基于生物信息學(xué)篩選膀胱癌預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵miRNAs 并驗(yàn)證

鄒震海，程 琪，李 中，劉貝貝，高五岳，孫 巍，郭園園，劉建民

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，安徽 蚌埠 233004）

膀胱癌（bladder cancer）是泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。吸煙、遺傳因素以及接觸芳香胺和其它工業(yè)化學(xué)品被認(rèn)為是膀胱癌發(fā)生發(fā)展的原因[1]。在所有新診斷的病例中，75%表現(xiàn)為非肌肉浸潤(rùn)性膀胱癌（NMIBC），25%表現(xiàn)為肌肉浸潤(rùn)性膀胱癌（MIBC）[2]。對(duì)于MIBC 患者，轉(zhuǎn)移的發(fā)生更加頻繁，預(yù)后更差，大約有50%的可能發(fā)展為轉(zhuǎn)移性疾病，其平均生存時(shí)間為14～15 個(gè)月[3]，且沒有針對(duì)這些患者的治愈性治療選擇。因此，進(jìn)一步研究驅(qū)動(dòng)膀胱癌進(jìn)展的分子機(jī)制和確定潛在的治療靶點(diǎn)具有重要意義。微小核糖核酸（miRNAs）是一種小的非編碼核糖核酸，長(zhǎng)度在21～25 個(gè)核苷酸不等[4]。目前發(fā)現(xiàn)miRNAs 參與了哺乳動(dòng)物基因組中超過50%的mRNA 的調(diào)控[5]。miRNAs 主要通過與特定目標(biāo)mRNA 的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）的堿基配對(duì)來調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致基因表達(dá)量的改變[6]。單個(gè)miRNA 能夠沉默多個(gè)基因的表達(dá)，反過來，一個(gè)基因可以被多個(gè)miRNA 調(diào)控[7]。目前，多種miRNAs 已經(jīng)被證實(shí)能夠?qū)Π螂装┘?xì)胞的生物學(xué)功能產(chǎn)生影響，包括細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和凋亡[8，9]。新一代測(cè)序（NGS）技術(shù)的快速發(fā)展和癌癥基因組圖譜（TCGA，https://portal.gdc.cancer.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)的建立，產(chǎn)生了許多大規(guī)模的癌癥基因組數(shù)據(jù)集，為利用生物信息學(xué)分析來預(yù)測(cè)相關(guān)的腫瘤生物標(biāo)志物提供了基礎(chǔ)。本研究通過從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取膀胱癌患者的miRNAs 數(shù)據(jù)及相應(yīng)的預(yù)后信息，篩選出有重要預(yù)后價(jià)值的關(guān)鍵miRNAs 行下游靶基因的預(yù)測(cè)以及GO 和KEGG 通路分析，并通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，以期為膀胱癌的靶向治療提供新思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 生物信息學(xué)資料來源 從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://portal.gdc.cancer.gov/）中共下載418 例膀胱癌（BLCA）及19 例正常對(duì)照的miRNA 數(shù)據(jù)及相應(yīng)的臨床病理特征及生存信息。臨床病理特征包括：年齡、性別、分級(jí)、分期以及T 分期。

1.1.2 材料及試劑 正常人尿路上皮細(xì)胞系SVHUC-1 以及膀胱癌細(xì)胞系T24 來源于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗和胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000、TRIzol、PowerUp SYBR Green Master MIX PCR 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fish 公司；miR-NC、miR-944 mimics 和miR-1307-5p mimics 均由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成。miR-944 mimics序列:正義5'-AAAUUAUUGUACAUCGGAUGAG-3'、反義5'-CAUCCHAUGUACAAUAAUUUUU-3' ；MiR-1307-5p inhibitor 序列：正義5'-UCGACCGGACCUCGACCGGCU-3'、反義5'-CCGGUCGAGGUCCGGUCGAUU-3'。

1.2 方法

1.2.1 差異miRNAs 的獲取 利用R 軟件（v3.5.2）中edgeR 包計(jì)算差異表達(dá)的miRNAs，篩選條件：log－FoldChange=1，Padj=0.05。利用Plot 函數(shù)及Pheatmap包分別繪制火山圖及熱圖。

1.2.2 與總生存期相關(guān)的miRNAs 獲取 從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載BLCA 患者的臨床生存等病理信息，基于上述差異表達(dá)的miRNAs 列表，利用survival 包進(jìn)行Kaplan-Meier 單因素生存分析的方法繪制不同miRNAs 高低表達(dá)的生存曲線。

