莽吉柿果殼不同萃取物中總黃酮、總酚含量及抗菌活性

林月喬，張子樺，續(xù)文麗，李楠，劉輝，陳鑫*

佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院（佛山 528000）

莽吉柿（Garcinia mangostana L.）屬藤黃科藤黃屬植物，別名山竹、倒捻子，主要分布于泰國(guó)、馬來(lái)西亞和印度尼西亞等東南亞國(guó)家，我國(guó)臺(tái)灣、云南和廣東等省有引種。莽吉柿不僅富含營(yíng)養(yǎng)，其果殼還具有廣泛的藥用價(jià)值。在東南亞國(guó)家，果皮可用于煲湯或泡茶，用于治療淋病、腹瀉、口瘡等[1]。晾干并碾磨后的果殼可作為傳統(tǒng)藥物，常用于治療腹痛、感染性創(chuàng)傷、慢性潰瘍等疾病[2]。目前研究已發(fā)現(xiàn)，莽吉柿果殼具有強(qiáng)大的抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒及抗菌等藥理活性，其化學(xué)成分主要包括黃酮、多酚[3]、氧雜蒽酮等[1]。

目前，對(duì)莽吉柿果殼的研究主要集中在總黃酮、總酚提取工藝和抗氧化活性。關(guān)于其不同極性有機(jī)溶劑萃取部位的研究及抑菌活性鮮有報(bào)道。本研究采用三氯化鋁分光光度法和福林酚法對(duì)莽吉柿果殼不同溶劑萃取物中總黃酮、總酚含量進(jìn)行測(cè)定，并采用紙片擴(kuò)散法和微量肉湯稀釋法對(duì)院內(nèi)感染的主要細(xì)菌種類進(jìn)行抑菌活性評(píng)價(jià)，為莽吉柿的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

莽吉柿（市售）；蘆丁對(duì)照品、沒(méi)食子酸對(duì)照品（純度均＞98%，成都德斯特生物技術(shù)有限公司）；石油醚、氯仿、乙酸乙酯、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、碳酸鈉（廣州化學(xué)試劑廠）；亞硝酸鈉、氯化鈉、硝酸鋁、福林酚（上海麥克林生化科技有限公司）；有機(jī)溶劑（均為國(guó)產(chǎn)分析純）；胰蛋白胨、牛肉浸膏。

菌株：大腸桿菌（E.coli）、金黃色葡萄球菌（S.aureus）、肺炎克雷伯菌（K.pneumoniae）、銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）、鮑曼不動(dòng)桿菌（A.baumannii）（佛山市中醫(yī)院檢驗(yàn)科）。

JJ500電子天平、JJ224BC萬(wàn)分之一分析天平（常熟市雙杰測(cè)試儀廠）；島津UV-2700紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；YRE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；CSH-ZY-00032銳思捷純水系統(tǒng)（廈門(mén)銳思捷水純化技術(shù)有限公司）；GR-85DA高壓滅菌鍋（美國(guó)致微）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

取300 g干燥莽吉柿果殼，碾磨后用8倍量的95%乙醇回流提取2次，減壓濃縮得到醇提取物，經(jīng)水混懸后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯進(jìn)行萃取，分別減壓回收溶劑，干燥至恒重，得到石油醚萃取物（1.322 g）、氯仿萃取物（1.785 g）、乙酸乙酯萃取物（3.562 g）和水層（6.264 g）。

1.2.2 總黃酮含量測(cè)定

采用三氯化鋁分光光度法[4]。精密稱取12.5 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度，得到質(zhì)量濃度0.25 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用移液管移取0，0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 mL配制好的標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別置于10 mL容量瓶中，分別依次加入2.5，2.0，1.5，1.0，0.5和0 mL的無(wú)水乙醇，依次加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，混勻后放置6 min，加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，混勻后放置6 min，加入4 mL 10%氫氧化鈉溶液，混勻后放置6 min，加入80%乙醇溶液定容至刻度，搖勻放置15 min。用紫外分光光度儀在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=1.169 6x-0.014 3，R2=0.999 3。樣品中黃酮測(cè)定按上述方法。總黃酮含量以每1 g干萃取物中毫克蘆丁當(dāng)量（rutin equivalents，RE）表示（mg RE/g）。

1.2.3 總酚含量測(cè)定

采用福林酚比色法[5]。精密稱量1 mg沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用75%乙醇定容至刻度，得到濃度0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密移取0，0.1，0.3，0.5，0.7和0.9 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，分別依次加入1.0，0.9，0.7，0.5，0.3和0.1 mL的75%乙醇，再依次加入6 mL超純水、0.5 mL福林酚試劑、1.5 mL 20%碳酸鈉溶液，加入超純水定容至刻度，混勻靜置30 min。用紫外分光光度儀在720 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=12.403x+0.036 3，R2=0.999 7。樣品中總酚測(cè)定按上述方法，總酚含量以每1 g干萃取物中毫克沒(méi)食子酸當(dāng)量（gallic acid equivalents，GAE）表示（mg GAE/g）。

