半胱氨酸和甘氨酸豐富蛋白1對膀胱癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及β-catenin/c-Myc通路的影響

張鏡偉，馬勝利，謝程國

廣州市第一人民醫(yī)院南沙醫(yī)院泌尿外科，廣州 511458

膀胱癌的發(fā)病率、病死率均較高，是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一[1-2]。研究顯示，早期診斷、個體化治療和隨訪可以明顯延長患者的生存期[3]。盡管臨床上在診斷和治療方法中做了很大的努力，但膀胱癌患者的復(fù)發(fā)率依舊很高，晚期患者的臨床預(yù)后也很差[4]。因此，尋找膀胱癌患者早期診斷和臨床治療的特異性分子標(biāo)志物具有重要意義。半胱氨酸和甘氨酸豐富蛋白1（cysteine and glycine rich protein 1，CSRP1）屬于LIM結(jié)構(gòu)域超家族，LIM結(jié)構(gòu)域可以在許多不同的蛋白質(zhì)中找到，其在細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞黏附、細(xì)胞運(yùn)動以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用[5-6]。CSRP1主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能；同時，該蛋白還是非常重要的腫瘤分子標(biāo)志物[7-9]?，F(xiàn)已證實，CSRP1在多種腫瘤中均出現(xiàn)了表達(dá)失衡，例如結(jié)直腸癌、前列腺癌等[10-14]。隨著研究的深入，CSRP1有可能成為新型分子標(biāo)志物，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有較大的提示意義。但是，目前CSRP1在膀胱癌中的研究尚未見文獻(xiàn)報道，故本研究探討CSRP1對膀胱癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及β-catenin/c-Myc通路的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月至2017年1月在廣州市第一人民醫(yī)院南沙醫(yī)院就診的膀胱癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)檢查確診為膀胱癌；②術(shù)前未行放化療等抗腫瘤治療；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入30例膀胱癌患者，收集30例患者的膀胱癌組織以及相應(yīng)的癌旁組織。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 主要材料與試劑

RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清均購自美國Gibco公司，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增試劑盒均購自Takara公司，MTS細(xì)胞增殖定量檢測試劑盒購自美國Promega公司，電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）熒光底物試劑盒購自美國Pierce公司，Lipofectamine LTX購自Invitrogen公司。c-Myc、CSRP1、β-catenin、GAPDH抗體均購自美國Abcam公司。倒置熒光顯微鏡購自O(shè)LYMPUS公司，電熱恒溫水槽購自上海精宏實驗設(shè)備有限公司，生物安全柜（超凈工作臺）、細(xì)胞培養(yǎng)箱均購自Thermo Scientific公司，全自動細(xì)胞計數(shù)分析儀購自Nexcelom Bioscience公司，立式全自動滅菌器購自Cirrus公司，普通PCR儀購自BioRAD公司，熒光定量PCR儀購自杭州博日科技有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人正常尿路上皮細(xì)胞系SVHUC和膀胱癌細(xì)胞系5637、T24均購自中科院上海細(xì)胞所。人正常尿路上皮細(xì)胞系SVHUC在無角質(zhì)細(xì)胞血清培養(yǎng)基（keratinocyte serum free medium，K-SFM）+1%青霉素和鏈霉素中培養(yǎng)；5637細(xì)胞和T24細(xì)胞在RPMI1640完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清+1%雙抗）中培養(yǎng)。所有細(xì)胞在37℃標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)條件下（5%CO2，95%濕度）生長。

1.3.2 免疫組化 對臨床膀胱癌樣本石蠟包埋的組織切片進(jìn)行免疫組化分析，按照免疫組化步驟檢測膀胱癌組織及癌旁組織中CSRP1的表達(dá)情況，結(jié)果用免疫活性評分（immunoreactivity score，IRS）表示，即陽性細(xì)胞百分比評分乘以染色強(qiáng)度評分。陽性細(xì)胞百分比評分方法：陽性細(xì)胞百分比0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；染色強(qiáng)度評分方法：未染色為0分，淡黃色為1分，深黃色或者棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據(jù)IRS評分可將CSRP1表達(dá)分成4個等級：陰性（0～3分），弱陽性（4～6分），陽性（7～9分），強(qiáng)陽性（10～12分）。

1.3.3 實時熒光定量PCR 取對數(shù)生長期細(xì)胞，采用Trizol/氯仿/異丙醇法提取細(xì)胞總RNA，通過核酸蛋白定量儀測定所提取RNA的濃度及純度；然后參照Takara公司的PrimeScriptRTReagent Kit試劑盒說明書，將總RNA（1 μg）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；參照Takara公司的PrimeScript?RT Master Mix試劑盒說明書，以cDNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增。42℃預(yù)變性，60 min；70 ℃，15 min。PCR 反 應(yīng)條件：94 ℃，45 s；55 ℃，50 s；72 ℃，75 s；共40個循環(huán)。所需引物序列詳見表1。采用公式2-ΔΔCt對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，得到各個基因的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.3.4 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法 收集對數(shù)生長期的SVHUC、5637及T24細(xì)胞，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌細(xì)胞3次，然后加入1×Cell Lysis Buffer裂解細(xì)胞，經(jīng)超聲、離心后去掉其他細(xì)胞成分，使用微量核酸蛋白定量儀測定各蛋白樣品的濃度及純度；加入5×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate，SDS）加樣緩沖液在沸水中煮沸10 min以使蛋白充分變性；配置10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜，封閉，并在4℃與一抗孵育過夜；二抗室溫孵育2 h，采用化學(xué)發(fā)光法檢測CSRP1蛋白表達(dá)情況，并進(jìn)行灰度值分析。