1.2.3 miRNAs 與臨床病理信息之間的相關(guān)性分析將優(yōu)選miRNAs 與患者5 個(gè)臨床性狀進(jìn)行相關(guān)性分析（年齡、性別、分級(jí)、分期以及T 分期），利用t或Kruskal 檢驗(yàn)，將miRNAs 表達(dá)量按臨床性狀分別分為兩組，得到相關(guān)性分析結(jié)果的列表。

1.2.4 預(yù)測(cè)miRNAs 靶基因及GO 和KEGG 分析 利用3 大常用的miRNA 預(yù)測(cè)靶基因的數(shù)據(jù)庫(kù)（miRDB、miRWalk、TargetScan）預(yù)測(cè)相應(yīng)的靶基因，兩個(gè)及以上的數(shù)據(jù)庫(kù)都預(yù)測(cè)到的靶基因作為下一步GO 和KEGG 通路分析的基因，并繪制相應(yīng)的韋恩圖。通過DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行GO 和KEGG 通路分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其中GO 分析包括生物過程、細(xì)胞組成和分子功能。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 正常人尿路上皮細(xì)胞系SVHUC-1，以及膀胱癌細(xì)胞系T24 細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱條件37 ℃、5% CO2。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，0.25%胰酶消化傳代，每2 d 換液或傳代1 次。在其生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，將T24 細(xì)胞接種于6 孔板中，生長(zhǎng)至60%融合度，按照Lipofectamine 2000 試劑說明書，將miR-NC、miR-944 mimics 和miR-1307-5p mimics轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。

1.2.6 CCK8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后的T24 細(xì)胞接種于96 孔板中，分別培養(yǎng)24、48、72 h 后，每孔加入10 μl CCK8 溶液，避光，37 ℃條件下孵育1 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞在450 nm 處的吸光度值（OD450 nm 值）。

1.2.7 Transwell 小室法 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，上室制備Matrigel 膠后，將細(xì)胞加入無血清培養(yǎng)基中，吸取100 μl 加入上室。下室加入含20%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，輕輕去除上室中的細(xì)胞和Matrigel 膠，用4%多聚甲醛固定30 min 后結(jié)晶紫染色，顯微鏡下拍照并分析。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，Transwell 上室不加入Matrigel 膠，其余步驟同細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù) 收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，取5～10 萬(wàn)重懸的細(xì)胞，1000 g 離心5 min，棄上清。加入PBS 重懸后，1000 g 離心5 min，以195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞。加入5 μl Annexin V-FITC、10 μl碘化丙啶染色液，混勻后室溫孵育10～20 min，流式上機(jī)檢測(cè)。

1.2.9 總RNA 提取及qRT-PCR 根據(jù)說明書，使用Trizol 試劑從細(xì)胞中分離總RNA，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA），PowerUp SYBR Green Master MIX PCR 試劑盒用于測(cè)定miRNA（U6 作為內(nèi)參基因）的表達(dá)水平。2ΔΔCt 法用于計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。使用Primer 5.0 設(shè)計(jì)引物，見表1。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 基因表達(dá)數(shù)據(jù)通過log2轉(zhuǎn)換標(biāo)準(zhǔn)化，使用R 軟件3.6.2 和Perl 語(yǔ)言包構(gòu)建圖，另使用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件和GraphPad Prism9 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析處理，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌差異miRNAs 的篩選結(jié)果 通過對(duì)從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中共下載的418 例膀胱癌及19 例正常對(duì)照的miRNA 數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，共篩選出293 個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，其中高表達(dá)224 個(gè)，低表達(dá)69個(gè)，繪制火山圖見圖1。

圖1 差異表達(dá)miRNAs 的火山圖

2.2 差異表達(dá)的miRNAs Kaplan-Meier 單因素生存分析 基于上述293 個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，利用survival 包進(jìn)行Kaplan-Meier 單因素生存分析的方法繪制不同miRNAs 高低表達(dá)的生存曲線，共得到65 個(gè)OS 生存曲線中P值＜0.05 的miRNAs，根據(jù)P值大小，選擇表現(xiàn)出重要預(yù)后價(jià)值的前9 個(gè)miRNA（圖2）。Kaplan-Meier 生存曲線分析顯示，miR-502b-3p、miR-1307-5p、miR-1910-5p、miR-944 的高表達(dá)和miR-483-5p、miR-483-3p、miR-615-3p、miR-217-5p、miR-708-3p 的低表達(dá)將有利于膀胱癌的預(yù)后。