1.2.4 抑菌活性測(cè)試

1.2.4.1 營(yíng)養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）培養(yǎng)基的制備

取10 g胰蛋白胨、5 g氯化鈉、3 g牛肉浸膏加入1 000 mL無(wú)菌蒸餾水中，水浴加熱攪拌至完全溶解后，置于高壓蒸汽滅菌鍋中，于121 ℃高壓滅菌15 min，密封后放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2 菌株復(fù)蘇及傳代

菌種的復(fù)蘇：鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌菌株從-80℃冰箱中取回，并分別在超凈臺(tái)中采用四區(qū)劃線法接種于固體培養(yǎng)基上，后將培養(yǎng)基放置于37 ℃的細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌種復(fù)蘇。

菌種的傳代：取出上述已復(fù)蘇好的細(xì)菌培養(yǎng)基，在超凈臺(tái)中輕輕蘸取某一單菌落，在另一新的固體培養(yǎng)基中采用四區(qū)劃線法進(jìn)行劃線接種，劃線完畢后將放置于37 ℃的細(xì)菌培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24 h。

1.2.4.3 菌懸液的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[6]，略作修改。取平板中新鮮培養(yǎng)的經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代后的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌各兩株，分別刮取少量菌落，用營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基稀釋成0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫龋?.5×108CFU/mL）菌液，再用NB液體培養(yǎng)基按1∶1 000稀釋。

1.2.4.4 藥敏紙片的制備

先制備試驗(yàn)藥品，分別稱取5 g不同萃取物，滅菌水溶解后調(diào)整藥物濃度為100 mg/mL。后將直徑為5 mm的滅菌空白紙片放入無(wú)菌的藥敏瓶中，分別加入配制好的藥物溶液，浸泡12 h后烘干備用。

1.2.4.5 紙片擴(kuò)散法（K-B）法測(cè)定抑菌作用

取新鮮菌液配制成0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫?，取適量菌懸液均勻涂布于瓊脂培養(yǎng)基，反復(fù)3次。取含有不同萃取物的藥敏紙片分別貼于固體培養(yǎng)基的表面，陽(yáng)性對(duì)照取商品化的慶大霉素（10 IU/片），于37 ℃恒溫培養(yǎng)16～20 h，使用游標(biāo)卡尺精準(zhǔn)測(cè)量菌落的直徑，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4.6 最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

采用微量肉湯稀釋結(jié)合96孔板培養(yǎng)法測(cè)定MIC[7]。取96孔板，標(biāo)記好藥物提取液名稱，并且將第11孔以及第12孔設(shè)置為“菌陽(yáng)性對(duì)照組”、“培養(yǎng)基空白對(duì)照組”。第1排的第一個(gè)孔加入200 μL 1.6 mg/mL的提取液，從第2孔開(kāi)始每孔加入100 μL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，用排槍從第1孔中取100 μL提取液至第2孔，反復(fù)抽放、混勻，按上述步驟依次完成至第10孔，棄去100 μL，完成藥液的倍比稀釋。從第1排至第11排每孔依次加入100 μL 0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫认♂? 000倍的菌液，第12孔中補(bǔ)充100 μL 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，最終每孔內(nèi)液體體積應(yīng)為200 μL，后置于培養(yǎng)箱37 ℃恒溫培養(yǎng)16～20 h。結(jié)果的判定：在標(biāo)記為“+”的孔有細(xì)菌生長(zhǎng)且標(biāo)記為“-”的孔澄清的前提下，最后一個(gè)澄清、沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)的孔的藥物濃度即最小抑菌濃度MIC。

1.2.4.7 最低殺菌濃度（MBC）的判定

依次將沒(méi)有肉眼可見(jiàn)的細(xì)菌生長(zhǎng)的各孔取適量液體均勻涂布于瓊脂固體平板上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)16～20 h，觀察是否有細(xì)菌生長(zhǎng)，若平板上菌落數(shù)少于 5個(gè)，即以其最小藥液濃度作為最低殺菌濃度（MBC）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均平行操作3次，試驗(yàn)結(jié)果均表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”。數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用ANOVA進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 莽吉柿果殼不同溶劑萃取物中總黃酮和總酚含量