1.3.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染CSRP1-siRNA序列為5'-CTGTTGTGGGAATGAAGAGAGTTTG-3'，陰性對照序列為 5'-GCUUCGCGCCGUAGUCUATT-3'，由上海吉瑪公司合成。取對數(shù)生長期的T24細(xì)胞，接種于6孔板中。利用轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000，將scramble-siRNA（10 μg）和CSRP1-siRNA（10 μg）分別轉(zhuǎn)染至T24細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染6～8 h后將無抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基換成加入抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h（用于檢測mRNA的表達(dá)）或72 h（用于檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)）。

1.3.6 MTS細(xì)胞增殖實驗 通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染，將T24細(xì)胞分成3組：空白對照組、scramble-siRNA組（si-NC組）和實驗組（si-CSRP1組）。然后將100 μl完全培養(yǎng)基中的2000個3組細(xì)胞接種到96孔板中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)1～5天，然后每個時間點(diǎn)在培養(yǎng)基中加入10 μl MTS，37℃孵育4 h后，490 nm波長下測定每孔光密度（optical density，OD），根據(jù)結(jié)果繪制細(xì)胞生長表。

1.3.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，取對數(shù)生長期的si-NC組和si-CSRP1組T24細(xì)胞，用D-Hanks清洗3遍后加入不含胎牛血清的培養(yǎng)基靜置過夜，然后用預(yù)冷PBS清洗3次，使用預(yù)冷75%乙醇固定細(xì)胞，放置于4℃冰箱內(nèi)過夜；上機(jī)前離心去除乙醇，PBS洗滌3次后，加入100 μl RNase A溶液37℃水浴中放置30 min；然后加 400 μl的碘化丙啶（propidium iodide，PI）4℃避光染色1 h；流式細(xì)胞儀根據(jù)測定的DNA含量確定細(xì)胞周期分布。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CSRP1在膀胱癌組織中的表達(dá)水平及臨床意義

采用免疫組化檢測膀胱組織標(biāo)本中CSRP1的表達(dá)水平，CSRP1在腫瘤組織中的表達(dá)水平為（8.20±2.58），明顯高于癌旁組織中的（3.93±1.98），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=16.837，P＜0.01）（圖1）。按照IRS評分將膀胱癌患者分成CSRP1高表達(dá)組（IRS評分≥8分）和CSRP1低表達(dá)組（IRS評分＜8分），生存曲線分析顯示CSRP1高表達(dá)組患者的總生存率低于CSRP1低表達(dá)組患者（χ2=5.532，P=0.019）（圖2）。不同腫瘤大小、腫瘤分級膀胱癌患者的CSRP1表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；不同年齡、性別膀胱癌患者的CSRP1表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表 1）。

表1 不同臨床特征膀胱癌患者CSRP1表達(dá)情況的比較

圖1 免疫組化檢測膀胱癌組織及癌旁組織中CSRP1蛋白表達(dá)情況（免疫組化染色，×400）

圖2 CSRP1高表達(dá)組（n=19）與CSRP1低表達(dá)組（n=11）膀胱癌患者的生存曲線

2.2 CSRP1在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)水平

在細(xì)胞水平，分別采用實時熒光定量PCR和Western blot法檢測細(xì)胞中CSRP1mRNA和蛋白水平。結(jié)果顯示，CSRP1在人正常尿路上皮細(xì)胞SVHUC和膀胱癌細(xì)胞T24、5637中的mRNA表達(dá)水平分別為（1.025±0.014）、（6.537±0.009）、（8.487±0.043），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=20 762.951，P＜0.01），提示膀胱癌細(xì)胞中CSRP1mRNA水平高于人正常尿路上皮細(xì)胞；膀胱癌細(xì)胞T24、5637中CSRP1蛋白表達(dá)水平均高于人正常尿路上皮細(xì)胞SVHUC（圖3）。

圖3 Western blot法檢測膀胱癌細(xì)胞T24、5637和人正常尿路上皮細(xì)胞SVHUC中CSRP1蛋白表達(dá)情況

2.3 沉默CSRP1表達(dá)對膀胱癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響

轉(zhuǎn)染CSRP1siRNA序列至T24細(xì)胞中沉默CSRP1表達(dá)，CSRP1蛋白表達(dá)降低（圖4A）。相比si-NC組細(xì)胞，si-CSRP1組細(xì)胞G1期細(xì)胞百分比從57.60%提高到71.59%，而S期細(xì)胞百分比則由30.15%降低到19.22%（圖4B）。與空白對照組和si-NC組相比，不同時間點(diǎn)si-CSRP1組細(xì)胞OD值均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表2 不同時間點(diǎn)3組CSRP1細(xì)胞OD值的比較（±s）

