高產(chǎn)四甲基吡嗪細(xì)菌的篩選鑒定及應(yīng)用研究

李富強(qiáng)，曹振華，閆培勛，李紹亮，李學(xué)思，2，孫金濤，郭淑平

（1.河南省宋河酒業(yè)股份有限公司，河南鹿邑 477265；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州 450000）

獨(dú)特的釀酒工藝造就中國白酒成分的多樣性，目前科學(xué)技術(shù)已檢測出的優(yōu)質(zhì)白酒成分達(dá)1700 多種。經(jīng)研究白酒主要成分除水和乙醇外，還含有相當(dāng)一部分不飽和脂肪酸、芳香族化合物和萜烯類化合物，該類物質(zhì)對抗癌、治癌、預(yù)防疾病有明顯的作用。中國白酒中的四甲基吡嗪（TTMP）（中藥川芎嗪）由微生物（酶）與熱動力學(xué)反應(yīng)（美拉德反應(yīng)）聯(lián)合作用生成，在制曲和堆積發(fā)酵中產(chǎn)生，經(jīng)蒸餾帶入酒中，具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)及抑制血小板積聚的作用，賦予中國白酒健康功能[1-4]。

中國白酒的釀造工藝是最為傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵，四甲基吡嗪在各個香型中含量有所不同[5]。中國白酒的傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵法在釀造工藝、原料選擇以及糖化發(fā)酵劑種類、自然環(huán)境等諸多因素上有很大差異，因此在各個香型中TTMP 的含量也有著很大的差異[6]。測定發(fā)現(xiàn)醬香型白酒中四甲基吡嗪含量最為突出，為所有香型之最[7]，其次為芝麻香型。四甲基吡嗪在醬香型白酒中的含量與其獨(dú)特的釀造技術(shù)密切相關(guān)。高溫制曲、高溫堆積為四甲基吡嗪的生成創(chuàng)造了有利條件[8]。

本實(shí)驗(yàn)以宋河中高溫大曲為研究對象，篩選中高溫大曲中高產(chǎn)四甲基吡嗪的微生物，將其應(yīng)用到釀酒生產(chǎn)過程中，以期提高原酒中健康因子含量，為提高原酒質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

實(shí)驗(yàn)原輔料：中高溫大曲，來自宋河酒業(yè)制曲車間；麩皮，市售優(yōu)質(zhì)麩皮。

試劑及耗材：氫氧化鈉，乳酸，鹽酸，酚酞，己酸，無水乙醇，葡萄糖，硫酸銅，10 g/L 次甲基藍(lán)溶液，pH4.6緩沖溶液，2.5 mol/L硫酸溶液，凡士林，牛肉膏，蛋白胨，瓊脂粉，麥芽浸粉，酵母膏等。

儀器設(shè)備：可見分光光度計（721型），上海悅豐儀器儀表有限公司；氣相色譜分析儀（GC102AT 氣相色譜儀），安捷倫科技（中國）有限公司；電子天平（MD200-3 型），上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（101 型），北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；真空抽濾裝置；電熱恒溫水浴鍋（HH-6型），金壇市金南儀器制造有限公司；循環(huán)水式多用真空泵(SHZ-D(Ⅲ)型），天津華鑫儀器廠；電子萬用爐（DL-100 型），天津市泰斯特儀器有限公司；搖床；試管；燒杯；玻璃棒等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)四甲基吡嗪菌株的篩選

富集培養(yǎng)：稱取1 g 曲粉于50 mL 無菌水中（帶有5 粒玻璃珠），200 r/min 振蕩30 min，使之充分混勻，于85 ℃水浴鍋中處理30 min，靜置，吸取1 mL上清液加至裝有50 mL 富集培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜。

分離純化：將過夜培養(yǎng)的菌液適當(dāng)稀釋涂布，于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h。挑取表面不光滑、邊緣不整齊的特征菌落，劃線分離，將得到的單菌落保藏于營養(yǎng)瓊脂斜面，菌落長出后，4 ℃冰箱保藏備用。

菌株初篩：Zhu等[9-11]提出發(fā)酵體系中四甲基吡嗪的前體物質(zhì)即乙偶姻，可借助VP 試驗(yàn)檢測乙偶姻的產(chǎn)量篩選四甲基吡嗪高產(chǎn)菌株。將菌種接種至裝有10 mL VP 培養(yǎng)基的試管中，每株三管，37 ℃、150 r/min 培養(yǎng)96 h，發(fā)酵結(jié)束后檢測乙偶姻的產(chǎn)量，挑選呈陽性反應(yīng)且吸光度值高的菌株作為進(jìn)一步復(fù)篩菌株。

