燕麥配方對(duì)酪氨酸酶活性及黑色素抑制作用

木其爾，陳希民，陳月曉*

1.北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所（北京 100069）；2.北京市科學(xué)技術(shù)研究院（北京 100089）

隨著年齡增長(zhǎng)，色素沉積、膚色暗黃等皮膚癥狀為東方女性追求美麗過(guò)程中越來(lái)越重視的問(wèn)題。黑色素的代謝在膚色改善中發(fā)揮著重要作用[1]。目前曲酸[2]、維生素C[3-4]、亞油酸[5]等酸性成分是抑制黑色素形成的主要功效物質(zhì)，但具有溶解性差、配伍性差及不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。而天然植物提取物，如洋甘菊提取物、甘草提取物、熊果苷[6-8]等，具有安全性高、刺激性小、療效顯著等優(yōu)點(diǎn)，但易受使用劑量較小、皮膚屏障滲透吸收利用率低等因素的影響。

研究表明，燕麥中含有豐富的酚酸、類黃酮等化合物，具有較好的抗氧化功效[9-10]；燕麥生物堿提取物具有抗組胺和抗炎活性[11-12]，其美白功效研究卻鮮有報(bào)導(dǎo)。傳統(tǒng)中藥中具有美白功效的中藥材薏苡仁、茯苓、山藥、白蕓豆均被納入國(guó)家衛(wèi)健委食品安全標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)評(píng)估司發(fā)布的《按照傳統(tǒng)既是食品優(yōu)勢(shì)中藥材的物質(zhì)目錄管理規(guī)定》中。煙酰胺在臨床中具有抑制黑色素、加快皮膚細(xì)胞代謝以實(shí)現(xiàn)改善膚質(zhì)的效果[13]。此次試驗(yàn)選擇燕麥、椰粉、藥食同源原料及煙酰胺鋅作為品牌A即食麥片配方基礎(chǔ)，通過(guò)體外酪氨酸酶抑制實(shí)驗(yàn)研究其對(duì)酪氨酸酶活性抑制的作用及黑色素抑制作用，并探索配方中燕麥、椰粉、煙酰胺鋅成分的酪氨酸酶活性抑制及黑色素抑制效果，為產(chǎn)品研發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

品牌A即食麥片（桂格5白混合即食麥片，主要原料包括燕麥、椰子粉、煙酰胺、藥食同源原料、鋅等）；燕麥片、椰子粉、煙酰胺鋅、燕麥椰子粉組合，均由百事亞洲研發(fā)中心有限公司提供。

蒸餾水（符合GB/T 6682—2016《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》規(guī)定的一級(jí)水）；磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 6.8，0.1 mol/L）；L-酪氨酸（分析純，T3754，純度＞98%，Sigma公司）；酪氨酸酶（T3824，1 000 U/mg，Sigma公司）；曲酸（S30151，上海源葉生物科技有限公司）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

ME235s電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；ML204T電子天平[梅特勒托利多儀器（上海）有限公司]；DH-101-3BS電熱恒溫箱（天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電路有限公司）；KQ-500DE超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；BioTek F4酶標(biāo)儀（美國(guó)寶特公司）；-80 ℃超低溫冰箱（冠森生物科技上海公司）；96孔酶標(biāo)板[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]；NT-6L納米研磨機(jī)（無(wú)錫市少宏粉體科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溶液配制

稱取0.025g L-酪氨酸，使用PBS緩沖液溶解，超聲助溶5 min，定容至50 mL，得到L-酪氨酸溶液。

稱取2.5 mg酪氨酸酶，用PBS溶液定容至5 mL，于-20 ℃保存。

稱取40 mg曲酸，用PBS溶液定容至1 L，制備成0.040 g/L曲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用PBS溶液逐級(jí)梯度稀釋，最終制備成0.040，0.020，0.010，0.008，0.005和0.002 g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 樣本處理

