分析化學(xué)在藥物研發(fā)中的作用

趙曉輝，劉來亮

（淄博市食品藥品檢驗研究院，山東淄博 255000）

藥品研發(fā)是一個復(fù)雜的過程，從最初的想法到推出成品可能需要12-15a的時間。目標(biāo)藥物的選擇有多種來源，例如學(xué)術(shù)研究和臨床研究等。在一項藥物研發(fā)計劃選擇目標(biāo)藥物之前，需要經(jīng)歷多年的時間來建立一整套支持證據(jù)驗證其療效。一旦選定了目標(biāo)藥物，制藥業(yè)和最近的一些學(xué)術(shù)中心就會簡化一些早期過程，以識別具有適當(dāng)特性的分子，從而生產(chǎn)出可接受的藥物。本文主要介紹藥物研發(fā)的臨床前階段，從最初的靶點識別和驗證開始，論述活性藥物分離、鑒定和定量分析的一般方法和考慮因素，這些分析方法可應(yīng)用于藥物開發(fā)的各個階段。

1 藥物研發(fā)過程

藥物研發(fā)是從發(fā)現(xiàn)到質(zhì)量、療效和安全性表征的復(fù)雜過程，需要廣泛的科學(xué)專業(yè)知識。研發(fā)機(jī)構(gòu)必須充分地設(shè)定藥物靶點并選出成功概率最高的化合物。從最初的發(fā)現(xiàn)階段到藥物可用于治療患者，研發(fā)一種新藥可能需要長達(dá)15a的時間。藥物研發(fā)包括以下五個主要階段。

1）發(fā)現(xiàn)或發(fā)現(xiàn)前階段。首先確定一個有治療效果的藥物靶點并明確它對疾病的影響，此過程需要1~2a時間。隨后，依據(jù)藥物靶點篩選先導(dǎo)化合物，此過程需要1~2a時間。進(jìn)而，提高先導(dǎo)化合物的效果和安全性，此過程需要1~2a時間。

2）臨床前階段。主要任務(wù)為藥理學(xué)研究和藥劑學(xué)研究，此過程需耗時約1a時間。藥理學(xué)研究包括毒理學(xué)試驗、動物實驗等，藥劑學(xué)研究主要是劑型的確認(rèn)以及處方的篩選。

3）臨床研究階段。一期臨床試驗階段主要任務(wù)是確認(rèn)安全劑量，需要20~100名健康志愿者。二期臨床試驗階段主要任務(wù)是分析藥物的療效并檢驗其短期的副作用，需要100~500名病患志愿者。三期臨床試驗階段主要任務(wù)是確認(rèn)藥物的療效并檢驗其長期的副作用，需要1 000~5 000名病患志愿者。

4）獲得藥物監(jiān)督管理局的審批。

5）藥物上市以及四期臨床試驗，主要任務(wù)是進(jìn)一步考察藥物的安全有效性。

2 分析方法在藥物研發(fā)中的作用

2.1 滴定法（Titrimetric Methods）

滴定法仍被使用，特別是在歐洲藥典中。這些方法的優(yōu)點是省時省力，精密度高，不需要使用標(biāo)準(zhǔn)品。非水滴定法是藥物分析中常用的方法，可以推廣到弱酸和弱堿。在大多數(shù)情況下，用電位法檢測終點，從而提高了方法的精密度。在滴定法的情況下，測定的下限和上限通常在分別為98.0%~99.0%和100.5%~102.0%（最典型為99.0%~101.0%）。近年來，滴定法已用于商品劑型中厄貝沙坦和富馬酸酮替芬的測定[1]。

