活血化瘀祛痰法對(duì)野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠肺血管重構(gòu)的影響

郭曉燕，畢蓉蓉，張曄敏，陸城華

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032)

肺動(dòng)脈高壓(Pulmonary hypertension，PH)是以肺血管阻力和肺動(dòng)脈壓持續(xù)性升高為特征的慢性肺血管疾病，以肺血管內(nèi)皮功能障礙、平滑肌增殖、纖維化和原位血栓形成為特征，最終導(dǎo)致右心功能不全，甚至死亡，PH是多種并發(fā)癥的產(chǎn)生的誘因，也是多種疾病發(fā)展到一定階段后出現(xiàn)的病理性變化[1]。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，治療困難，預(yù)后差，嚴(yán)重程度甚至遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了癌癥。據(jù)估計(jì)，與任何病因的PH相關(guān)的病死率為女性5.5/10萬(wàn)，男性5.6/10萬(wàn)，從診斷PH起平均存活時(shí)間為2～5年[2]。目前臨床治療PH藥物包括肺血管擴(kuò)張劑、內(nèi)皮素抑制劑、NO激活劑等靶向藥物，血管擴(kuò)張劑可改善患者臨床癥狀，未能有效降低患者病死率。靶向藥物能夠改善患者生存質(zhì)量，遠(yuǎn)期療效欠佳[3-4]，PH的1年病死率仍然高達(dá)15%[5]。PH病理特征是肺血管重構(gòu)，表現(xiàn)在肺動(dòng)脈血管內(nèi)皮損傷、血管中膜增厚等，肺血管腔狹窄、管壁增生甚至血管閉塞，最終引起肺動(dòng)脈壓力增高[6-7]。因此，阻止及逆轉(zhuǎn)肺血管結(jié)構(gòu)重建是治療PH的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。既往研究顯示，中藥復(fù)方制劑可能通過(guò)調(diào)節(jié)血管舒張功能、保護(hù)肺血管內(nèi)皮功能、抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖、抑制肺血管重構(gòu)等機(jī)制以改善PH患者肺動(dòng)脈壓力、右心功能等[8-9]。PH屬于中醫(yī)“肺脹”“喘證”等范疇，早期病變首先在肺，早期以痰濁為主，漸而痰瘀互見(jiàn)，終至痰濁、血瘀等錯(cuò)雜為患。吳瑩等[10]研究發(fā)現(xiàn)痰濁、瘀血是PH病情發(fā)展過(guò)程中的病理產(chǎn)物和致病因素，活血化瘀祛痰是治療PH的重要原則。本文基于前期研究，擬采用活血化瘀祛痰法治療PH，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康SD大鼠，SPF級(jí)，體重(200±20) g，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院動(dòng)物房。動(dòng)物許可證號(hào)SYXK(滬)2018-0036，環(huán)境溫度(25±1)℃，濕度28%中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物：①中藥復(fù)方由川芎、赤芍、白芍、當(dāng)歸、丹參、黃荊子等組成，取上述藥物制成液體制劑，其濃度為每毫升含生藥量1.526 g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院制劑室提供。根據(jù)成人日服劑量，按動(dòng)物體表面積比率換算等效劑量，日服量：8.64 g/(kg·d)。②鹽酸法舒地爾注射液：規(guī)格2 ml:30 mg/支(天津紅日藥業(yè)有限公司)。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器：多道生理信號(hào)采集系統(tǒng)(成都儀器廠)；電泳儀(BIO-RAD公司)；轉(zhuǎn)膜儀(BIO-RAD公司)；酶標(biāo)儀(Thermo公司)；DMEM/F-12(Gibco)；抗生素(青鏈霉素)(Gibco)；FBS(Gibco)；二甲基亞砜(DMSO)(Sigma)；胰蛋白酶和Ⅰ型膠原酶(Gibco)；超低溫冰箱(Haier)；倒置顯微鏡(Olympus)；超凈工作臺(tái)(Baker公司)；Marker(Thermo公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制備：采用野百合堿(MCT)腹腔注射建立肺動(dòng)脈高壓模型。大鼠腹腔內(nèi)一次性注射MCT50 mg/kg，觀察3周。

1.2.2 分組與給藥：SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為四組，分別為假手術(shù)組、模型組、中藥復(fù)方組、法舒地爾組，每組15只。各組均從第1天起開始給藥，中藥復(fù)方組給予中藥 8.64 g/(kg·d)灌胃，法舒地爾組給予鹽酸法舒地爾注射液15 mg/(kg·d)腹腔注射，假手術(shù)組和模型組給予等量的0.9%氯化鈉溶液灌胃，每日1次，持續(xù)3周。