燕麥片、椰子粉、燕麥椰子粉組合、品牌A即食麥片分別使用納米研磨機(jī)研碎。

分別稱取70.71 mg燕麥片、9.3 mg椰子粉、79.45 mg燕麥椰子組合、100 mg品牌A即食麥片的研磨粉于10 mL容量瓶中，分別加入PBS溶液，37 ℃恒溫條件下超聲30 min，并定容至10 mL，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，旋渦離心5 min，制備混懸液待測(cè)。

稱取0.05 mg煙酰胺鋅，溶于1 000 mL PBS溶液中，混勻待測(cè)。

0.025g L-酪氨酸，使用PBS緩沖液溶解，超聲助溶5 min，定容至50 mL，得到L-酪氨酸溶液。

1.3.3 試驗(yàn)分組

在96孔酶標(biāo)板中設(shè)置溶劑本底孔（編號(hào)Ta）、溶劑反應(yīng)孔（編號(hào)Tb）、樣品本底孔（編號(hào)Tc）、樣品反應(yīng)孔（編號(hào)Td）。其中：Ta組為溶劑本底組，不加底物L(fēng)-酪氨酸溶液、不加樣品溶液；Tb組為溶劑反應(yīng)組，加底物L(fēng)-酪氨酸溶液但不加樣品溶液；Tc組為樣品本底組，不加底物L(fēng)-酪氨酸溶液、加樣品溶液；Td組為樣品反應(yīng)組，既加底物L(fēng)-酪氨酸溶液又加樣品溶液。每組做3個(gè)平行。

1.3.4 試驗(yàn)檢測(cè)

根據(jù)表1，在1.5 mL離心管中依次加入相應(yīng)體積的PBS溶液、酪氨酸酶及5種樣品混懸液，同時(shí)按照1.3.1的劑量設(shè)定曲酸溶液陽(yáng)性對(duì)照組和除樣品外的空白對(duì)照組，每樣設(shè)置3個(gè)平行。振蕩混勻后，于37 ℃恒溫箱中孵育10 min，每孔加入49 μL酪氨酸酶溶液，混勻，于37 ℃恒溫箱中孵育5 min，在-4 ℃冷凍離心機(jī)中以20 000 r/min離心5 min，每樣取10 μL添加于96孔酶標(biāo)板中，酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔吸光度（A），檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為475 nm。

表1 酪氨酸酶活性抑制試驗(yàn)加樣表

1.3.5 結(jié)果計(jì)算

酪氨酸酶活性抑制率按式（1）計(jì)算。

式中：Y為酪氨酸酶活性抑制率；Ad為樣品反應(yīng)孔吸光度；Ac為樣品本底孔吸光度；Ab為溶劑反應(yīng)孔吸光度平均值；Aa為溶劑本底孔吸光度平均值。

1.3.6 曲酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

以曲酸的濃度為橫坐標(biāo)，其對(duì)應(yīng)的酪氨酸酶抑制率為縱坐標(biāo)，繪制曲線，擬合得到回歸方程（R2≥0.9）。根據(jù)回歸方程，計(jì)算酪氨酸酶抑制率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的曲酸濃度，即為曲酸的IC50值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

試驗(yàn)每樣設(shè)置3個(gè)平行，數(shù)據(jù)采用Excel（2016 MSO）表格進(jìn)行整理，并采用SPSS（version 18.0，IBM）軟件分析處理，采用ANOVA檢驗(yàn)5種檢測(cè)樣品酪氨酸抑制率的差別，雙側(cè)P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 曲酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果

結(jié)果（表2和圖1）顯示，酪氨酸酶抑制率與曲酸濃度呈正相關(guān)關(guān)系，在濃度0.002～0.010 g/L之間酪氨酸酶抑制率增加幅度較高，而隨著濃度逐漸增加，曲酸對(duì)酪氨酸酶的抑制效果趨于平緩，最終在濃度0.04 g/L時(shí)達(dá)到87.255%。計(jì)算酪氨酸酶抑制率50%時(shí)，曲酸的對(duì)應(yīng)濃度（IC50）為0.014 6 g/L，處于0.005～0.030 g/L范圍內(nèi)，證明試驗(yàn)檢測(cè)系統(tǒng)有效。