1.2.2 高產(chǎn)四甲基吡嗪的鑒定

將初篩得到的菌株接種于裝有100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min的條件下培養(yǎng)120 h，發(fā)酵結(jié)束后通過GC-MS 對發(fā)酵液進(jìn)行定性分析，測得菌株產(chǎn)四甲基吡嗪的相對含量，用氣相色譜法對高產(chǎn)四甲基吡嗪菌株進(jìn)行定量分析。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定方法

根據(jù)細(xì)菌DNA 提取試劑盒說明書，采用細(xì)菌16S rDNA 通 用PCR 引 物27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492r(5'-GGT-TACCTTGT-TACGACTT-3')進(jìn)行擴(kuò)增，在25.0 μL PCR 反應(yīng)體系中，加上、下游引物1492r 和27f 各1.0 μL，Mix 12.5 μL，細(xì)菌DNA 2.0 μL，雙蒸水（ddH2O）8.5 μL。PCR 擴(kuò)增條件為初始變性94 ℃、5 min，變性94 ℃、0.5 min，退火55 ℃、0.5 min，復(fù)性72 ℃、1.5 min，30個循環(huán)，最后延伸72 ℃、10 min。取2 μL DNA 溶液于1 %瓊脂糖凝膠100 V 電泳40 min左右。

PCR 擴(kuò)增后的產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列分析。將測序結(jié)果錄入美國國家生物信息技術(shù)中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 比對，利用MEGA5.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的建立。

1.2.4 應(yīng)用方法

利用種子培養(yǎng)基培養(yǎng)BQ-1 菌株（高產(chǎn)四甲基吡嗪），培養(yǎng)后的菌株以2 %接種量（相對于投糧量）均勻接種到堆積發(fā)酵前的酒醅中，堆積過程中菌株繁殖代謝產(chǎn)生四甲基吡嗪，提高芝麻香白酒中吡嗪類物質(zhì)及乙偶姻等主體風(fēng)味物質(zhì)的含量。發(fā)酵結(jié)束后檢測原酒中風(fēng)味物質(zhì)及四甲基吡嗪的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株初篩

用平板稀釋涂布法從宋河中高溫大曲中分離出9 株菌落形態(tài)差別較大的細(xì)菌，分離純化后篩選出的9 株形態(tài)差異結(jié)果如表1 所示。將分離純化出的9 株菌株分別點(diǎn)接于脫脂牛奶培養(yǎng)基中，觀察菌落周圍產(chǎn)生透明圈的情況，如圖1 所示。TTMP 的前體物質(zhì)為乙偶姻和銨，銨的產(chǎn)生和蛋白酶活性的強(qiáng)弱相關(guān)并且蛋白酶也是曲粉的主要質(zhì)量指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過測量計算培養(yǎng)基上菌落透明圈直徑與菌落直徑比值的大小，來確定菌株產(chǎn)蛋白酶能力，即透明圈直徑與菌落直徑的比值越大，產(chǎn)蛋白酶的能力越高。結(jié)果如表2所示。

表2 9株菌的R值

圖1 9株菌株在脫脂牛奶培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明圈情況

表1 9株細(xì)菌的形態(tài)特征

根據(jù)表2 所示，菌株BQ-12、BQ-1、BQ-37、BQ-38、BQ-42 5 株菌的透明圈直徑D 與菌落直徑d 的比值R 相對于其他幾株菌的比值較大，其中菌株BQ-1 的比值最大，說明菌株BQ-12、BQ-1、BQ-37、BQ-38、BQ-42 這5 株菌產(chǎn)蛋白酶能力相對于其他幾株較強(qiáng)。因此將菌株BQ-12、BQ-1、BQ-37、BQ-38、BQ-42作為產(chǎn)四甲基吡嗪的初篩菌株。