1.2.3 取材與處理：脫臼法處死大鼠后取出肺臟，以0.9%氯化鈉溶液沖洗后剪取右外上肺葉，浸泡于4% 多聚甲醛緩沖液固定，制備肺組織病理標(biāo)本。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 一般狀態(tài)：觀察各組大鼠一般狀態(tài)、體重、呼吸、活動(dòng)狀態(tài)。

1.3.2 肺動(dòng)脈壓：采用大鼠行右心導(dǎo)管術(shù)測(cè)定大鼠肺動(dòng)脈壓[11]，將大鼠用3%戊巴比妥鈉麻醉后，頸部正中作長(zhǎng)約1.5 cm的縱行切口，并游離右頸外經(jīng)脈約1 cm，結(jié)扎，剪口，用一充盈肝素溶液的聚乙烯管經(jīng)頸靜脈緩慢插管至右心房、右心室及肺動(dòng)脈，導(dǎo)管另一端連接壓力傳感器到生物信號(hào)采集系統(tǒng)，根據(jù)壓力波形確定測(cè)導(dǎo)管位置，記錄平均肺動(dòng)脈壓力(mPAP)。

1.3.3 右心指數(shù)：測(cè)定肺動(dòng)脈壓力結(jié)束后，立即完整取出心臟和肺臟，分離右心室(RV)、左心室加室間隔(LV+S)，并依次稱重，計(jì)算右心肥大指數(shù)(RVHI)=RV/(LV+S)。

1.3.4 肺組織病理：大鼠右肺中葉組織4%多聚甲醛固定24 h，行HE染色觀測(cè)模型肺組織的病理改變、維多利亞藍(lán)+VG特殊染色觀察肺血管重建指標(biāo)。采用Image J圖像分析軟件測(cè)量血管內(nèi)徑(D1)、外徑(D2)，計(jì)算肺動(dòng)脈血管壁厚度百分比(WT%)，WT%=(D2-D1)/D2×100%。

1.3.5 ROCKⅠ、ROCKⅡ蛋白表達(dá)：采用Western blot法檢測(cè)。常規(guī)提取組織蛋白,使用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量,SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜,一抗結(jié)合和二抗結(jié)合[一抗為鼠抗Rho 抗體(Thr696,1∶1500)、兔抗ROCK 抗體(1∶1000)抗體和兔抗DAPDH 抗體;二抗為生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 或者山羊抗兔IgG (1∶800稀釋)],曝光、顯影、定影。以GAPDH 為內(nèi)參照,應(yīng)用圖像分析軟件進(jìn)行條帶掃描分析,目的蛋白顯色條帶灰度與GAPDH 顯色條帶灰度比值代表目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布者采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，不符合正態(tài)分布者，采用非參數(shù)檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)及體重比較 注射MCT4周后大鼠一般情況發(fā)生變化，動(dòng)物活動(dòng)能力下降，毛發(fā)晦暗、缺少光澤，呼吸急促加快，易激惹，食欲下降，逐漸消瘦。模型組、中藥復(fù)方組、法舒地爾組均已出現(xiàn)明顯體重下降、呼吸急促等表現(xiàn)。結(jié)果顯示，模型組較假手術(shù)組體重明顯降低(P<0.01)，中藥復(fù)方組、法舒地爾組體重較模型組升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠肺動(dòng)脈壓力比較 模型組mPAP明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)，中藥復(fù)方組、法舒地爾組mPAP均低于模型組(P<0.01)，法舒地爾組與中藥復(fù)方組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.3 各組大鼠右心指數(shù)比較 模型組RVHI均明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，中藥復(fù)方組、法舒地爾組大鼠右心指數(shù)均低于模型組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠體重、右心指數(shù)、mPAP比較

2.4 各組大鼠肺血管重構(gòu)比較 假手術(shù)組大鼠肺泡完整，肺小動(dòng)脈血管壁光滑無(wú)增厚，管腔無(wú)狹窄，血管內(nèi)皮細(xì)胞分布均勻，連續(xù)性完整；模型組大鼠肺中動(dòng)脈血管壁明顯增厚，管腔狹窄，中層平滑肌細(xì)胞增殖肥大、排列紊亂。模型組肺中動(dòng)脈管腔狹窄、中膜增厚程度較對(duì)照組明顯(P<0.01)，中藥復(fù)方組、法舒地爾組血管增殖程度較模型組減輕(P<0.01)。見(jiàn)圖1、2。

圖1 各組大鼠肺動(dòng)脈血管病理變化(HE染色，×400)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01圖2 各組大鼠血管壁厚度百分比比較