圖1 曲酸酪氨酸酶抑制率標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 曲酸標(biāo)準(zhǔn)濃度及對(duì)應(yīng)的抑制率

2.2 樣品酪氨酸酶抑制率檢測(cè)結(jié)果

酪氨酸酶抑制率檢測(cè)結(jié)果顯示（圖2），燕麥、椰粉及煙酰胺單獨(dú)使用酪氨酸酶抑制率分別為11.62%，8.44%和1.54%。燕麥椰粉組合使用酪氨酸酶抑制率為23.93%，顯著高于燕麥和椰粉單獨(dú)使用抑制率（P＜0.05），且呈現(xiàn)一定協(xié)同作用；品牌A即食麥片酪氨酸酶抑制率為23.79%，與燕麥椰粉組合使用抑制效果一致，說(shuō)明在品牌A即食麥片發(fā)揮主要作用的為燕麥和椰粉2種成分，這可能與復(fù)配產(chǎn)品中燕麥和椰粉成分總體占比較高有關(guān)。

圖2 5種樣品酪氨酸酶抑制率檢測(cè)結(jié)果

3 討論

曲酸是從曲霉真菌中分離出來(lái)的次生代謝產(chǎn)物，臨床上主要用于減輕色素和皮膚脫色[14]，對(duì)酪氨酸酶單酚酶和二酚酶活性均具有較強(qiáng)的抑制作用，且呈現(xiàn)較好的量效反應(yīng)關(guān)系，被證實(shí)最適合作為陽(yáng)性對(duì)照的化合物[15]，在國(guó)內(nèi)外體美白成分試驗(yàn)研究[16-17]中均被廣泛應(yīng)用。試驗(yàn)中，曲酸的IC50為0.014 6 g/L，與其他相關(guān)研究結(jié)果一致[18]，表明試驗(yàn)采用曲酸作為陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果可靠。

L-酪氨酸氧化是黑色素合成的起始步驟，酪氨酸酶是定位在黑色素小體膜上的糖蛋白，是研究黑色素異常沉積的分子靶標(biāo)[19]。黑色素在細(xì)胞黑素小體的合成過(guò)程受酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1（TYRP1）和l酪氨酸酶相關(guān)蛋白2（TYRP2）的調(diào)控，其中酪氨酸酶TYR和TYRP2是影響黑色素?cái)?shù)量和質(zhì)量的關(guān)鍵限速酶[20]，能夠催化L-酪氨酸羥基化為L(zhǎng)-多巴醌（DQ），是黑色素合成的限速步驟[21]。酪氨酸酶的過(guò)量表達(dá)與黑色素的沉積等的發(fā)生有密不可分的關(guān)系[22-23]。當(dāng)酪氨酸酶過(guò)量表達(dá)時(shí)，黑色素過(guò)度沉積而形成皮膚色斑，而酪氨酸酶表達(dá)不足則會(huì)引起白化病、白癜風(fēng)等疾病[24]。而細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)下，皮膚表皮細(xì)胞內(nèi)巰基氧化失去抑制TYR能力，也會(huì)導(dǎo)致黑色素的合成量增加[25]。一般來(lái)說(shuō)不同膚色黑色素細(xì)胞中的酪氨酸酶表達(dá)量無(wú)明顯差異[26]，對(duì)酪氨酸酶進(jìn)行活性調(diào)節(jié)成為影響黑色素合成的關(guān)鍵所在。在既往研究中，對(duì)氨酸酶的活性研究大多局限于中藥或提取物，但普通食物對(duì)酪氨酸酶的活性研究較少。