2.2 高產(chǎn)四甲基吡嗪的鑒定

將初篩菌株進(jìn)行發(fā)酵搖瓶實(shí)驗(yàn)，通過GC-MS分析測定發(fā)酵液的成分，分析得出菌株BQ-1 產(chǎn)四甲基吡嗪，其他幾株不產(chǎn)。菌株BQ-1 發(fā)酵液成分如表3 所示。由表3 可知，菌株BQ-1 產(chǎn)基吡嗪物質(zhì)10 種、酮類物質(zhì)3 種、酯類6 種、醇類5 種。該菌株除產(chǎn)四甲基吡嗪（Pyrazine,tetramethyl-），也產(chǎn)乙偶姻、二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、己酸己酯等化合物。

表3 菌株BQ-1發(fā)酵液成分GC-MS分析結(jié)果

運(yùn)用氣相色譜技術(shù)對菌株BQ-1 發(fā)酵液中四甲基吡嗪含量進(jìn)行定量分析。通過分析得出，在發(fā)酵液中菌株BQ-1四甲基吡嗪的產(chǎn)量達(dá)到25 mg/L。

2.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定

采用通用引物27F 和1492R 利用PCR 擴(kuò)增獲得高產(chǎn)菌株BQ-1 的16S rDNA 序列，將PCR 擴(kuò)增后的產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司完成測序，測序結(jié)果如下。

用DNAMAN 校正后的序列在NCBI 服務(wù)器上用BLAST 進(jìn)行同源檢測，將與菌株16S rDNA D1/D2 區(qū)域序列相似的模式菌種序列、種名以及分類號下載保存；采用MEGA 5.1 Unweighted Pair Group Method Using(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹測序結(jié)果拼接之后提交到NCBI 基因數(shù)據(jù)進(jìn)行Blast 同源性分析，分子生物學(xué)鑒定結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果如圖2。

圖2 BQ-1系統(tǒng)發(fā)育樹

經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定該菌株為Bacillus amyloliquefaciens（解淀粉芽孢桿菌）。

2.4 實(shí)驗(yàn)原酒感官嘗評結(jié)果

對所產(chǎn)基酒進(jìn)行感官嘗評，由五位國家級品酒師和十位省級品酒師根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[12-13]并結(jié)合實(shí)際情況進(jìn)行共同品評打分。品評結(jié)果見表4。

表4 混合酒樣感官嘗評結(jié)果

由表4 可知，實(shí)驗(yàn)窖池所產(chǎn)原酒無色、清亮透明，相比于對照樣芝麻香突出、焦香重、香味協(xié)調(diào)、口感豐富、風(fēng)格突出典型。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以宋河中高溫大曲為實(shí)驗(yàn)材料，從宋河中高溫大曲中篩選出1 株高產(chǎn)四甲基吡嗪的細(xì)菌，該菌株在實(shí)驗(yàn)室條件下四甲基吡嗪產(chǎn)量達(dá)到25 mg/L，該菌株除產(chǎn)Pyrazine,tetramethyl-（四甲基吡嗪）之外，還產(chǎn)Pyrazine,methyl-（2-甲基吡嗪）、Pyrazine,2,5-dimethyl-（2,5-二甲基吡嗪）、Pyrazine,2,6-dimethyl-（2,6-二甲基吡嗪）、Pyrazine,ethyl-（2-乙基吡嗪）、Pyrazine,2,3-dimethyl-（2,3-二甲基吡嗪）、Pyrazine,2-ethyl-6-methyl-（2-乙基-6-甲基吡嗪）、Pyrazine,trimethyl-（三甲基吡嗪）、Pyrazine,ethenyl-（2-乙烯基吡嗪）、Pyrazine,2-ethenyl-6-methyl-（2-乙烯基-6-甲基吡嗪）、2,3-Butanedione（2,3-丁二酮）、Acetoin（乙偶姻）等物質(zhì)。

采用通用引物27F 和1492R，利用PCR 擴(kuò)增獲得高產(chǎn)菌株BQ-1 的16S rDNA 序列，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定該菌株為Bacillus amyloliquefaciens（解淀粉芽孢桿菌）。通過擴(kuò)大培養(yǎng)把該菌株應(yīng)用到芝麻香白酒堆積過程，結(jié)果能明顯提升芝麻香白酒焦香及芝麻香型白酒質(zhì)量。

本實(shí)驗(yàn)豐富了大曲微生物的功能，為強(qiáng)化大曲的生產(chǎn)及提升白酒中健康因子的含量提供了理論基礎(chǔ)。但文章對菌株的應(yīng)用范圍較小，在后期的研究中應(yīng)加大此類研究。