2.5 各組大鼠ROCKⅠ、ROCKⅡ表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組ROCKⅠ、ROCKⅡ水平均較假手術(shù)組明顯升高(P<0.05或P<0.01)；中藥復(fù)方組、法舒地爾組ROCKⅠ、ROCKⅡ水平低于模型組(P<0.05或P<0.01)；中藥復(fù)方組ROCKⅠ、ROCKⅡ水平與法舒地爾組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01圖3 各組大鼠ROCKⅠ、ROCKⅡ蛋白水平表達(dá)比較

3 討 論

PH患者肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)、PASMCs增生、肺血管收縮和原位血栓形成，導(dǎo)致組織缺氧，血液黏滯度增加，肺絡(luò)瘀阻，呈現(xiàn)局部瘀血阻滯狀態(tài)。徐欣等[12]基于文獻(xiàn)研究顯示，PH中醫(yī)證候主要為肺腎氣虛證、痰瘀阻肺證。翟佳濱等[13]認(rèn)為氣滯、痰阻、血瘀為本病的主要病理產(chǎn)物。從上述研究看出，PH屬于本虛標(biāo)實(shí)之病，痰瘀阻肺是其標(biāo)，正氣虧虛是其本證型，活血化瘀祛痰是其主要治療原則。本研究方藥由川芎、赤芍、丹參、當(dāng)歸、白芍等組成，具有活血化瘀、化痰止咳平喘等作用?，F(xiàn)代研究顯示，川芎有效成分川芎嗪具有保護(hù)血管內(nèi)皮損傷、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖與遷移等作用[14-15]。丹參酮ⅡA對(duì)PH的保護(hù)主要通過(guò)抑制肺血管異常收縮、肺血管重構(gòu)，改善肺部血管炎癥反應(yīng)，改善右心室功能等發(fā)揮作用；芍藥苷具有抗凝血、擴(kuò)血管作用[16]；當(dāng)歸提取物當(dāng)歸注射液可抑制肺小動(dòng)脈管壁增厚，降低肺血管壓力[17]。MCT在體內(nèi)經(jīng)肝臟代謝成為有生物活性的脫氫野百合堿，選擇性地引起肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凋亡，促進(jìn)內(nèi)源性NO的合成分泌降低，縮血管物質(zhì)釋放增加，導(dǎo)致肺動(dòng)脈持續(xù)收縮，誘導(dǎo)肺動(dòng)脈血管重構(gòu)，導(dǎo)致PH[18]。MCT誘導(dǎo)的PH模型可見(jiàn)明顯血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、肺動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖、動(dòng)脈管壁明顯增厚，肺血管重構(gòu)[19]。本研究顯示,經(jīng)MCT腹腔注射誘導(dǎo)后，模型組大鼠動(dòng)物活動(dòng)量減少，呼吸急促加快、煩躁，食欲下降，體重減輕，肺動(dòng)脈壓力、右心指數(shù)均較假手術(shù)明顯升高，肺血管WT比例較假手術(shù)組增加，中藥復(fù)方組、法舒地爾組均較模型組大鼠體重升高，肺動(dòng)脈壓力、右心指數(shù)下降，肺血管WT比例降低，表明中藥復(fù)方能夠降低MCT誘導(dǎo)的PH，減輕右心負(fù)荷，抑制肺動(dòng)脈血管的增殖。導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓血管重構(gòu)的機(jī)制有K+離子通道、Rho激酶信號(hào)通路、BMP信號(hào)通路等[20]，其中Rho激酶相關(guān)通路在肺血管重構(gòu)中具有重要作用，Rho激酶存在兩種同源性極高的異構(gòu)體形式 (Rokα/ROCKⅠ 和Rokβ/ROCKⅡ)，激活的Rho 激酶可對(duì)其底物肌球蛋白磷酸酶進(jìn)行磷酸化修飾，引起細(xì)胞骨架重組，促進(jìn)血管平滑肌收縮，平滑肌細(xì)胞的遷移、增殖，導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓血管重構(gòu)[21]。Rho激酶信號(hào)介導(dǎo)PASMC和EC中的細(xì)胞骨架重排，Rho激酶(ROCK)信號(hào)通路在介導(dǎo)所有PH模型中的血管收縮中起核心作用，Rho激酶抑制劑能防治MCT誘導(dǎo)的和基因易感型的大鼠PH，從而改善內(nèi)皮依賴性的血管舒張，抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，促進(jìn)肺血管收縮和肺血管結(jié)構(gòu)重建，參與PH的發(fā)病過(guò)程。本研究顯示，MCT誘導(dǎo)后，與假手術(shù)組比較，模型組ROCKⅠ、ROCKⅡ表達(dá)明顯增加，給藥后中藥復(fù)方組、法舒地爾組ROCKⅠ、ROCKⅡ表達(dá)水平較模型組明顯下降，中藥復(fù)方組與法舒地爾組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明活血化瘀祛痰法可以抑制Rho激酶信號(hào)通路的激活，抑制PH血管重構(gòu)。