列在代際之間穩(wěn)定遺傳可能與靶點(diǎn)有關(guān)，基因序列不同位點(diǎn)的突變對(duì)相應(yīng)蛋白功能的影響存在差異，后續(xù)將比較不同靶點(diǎn)的敲除對(duì)番茄成熟的影響，進(jìn)一步闡明遺傳穩(wěn)定性與靶點(diǎn)之間的規(guī)律性。

圖15 各靶點(diǎn)突變類型Fig.15 Specific types of each target

本研究通過(guò)分析T1代番茄突變果實(shí)發(fā)現(xiàn)，SNAC4/9基因的敲除影響果實(shí)中類胡蘿卜素代謝（圖13），SNAC4敲除后的果實(shí)比SNAC9敲除后的成熟進(jìn)程更加緩慢，研究結(jié)果印證了課題組前期利用VIGS技術(shù)沉默SNAC4/9的研究結(jié)果［23］，表明了SNAC4/9調(diào)控番茄果實(shí)色素代謝的差異性。此外，研究中發(fā)現(xiàn)不同突變體植株呈現(xiàn)出對(duì)病蟲(chóng)害的抗逆差異性，后續(xù)可以基于不同靶點(diǎn)SNAC4/9基因編輯番茄材料開(kāi)展SNAC4/9調(diào)控番茄抗逆性等方面的系統(tǒng)研究。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除番茄SNAC4/9基因。成功構(gòu)建單靶點(diǎn)和多靶點(diǎn)載體，遺傳轉(zhuǎn)化后獲得陽(yáng)性苗，結(jié)合突變株系的序列分析結(jié)果及潛在脫靶位點(diǎn)驗(yàn)證，獲得T0代SNAC4基因突變體24株，SNAC9基因突變體21株，SNAC4/9雙基因突變體1株。鑒定T1代突變體發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除SNAC4/9后的番茄突變體可穩(wěn)定遺傳。敲除SNAC4/9基因在不同程度上影響了種子形態(tài)、植株生長(zhǎng)發(fā)育和果實(shí)成熟，暗示SNAC4和SNAC9可能從不同的路徑調(diào)控番茄果實(shí)成熟。