2.2 高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）

高效液相色譜法首次用于原料藥的分析是在1980年。目前，高效液相色譜法已廣泛應(yīng)用于藥物的研究開發(fā)和制藥生產(chǎn)中。在研究和開發(fā)中的應(yīng)用包括新藥合成的純度控制、藥物和制劑穩(wěn)定性測試過程中產(chǎn)品的分離以及藥代動力學(xué)，即測定在代謝和臨床研究過程中生物體液中的藥物和代謝產(chǎn)物。在醫(yī)藥生產(chǎn)中，高效液相色譜法廣泛應(yīng)用于原料藥和最終劑型的質(zhì)量控制。從各種色譜技術(shù)的使用率中可以看出，高效液相色譜是藥物雜質(zhì)分析的主要技術(shù)之一。選擇合適的檢測方式是確保檢測到所有組分的關(guān)鍵。在紫外光檢測中，可通過多波長掃描程序解決這一問題，該程序可以同時監(jiān)測幾個波長，并確保檢測限以上的所有吸收紫外光的成分都被檢測到。光電二極管陣列檢測器是高效液相色譜檢測對映體藥物純度的有效方法。紫外吸光度檢測的反相色譜模式是常用的分析模式，能夠確保最佳的可靠性、分析時間、重復(fù)性和靈敏度。由此可見，高效液相色譜在藥物研發(fā)中發(fā)揮了重要作用。高效液相色譜法的局限性包括色譜柱和溶劑的成本，以及色譜柱填料缺乏長期的可重復(fù)性。

液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Liquid Chromatography- Mass Spectrome，LC-MS）已成為近30a以來最重要的技術(shù)之一，是藥劑學(xué)中許多質(zhì)量控制和保證階段分析支持的首選方法。近年來，高效液相色譜-質(zhì)譜已被用于藥物的分析[2-3]。

2.3 氣相色譜（Gas Chromatography，GC）

氣相色譜法（GC）是一種分離和檢測揮發(fā)性有機(jī)化合物的動態(tài)方法。氣-液色譜法在制藥產(chǎn)品的分析中起著重要作用。該技術(shù)的主要限制在于藥物的相對不揮發(fā)性，例如無法應(yīng)用于高分子量產(chǎn)品如多肽或熱不穩(wěn)定抗生素的檢測。近年來，氣相色譜已被用于藥物的測定[4-5]。由于大多數(shù)藥物材料的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性不足，氣相色譜只能在有限的情況下用于藥物檢測。

2.4 毛細(xì)管電泳（Capillary Electrophoresis，CE）

“毛細(xì)管電泳”是指在電場影響下的窄孔毛細(xì)管中進(jìn)行分離的一系列相關(guān)技術(shù)。毛細(xì)管電泳已迅速成為一種強(qiáng)大的分離有機(jī)或無機(jī)大分子和小分子的技術(shù)，并在環(huán)境、臨床、法醫(yī)、生化和藥物分析等各個領(lǐng)域得到了應(yīng)用。與其他技術(shù)相比，毛細(xì)管電泳具有分辨率高、樣品和溶劑消耗低、檢測器類型靈活多變等優(yōu)點。毛細(xì)管電泳可應(yīng)用于水和非水介質(zhì)中，并且可以與多種檢測器耦合。此外，由于毛細(xì)管電泳具有很高的效率，該技術(shù)在分離對映體方面具有出色的應(yīng)用效果。

2.5 薄層色譜（Thin Layer Chromatography，TLC）

20世紀(jì)60年代薄層色譜（TLC）的發(fā)明和迅速推廣開創(chuàng)了藥物分析領(lǐng)域的一個全新局面。薄層色譜是篩選藥物制劑中未知物質(zhì)的有力工具，它具有相對較高的分離效率，即藥物的所有可分離的成分都能夠被分離。利用薄層色譜的高特異性，采用斑點洗脫和分光光度法進(jìn)行定量分析。薄層色譜法已被應(yīng)用于幾種降壓藥（美托洛爾和非洛地平）的測定[6]。

2.6 高效薄層色譜（High Performance Thin Layer Chromatography，HPTLC）

高效薄層色譜因操作成本低、樣品通量大、樣品需求量少等優(yōu)點，已成為一種常規(guī)的分析技術(shù)。與高效液相色譜不同，高效薄層色譜的主要優(yōu)點是可以用少量流動相同時運行多個樣品，從而降低了每次分析的時間和成本。高效薄層色譜已用于藥物制劑中多種藥物的測定[7-8]，并且HPTLC檢測的雜質(zhì)量限制在0.1%以內(nèi)。