圖2 9 種miRNAs 的OS 生存曲線圖

圖2 9 種miRNAs 的OS 生存曲線圖（續(xù)）

2.3 miRNAs 與臨床病理信息之間的相關(guān)性分析 將優(yōu)選的9 個(gè)miRNAs 與患者5 個(gè)臨床性狀進(jìn)行相關(guān)性分析（年齡、性別、分級(jí)、分期以及T 分期），利用Kruskal 檢驗(yàn)，將9 個(gè)miRNAs 表達(dá)量按臨床性狀分別分為兩組，并得到相關(guān)性分析結(jié)果的列表（表2）。根據(jù)P值，共有2 種miRNA 與膀胱癌的臨床病理信息相關(guān)，分別是miR-1307-5p 和miR-944，其中miR-1307-5p 與患者年齡、分級(jí)、分期以及T 分期相關(guān)，miR-944 與患者分級(jí)、分期以及T 分期相關(guān)（P＜0.05）。

表2 膀胱癌中優(yōu)選的9 個(gè)miRNAs 的相關(guān)性分析結(jié)果

2.4 差異表達(dá)的關(guān)鍵miRNAs 靶基因的預(yù)測(cè)分析利用3 大常用miRNA 預(yù)測(cè)靶基因的數(shù)據(jù)庫(kù)（miRDB、miRWalk、TargetScan）預(yù)測(cè)相應(yīng)的靶基因，兩個(gè)及以上的數(shù)據(jù)庫(kù)都預(yù)測(cè)到的靶基因作為下一步GO 和KEGG 通路分析的基因，去除9 個(gè)重復(fù)的基因，總共留下1669 個(gè)靶基因用于進(jìn)一步的GO 和KEGG 通路分析，并繪制相應(yīng)的韋恩圖，見圖3。

圖3 3 大miRNA 靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的靶基因

2.5 預(yù)測(cè)靶基因的GO 和KEGG 通路分析 通過DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行GO 和KEGG通路分析，GO 分析顯示，預(yù)測(cè)的靶基因在生物過程中主要富集于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、多細(xì)胞生物發(fā)育、解剖結(jié)構(gòu)發(fā)育、單細(xì)胞-多細(xì)胞生物過程和發(fā)育進(jìn)程，細(xì)胞組成中主要富集于細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞內(nèi)成分、細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)，分子功能中主要富集于離子結(jié)合、陽(yáng)離子結(jié)合、金屬離子結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性和蛋白質(zhì)絲氨酸，見表3；KEGG 通路分析顯示，預(yù)測(cè)的靶基因主要富集于長(zhǎng)壽通路、mTOR 信號(hào)通路和EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性等通路中，見表4、圖4。

圖4 miRNA 靶基因的KEGG 信號(hào)通路分析

表3 排名前5 位的miRNA 靶基因的GO 功能富集分析

表4 排名前10 位的miRNA 靶基因的KEGG 信號(hào)通路富集分析

2.6 miR-944 和miR-1307-5p 在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)水平 與正常尿路上皮細(xì)胞SV-HUC-1 相比，膀胱癌T24 細(xì)胞中miR-944 的表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而miR-1307-5p 的表達(dá)水平無變化（P＞0.05），見圖5。

圖5 miR-944 和miR-1307-5p 在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)水平

2.7 過表達(dá)miRNA 對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響 CCK8 增殖實(shí)驗(yàn)顯示，與mimics-NC 組相比，miR-944 mimics 組的T24 細(xì)胞的增殖能力減弱,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖6A；Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，miR-944 mimics 組的T24 細(xì)胞的遷移和侵襲能力均減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖6B；流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，miR-944 mimics 組的T24 細(xì)胞凋亡增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但過表達(dá)miR-1307-5p 后膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡無明顯變化，見圖6C。

圖6 miR-1307-5p 和miR-944 對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響

圖6 miR-1307-5p 和miR-944 對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響（續(xù)）