由表1可知，莽吉柿果殼4種不同溶劑萃取物中均含有總黃酮和總酚，總黃酮含量為乙酸乙酯＞水＞氯仿＞石油醚，總酚含量為乙酸乙酯＞石油醚＞氯仿＞水。乙酸乙酯萃取物中總黃酮和總酚的含量最高，與其他各組具有顯著性差異（P＜0.001）。石油醚和氯仿中總黃酮和總酚的含量均較低，其中總酚含量比較接近。水層中總酚含量最低。所測(cè)得總黃酮和總酚含量均高于祝思宇等[3]測(cè)定山竹果殼中的含量，提示不同極性溶劑萃取是富集總黃酮和總酚的有效方法。

表1 莽吉柿果殼不同溶劑萃取物總黃酮和總酚含量（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）

2.2 莽吉柿果殼不同溶劑萃取物對(duì)試驗(yàn)菌的抑菌效果

2.2.1 K-B紙片擴(kuò)散法試驗(yàn)

由表2可知，莽吉柿果殼不同溶劑萃取物對(duì)不同試驗(yàn)菌的抑菌作用差異較大，其中乙酸乙酯萃取物和水層的活性最佳，對(duì)5種試驗(yàn)菌的抑菌圈直徑基本都大于15 mm，表現(xiàn)為高度敏感或極度敏感，其中金黃色葡萄球菌的抑菌圈24.3±0.15 mm/23.8±0.19 mm，甚至大于陽(yáng)性對(duì)照藥物慶大霉素（10 IU/片）21.3±0.17 mm。石油醚和氯仿萃取物僅對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯抗菌活性，抑菌圈直徑均超過(guò)20 mm，且優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥物慶大霉素，表現(xiàn)為極度敏感，對(duì)其余4種受試菌抑菌圈均不明顯，表現(xiàn)為低敏。

2.2.2 MIC值和MBC值的測(cè)定

由表3和表4可知，莽吉柿果殼不同溶劑萃取物對(duì)5種不同試驗(yàn)菌的MIC值、MBC值與紙片擴(kuò)散法的結(jié)果基本一致，乙酸乙酯萃取物和水層對(duì)5種菌都表現(xiàn)出很好的抗菌活性，其中對(duì)金黃色葡萄球菌活性最好，MIC值均為0.125 mg/mL，MBC值均為0.25 mg/mL，對(duì)大腸桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌的MIC值均在0.5～2 mg/mL，MBC值均在1～4 mg/mL。石油醚和氯仿萃取物僅對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯抗菌活性，MIC值分別為0.5和0.25 mg/mL對(duì)其他4種試驗(yàn)菌MIC均為8 mg/mL。李武超等[8]研究表明山竹果皮總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門(mén)菌、假單胞菌的抑菌圈分別為10.20，14.20，15.37和15.97 mm。Cunha等研究發(fā)現(xiàn)，與氨芐西林相比，山竹乙醇提取物抗菌活性更高，MIC值在1～10 g/L，同時(shí)細(xì)菌耐藥性更低[9]。Janardhanan等[10]研究山竹果皮氯仿提取物對(duì)致齲菌的影響，MIC值最低的是嗜酸乳桿菌（MIC 25 mg/mL）。試驗(yàn)結(jié)果與上述研究一致，但經(jīng)不同溶劑萃取后作用強(qiáng)于總提取物。

表3 莽吉柿果殼不同溶劑萃取物對(duì)試驗(yàn)菌的MIC

表4 莽吉柿果殼同溶劑萃取物對(duì)試驗(yàn)菌的MBC

3 結(jié)論

此次研究測(cè)定了莽吉柿果殼提取物的不同溶劑萃取物總黃酮、總酚的含量，并檢測(cè)了各個(gè)部位對(duì)引起院內(nèi)感染的主要細(xì)菌大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌的抑菌作用。結(jié)果顯示，各萃取物中總黃酮的含量為乙酸乙酯＞水＞氯仿＞石油醚?？偡雍繛橐宜嵋阴ィ臼兔眩韭确拢舅?。乙酸乙酯萃取物中總黃酮和總酚的含量最高，水層中總黃酮含量高于石油醚和水層，而總酚含量最低。乙酸乙酯萃取物和水層對(duì)5種菌均具有較好的活性，其中金黃色葡萄球菌活性最佳，MIC均為0.125 mg/mL，抑菌圈優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥物慶大霉素，該菌株對(duì)這2種萃取物變表現(xiàn)為極度敏感，其他4種菌則表現(xiàn)為高度敏感。石油醚和氯仿萃取物僅對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯抑菌活性，對(duì)其他4種菌株抑菌作用均不明顯。多項(xiàng)研究表明黃酮類成分具有較好的抗菌作用[8-11]。試驗(yàn)結(jié)果顯示抗菌活性與總黃酮含量呈正相關(guān)，提示抗菌活性可能與總黃酮含量有關(guān)，因此認(rèn)為莽吉柿果殼中抗菌的活性成分集中在乙酸乙酯部位。