2.7 流動注射分析（Flow Injection Analysis，F(xiàn)I）

流動注射分析是一種成熟的自動化分析技術(shù)，在化學(xué)定量分析中有著廣泛的應(yīng)用。簡而言之，典型的流動注射設(shè)置包括將一定體積的樣品注入流動的溶劑流中，該溶劑流作為載體推動樣品通過檢測器。在注射點和檢測點之間，感興趣的分析物被化學(xué)或物理轉(zhuǎn)化為可檢測的目標(biāo)。流動注射分析通常是一種簡單和廉價的技術(shù)，采用常見的儀器，如蠕動泵和低壓注入閥。與批處理方法相比，流動注射分析提供了更高的采樣率，更低的試劑消耗以及更好的精度和高通用性。流動注射分析優(yōu)點使其在藥物分析和質(zhì)量控制中的應(yīng)用不斷增加。流動注射分析在藥物分析中的最新應(yīng)用包括左氧氟沙星和驅(qū)蟲藥的測定[9-10]。

2.8 紫外-可見分光光度法（UV-Visible Spectrophotometry）

藥典中的另一類方法是基于自然紫外-可見光吸收的分光光度法和基于化學(xué)反應(yīng)的可見分光光度法。比色法通常基于以下幾個方面。

（1）絡(luò)合物形成反應(yīng)。

（2）氧化還原過程；

（3）催化作用。這些方法的優(yōu)點是節(jié)省時間和勞動成本，并且精密度也很好。比色法經(jīng)常用于散狀物料的分析。例如，藍(lán)四唑法被應(yīng)用于皮質(zhì)酮甲狀腺藥物制劑的檢測。

2.9 導(dǎo)數(shù)分光光度法（Derivative Spectrophotometry，DS）

導(dǎo)數(shù)分光光度法具有靈敏度高、選擇性好、成本低等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于定量分析。導(dǎo)數(shù)光譜通常比正常的零階導(dǎo)數(shù)光譜包含更多的表觀光譜細(xì)節(jié)。導(dǎo)數(shù)分光光度法是一種非常有用的分析方法，用于分離具有重疊光譜的藥物混合物。此外，還成功地應(yīng)用于有降解產(chǎn)物存在的藥物的測定，以及有藥物添加劑和分解產(chǎn)物存在的單個藥物的測定。因此，與常規(guī)分光光度法和衍生物法測定藥物化合物相比，導(dǎo)數(shù)分光光度法可以消除單個藥物測定時的干擾。

2.10 熒光法（Fluorimetry）

發(fā)光現(xiàn)象涉及化學(xué)物質(zhì)的電磁輻射，是當(dāng)前活躍的研究領(lǐng)域之一。熒光是一種發(fā)光現(xiàn)象，最常用于分析化學(xué)的各個領(lǐng)域，包括藥物分析。熒光光譜法涉及增強(qiáng)或淬滅熒光信號的測量。關(guān)于熒光測量方法，有些方法涉及化學(xué)反應(yīng)，而其他方法則基于被分析物的原生熒光。應(yīng)用于藥物分析的熒光技術(shù)提高了分析過程的靈敏度、選擇性、準(zhǔn)確性和快速性。例如，熒光法已被應(yīng)用于直接測定恩諾沙星和氟哌啶醇[11]。

2.11 近紅外光譜（Near-Infrared Spectroscopy）

近紅外（Near-Infrared，NIR）波長區(qū)（780~2 500nm）位于可見光的紅色波段和中紅外波段之間。近紅外信號是氫鍵，如C-H，N-H和O-H分子振動（泛音和基本振動的組合）導(dǎo)致光吸收的結(jié)果。這是一種非常快速的技術(shù)，利用最現(xiàn)代的儀器采用傅里葉變換（Fourier transform，F(xiàn)T-NIR），可以在幾秒鐘內(nèi)記錄一個光譜。這種技術(shù)最大的優(yōu)點是分析的非破壞性：不需要（或只需要很少的）準(zhǔn)備程序就可以分析樣品，從而避免了產(chǎn)生誤差樣品預(yù)處理步驟。在許多情況下，這也允許樣品在測量后重復(fù)使用。近紅外光譜也可用于定量復(fù)雜基質(zhì)中特定化合物的測定，例如藥物制劑。對片劑中原料藥的近紅外定量分析已有文獻(xiàn)報道和綜述。在過去的十年中，描述完整片劑中原料藥近紅外定量測量的公開論文數(shù)量急劇增加。