表2 不同時間點(diǎn)3組CSRP1細(xì)胞OD值的比較（±s）

注：*與si-CSRP1組比較，P＜0.05

空白對照組si-NC組si-CSRP1組F值P值0.362±0.002*0.334±0.001*0.308±0.012 55.207 0.000 0.513±0.003*0.525±0.003*0.363±0.003 2687.939 0.000 0.652±0.025*0.668±0.010*0.460±0.017 119.39 0.000 0.912±0.016*0.971±0.018*0.626±0.021 296.729 0.000組別24 h 48 h 72 h 96 h

圖4 沉默CSRP1表達(dá)對CSRP1蛋白表達(dá)和細(xì)胞周期的影響

2.4 沉默CSRP1表達(dá)對β-catenin/c-Myc信號通路的影響

si-CSRP1組細(xì)胞中β-catenin、c-MycmRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯低于si-NC組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（表3、圖5）

圖5 Western blot法檢測si-NC組和si-CSRP1組細(xì)胞中β-catenin、c-Myc蛋白表達(dá)情況

表3 si-NC組和si-CSRP1組細(xì)胞中β-catenin、c-Myc mRNA表達(dá)水平的比較（±s）

表3 si-NC組和si-CSRP1組細(xì)胞中β-catenin、c-Myc mRNA表達(dá)水平的比較（±s）

組別si-NC組si-CSRP1組t值P值c-Myc 1.040±0.053 0.461±0.036 15.733 0.000 β-catenin 1.012±0.010 0.330±0.030 37.182 0.000

3 討論

本研究探討了CSRP1在膀胱癌組織中的表達(dá)情況及臨床意義，發(fā)現(xiàn)CSRP1在膀胱癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，且CSRP1高表達(dá)與膀胱癌患者預(yù)后不良有關(guān)。與正常尿路上皮細(xì)胞相比，膀胱癌細(xì)胞中CSRP1表達(dá)上調(diào)。為了確定CSRP1在膀胱癌中的作用，本研究轉(zhuǎn)染靶向CSRP1基因的siRNA沉默其表達(dá)，發(fā)現(xiàn)沉默CSRP1后抑制了膀胱癌細(xì)胞的增殖能力，誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)G1/S期阻滯。這些結(jié)果提示CSRP1與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，可能是防治膀胱癌的新靶點(diǎn)。

機(jī)制研究顯示，沉默CSRP1可以明顯抑制β-catenin/c-Myc信號通路。據(jù)報道，WNT/β-catenin信號通路在膀胱癌細(xì)胞的自我更新和增殖中發(fā)揮重要作用[15]。β-catenin蛋白N-末端的缺失可以避免其被糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β）結(jié)合和降解，將N-末端缺失的β-catenin蛋白導(dǎo)入膀胱癌細(xì)胞中可以促進(jìn)其增殖和克隆形成[16]。本研究中應(yīng)用siRNA沉默T24中CSRP1基因后，β-catenin蛋白表達(dá)水平下降，說明CSRP1可能通過β-catenin促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖。同時檢測了β-catenin下游蛋白c-Myc的表達(dá)水平，與β-catenin結(jié)果一致，沉默CSRP1基因后，c-Myc蛋白表達(dá)水平也出現(xiàn)了下降。原癌基因c-Myc在許多腫瘤中過表達(dá)，包括膀胱癌。c-Myc在膀胱癌細(xì)胞增殖和分化中發(fā)揮重要作用，被報道參與調(diào)控膀胱癌細(xì)胞的增殖[17]。c-Myc還可以調(diào)節(jié)其下游細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1（調(diào)節(jié)G1/S檢測點(diǎn)最關(guān)鍵的蛋白）和cyclin E2（G1末期細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)換過程中的限速調(diào)節(jié)因子）的表達(dá)，從而促進(jìn)與S期相關(guān)的靶分子的表達(dá)、DNA復(fù)制的完成，促進(jìn)細(xì)胞從G1期至S期進(jìn)展[18-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，CSRP1沉默可以下調(diào)c-Myc表達(dá)水平，誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞周期G1/S期阻滯，抑制膀胱癌細(xì)胞的生長，說明CSRP1可能通過β-catenin/c-Myc通路介導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白上調(diào)來促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖。

綜上所述，CSRP1在膀胱癌組織及細(xì)胞中呈高表達(dá)，沉默CSRP1可能通過抑制β-catenin/c-Myc通路下調(diào)c-Myc的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1/S期阻滯并抑制膀胱癌細(xì)胞增殖。因此，CSRP1可能在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。但是，本研究中后期僅采用了一個膀胱癌細(xì)胞系，也缺乏體內(nèi)動物實驗，CSRP1影響細(xì)胞周期蛋白的潛在機(jī)制也有待進(jìn)一步深入研究。