3 討論

膀胱癌是全球第9 大常見的惡性腫瘤，每年大約有356 000 例新增病例和145 000 例死亡病例，具有復(fù)發(fā)傾向，需要在診斷后終生監(jiān)測(cè)[10，11]。miRNAs是一類短的非編碼RNA，能夠與目標(biāo)mRNA 上的互補(bǔ)序列結(jié)合，通過抑制蛋白質(zhì)的翻譯或增加mRNA的降解來誘導(dǎo)基因沉默[12]。目前miRNAs 的異常表達(dá)已被證明與多種人類疾病有關(guān)[13]。Yin Z 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-96-5p 能夠負(fù)性調(diào)控抑癌基因FOXO3，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，從而發(fā)揮促癌作用。Chen Y 等[15]研究證明，miR-148a 通過靶向Wnt1 抑制肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，這可能為肺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供新的思路。然而，還有許多miRNA 在膀胱癌中發(fā)揮著抑癌或促癌的作用，其功能和機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。因此，本研究對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的418 例膀胱癌患者及19 例正常對(duì)照的miRNAs數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用R 軟件中edgeR 包獲取差異表達(dá)的miRNAs，共篩選出293 個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，其中高表達(dá)224 個(gè)，低表達(dá)69 個(gè)。再利用survival 包進(jìn)行Kaplan-Meier 單因素生存分析，選擇表現(xiàn)出重要預(yù)后價(jià)值的前9 個(gè)miRNAs，最后通過臨床病理信息的相關(guān)性分析得到2 個(gè)密切相關(guān)的miRNAs，分別是miR-1307-5p 和miR-944。

研究表明[16]，miR-1307-5p 和miR-944 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展均密切相關(guān)。miR-1307-5p 是通過修飾miR-1307 前體的5' 端粒獲得的一種成熟體miRNA，其可通過靶向ING5 的表達(dá)來提高卵巢癌細(xì)胞的化療耐藥性。Du X 等[17]通過一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，miR-1307-5p 也能夠促進(jìn)肺腺癌增殖，該作用機(jī)制是通過靶向TRAF3 上調(diào)MAPK/NF-κB 通路實(shí)現(xiàn)的。miR-944 最早通過miRNAs 克隆法在人宮頸細(xì)胞中鑒定獲得[18]，該miRNA 位于腫瘤蛋白p63（TP63）基因的內(nèi)含子中，定位于人3q28 染色體上[19]。miR-944 的異常表達(dá)在人類惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌或致癌的作用。研究表明[20]，miR-944 在結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)水平顯著降低，并且通過靶向下游調(diào)節(jié)因子MACC1 抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲，這表明miR-944 可能在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抗轉(zhuǎn)移作用。但miR-944 在宮頸癌中又顯著過表達(dá)，并通過靶向HECT 結(jié)構(gòu)域連接酶W2（HECW2）和S100P 結(jié)合蛋白（S100PBP）促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[21]。然而，在膀胱癌中，這兩種miRNAs 的具體作用有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

為了更深入地了解這2 種miRNAs 的分子機(jī)制，3 大常用miRNA 預(yù)測(cè)靶基因的數(shù)據(jù)庫(kù)（miRDB、miRWalk、TargetScan）被用于預(yù)測(cè)相應(yīng)的靶基因并利用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行了GO 富集和KEGG 通路分析。GO 分析顯示，預(yù)測(cè)的靶基因在生物過程中主要富集于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、多細(xì)胞生物發(fā)育、解剖結(jié)構(gòu)發(fā)育、單細(xì)胞-多細(xì)胞生物過程和發(fā)育進(jìn)程，細(xì)胞組成中主要富集于細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞內(nèi)成分、細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)，分子功能中主要富集于離子結(jié)合、陽(yáng)離子結(jié)合、金屬離子結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性和蛋白質(zhì)絲氨酸；KEGG 通路分析顯示，預(yù)測(cè)的靶基因主要富集于長(zhǎng)壽通路、mTOR 信號(hào)通路和EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性等通路中。以上結(jié)果說明這兩種miRNA 可能通過影響膀胱癌細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器的功能以及干擾金屬陽(yáng)離子等其他物質(zhì)的結(jié)合發(fā)揮相應(yīng)的作用。最后，相關(guān)分子生物學(xué)技術(shù)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了生物信息學(xué)分析的結(jié)果，qRT-PCR 分析顯示miR-944 在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)水平下調(diào)，而miR-1307-5p 的表達(dá)水平無明顯差異。同時(shí)，細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了miR-944 對(duì)膀胱癌細(xì)胞生物行為的抑制作用，這與上述qRT-PCR 的結(jié)果一致。

總之，本研究利用來自TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中膀胱癌患者的miRNAs 數(shù)據(jù)和預(yù)后信息，分析了膀胱癌組織和正常膀胱上皮組織之間的miRNAs 表達(dá)以及各項(xiàng)臨床病理數(shù)據(jù)，獲得了2 種異常表達(dá)的miRNAs。通過進(jìn)一步的分析，預(yù)測(cè)了miRNAs 的下游靶基因和靶基因富集的信號(hào)通路，最后進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)miR-944 有潛力成為預(yù)測(cè)膀胱癌診斷、治療和預(yù)后的一種新的生物標(biāo)志物。