2.12 核磁共振光譜法（Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy，NMR）

核磁共振波譜法可用于原料藥的鑒別、合成和降解過程中產(chǎn)生的物質(zhì)的鑒別和定量，以及測定分析過程中殘留溶劑。核磁共振信號強(qiáng)度I與引起信號的核數(shù)N成正比。因此，核磁共振信號的強(qiáng)度（定義為特定信號下的面積）可以用來進(jìn)行定量分析。在單脈沖激發(fā)的情況下，信號強(qiáng)度I與核數(shù)N之間的線性關(guān)系由以下公式表示。

其中，比例系數(shù)CS取決于光譜儀的參數(shù)和樣品性質(zhì)。

核磁共振波譜技術(shù)廣泛應(yīng)用于藥物分析中，用于藥物及其伴隨雜質(zhì)的鑒別。核磁共振可用于藥物分析，以便評估雜質(zhì)水平，闡明它們的結(jié)構(gòu)，確定和/或觀察導(dǎo)致相關(guān)雜質(zhì)的降解過程；評估殘留溶劑的含量；用手性添加劑測定異構(gòu)體組成；測定（質(zhì)子化的）堿性藥物和（去質(zhì)子化的）有機(jī)酸在各自鹽中的摩爾比。

2.13 質(zhì)譜分析（Mass Spectrometry，MS）

在過去的15a里，質(zhì)譜在生物醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究特別是藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域取得了顯著的進(jìn)展。電噴射離子化和基質(zhì)輔助激光解吸/電離（MALDI）技術(shù)的發(fā)展是質(zhì)譜能夠應(yīng)用于這些領(lǐng)域的重要原因。目前，質(zhì)譜結(jié)合各種色譜的方法是藥物分析最強(qiáng)大的技術(shù)。質(zhì)譜憑借其速度、靈敏度和高通量的優(yōu)勢，已經(jīng)發(fā)展成為藥物發(fā)現(xiàn)的支柱。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已成為藥物分析中最突出和最有價值的技術(shù)之一，并已被應(yīng)用于藥物代謝研究、藥物和代謝物的高通量分析、藥物中雜質(zhì)和降解產(chǎn)物的分析和鑒定，以及手性雜質(zhì)的分析。

2.14 電化學(xué)（Electrochemical）技術(shù)

在過去的幾年里，電化學(xué)技術(shù)在藥物分析中的應(yīng)用越來越多。人們對電化學(xué)技術(shù)重新產(chǎn)生興趣，部分原因是儀器越來越精密，并且對技術(shù)本身的理解也越來越深入。電化學(xué)技術(shù)已被應(yīng)用于吉米沙星、瑞舒伐他汀鈣等藥物的測定。

2.15 動力學(xué)方法

動力學(xué)方法是在樣品和試劑手動或自動混合后，通過信號變化檢測分析物的濃度隨時間變化的情況。有幾種方法可以用于在沒有任何動力學(xué)干擾情況下的單一組分的測定。固定時間法和初始速率法已被頻繁應(yīng)用于藥物制劑和生物體液中藥物的測定。多組分動力學(xué)測定法（常稱為差異速率法）在藥學(xué)研究領(lǐng)域也越來越流行。兩種新方法，即動力學(xué)波長對法（kinetic wavelength pair method）和H點標(biāo)準(zhǔn)加法（H-point standard addition method）被提出用于處理二元混合物中組分的重疊光譜。

3 結(jié)束語

新治療藥物的開發(fā)涉及多種基礎(chǔ)學(xué)科，這些學(xué)科一直是藥物發(fā)現(xiàn)的核心。例如利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)來提供有關(guān)目標(biāo)藥物的分子結(jié)構(gòu)信息，設(shè)計和合成候選藥物；利用藥理學(xué)來確定藥物與靶點之間相互作用的效果等。通過建立新方法、引入新學(xué)科以及不斷改進(jìn)現(xiàn)有的分析技術(shù)才能將藥物發(fā)現(xiàn)提升到一個新的水平。將集成高精度的新計算方法、生物信息學(xué)、藥物基因組學(xué)、工程和/或納米技術(shù)方法整合到藥物研發(fā)過程中，有希望將藥物發(fā)現(xiàn)帶入到下一個發(fā)展階段。