燕麥中多酚可抑制角質(zhì)形成細(xì)胞中核因子Kappa B的活性和組胺釋放，減少皮膚皺紋，保護(hù)表皮細(xì)胞DNA免受包括紫外線照射在內(nèi)的環(huán)境損害[27]。與此同時(shí)，燕麥中的β-葡聚糖上調(diào)鈣敏感受體（CaSR）的表達(dá)，增加細(xì)胞外鈣離子的敏感性，共同誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞分化和神經(jīng)酰胺合成[28]。椰肉中L-精氨酸及多酚化合物對(duì)超氧陰離子自由基、DPPH·自由基和羥基自由基均有較強(qiáng)的清除能力[29]。椰油通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平及提高細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶SOD、過(guò)氧化氫酶CAT和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GSH-Px活性，起到保護(hù)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用[30-31]。盡管試驗(yàn)原料，如燕麥和椰子粉中含有這些活性物質(zhì)，但鮮有針對(duì)燕麥、椰子粉與酪氨酸酶直接作用的研究。

與此同時(shí)，依據(jù)該產(chǎn)品的配料信息，除燕麥椰子粉等，也含有一些藥食同源的傳統(tǒng)食材，如薏苡仁、山藥、茯苓等。藥食同源植物兼具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及藥用價(jià)值，在普通食品、藥品及功能食品領(lǐng)域中被廣泛研究應(yīng)用，其中薏苡仁、山藥、茯苓及白蕓豆作為傳統(tǒng)美白方劑如七白散、三白湯等的要藥，在增白祛斑等皮膚改善過(guò)程中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)：薏苡仁可有效降低中波紫外線照射后人體HSF細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶1,3 mRNA表達(dá)，抵抗皮膚光老化[32]；山藥中山藥多糖和山藥皂苷促進(jìn)人體成纖維細(xì)胞WS1分泌膠原，對(duì)移植性黑色素B16細(xì)胞增殖及黑色素形成具有很強(qiáng)的抑制作用[33]；茯苓抑制皮膚酪氨酸酶mRNA并提高皮膚轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-1和抗氧化蛋白的表達(dá)[34]。

隨著人們健康要求的提高，通過(guò)攝取的食品來(lái)調(diào)整機(jī)體的生理機(jī)能達(dá)到健康狀態(tài)替代對(duì)食品的感官單一要求。抑制黑色素形成和美白產(chǎn)品的研發(fā)思路主要以酪氨酸酶抑制劑為主，通過(guò)抑制酪氨酸酶活性和調(diào)節(jié)酪氨酸酶的轉(zhuǎn)錄作為美白添加劑的作用靶點(diǎn)，且研發(fā)多局限于護(hù)膚品范圍內(nèi)，因此對(duì)具有抑制黑色素形成和美白功效的食品提出新的研發(fā)需求。配方在燕麥、椰子粉等可直接入食產(chǎn)品基礎(chǔ)上，添加煙酰胺鋅，并合理搭配藥食同源目錄中具有美白功效的原料，擬通過(guò)食用方式達(dá)到改善皮膚狀態(tài)的目的。經(jīng)檢測(cè)，配方產(chǎn)品對(duì)酪氨酸酶活性具有一定抑制作用。

4 結(jié)論

綜上研究，燕麥、椰粉及傳統(tǒng)藥食同源原料在抑制酪氨酸酶活性及抑制黑色素形成上均發(fā)揮重要作用。在體外酪氨酸酶抑制率檢測(cè)中，燕麥、椰粉、煙酰胺鋅單獨(dú)使用或組合使用均具有酪氨酸酶活性抑制的功能，燕麥和椰粉組合表現(xiàn)出一定協(xié)同作用。該燕麥配方是否可通過(guò)食用方式直接作用于改善皮膚需進(jìn)一步的臨床驗(yàn)證和深入研究。然而，經(jīng)體外試驗(yàn)證實(shí)，品牌A即食麥片能夠抑制黑色素形成的關(guān)鍵酶——酪氨酸酶的活性，其中發(fā)揮主要作用的為燕麥和椰粉。