淫羊藿苷優(yōu)化大鼠脂肪干細(xì)胞促進(jìn)超長(zhǎng)隨意皮瓣存活的實(shí)驗(yàn)研究

梁至潔， 黃東琳， 朱丹丹， 易曉林， 寧 艷， 蔣洪棉， 羅麗鳳， 黎洪棉

超長(zhǎng)隨意皮瓣移植是目前臨床上修復(fù)急慢性深度創(chuàng)面，特別是重要組織器官外露創(chuàng)面的常用方法之一，其治療效果通常取決于皮瓣存活率，而其存活率主要由術(shù)后早期的血供情況決定。供血不足引起組織壞死是皮瓣移植后的一種常見(jiàn)并發(fā)癥[1]，發(fā)生率可達(dá)10%～15%[2]。皮瓣壞死通常導(dǎo)致創(chuàng)面遷延不愈，進(jìn)展為慢性創(chuàng)面或瘢痕形成，嚴(yán)重影響臨床療效。因此，如何改善血供、提高超長(zhǎng)隨意皮瓣存活率是臨床上亟待解決的問(wèn)題。隨著干細(xì)胞輔助移植臨床應(yīng)用的推廣，已有學(xué)者嘗試應(yīng)用脂肪來(lái)源干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ASCs)提高皮瓣的存活率并取得了良好的效果[3-4]。有研究認(rèn)為，在促進(jìn)皮瓣存活的過(guò)程中，ASCs的主要作用機(jī)制之一是促進(jìn)了缺血組織血運(yùn)重建[5-6]。本研究團(tuán)隊(duì)的前期研究表明ASCs有強(qiáng)大的旁分泌功能，能夠分泌與血管生成相關(guān)的細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血小板源性生長(zhǎng)因子-BB(platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-2(insulin-like growth factor-2,IGF-2)等[7-8]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，可以通過(guò)藥物[9]、物理刺激[10-11]、生長(zhǎng)因子[12]提高ASCs中血管生成因子的表達(dá)水平，進(jìn)而提高其促進(jìn)血運(yùn)重建及再生修復(fù)的能力。淫羊藿苷(icariin，ICA)是一種天然類黃酮[13]，具有促進(jìn)骨代謝、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、改善心腦血管等功能[14]。既往研究證實(shí)ICA可以優(yōu)化干細(xì)胞的再生功能[15]，其應(yīng)用于人體的安全性也已被證實(shí)[16]，可作為干細(xì)胞組織工程的候選佐劑。本研究旨在探討ICA優(yōu)化大鼠脂肪來(lái)源干細(xì)胞(rat adipose-derived stem cells，rASCs)促進(jìn)大鼠超長(zhǎng)隨意皮瓣存活的作用及機(jī)制，為ICA優(yōu)化ASCs輔助組織重建修復(fù)的臨床應(yīng)用提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇6周齡雌性健康無(wú)特定病原體(specific-pathogen-free，SPF)級(jí)SD大鼠12只，體質(zhì)量200～220 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。本研究獲廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：201912008)。

1.2主要材料 ICA(規(guī)格：≥98.0% 1 g，貨號(hào)：I8760-1g)，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。水合氯醛購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司，二甲苯、中性樹(shù)膠購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。IgG-PE抗體、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)偶聯(lián)抗體、CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司。VEGF一抗、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2)一抗、IGF-2一抗購(gòu)自美國(guó)Affinity公司。PDGF-BB一抗、CD31一抗、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠Ig二抗、免疫組化試劑盒(抗兔二抗)購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)凍干粉、苯胺藍(lán)染色液、馬松(Masson)三色染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物(enhanced chemiluminescence,ECL)化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自北京碧云天生物試劑有限公司。

1.3主要儀器 低速臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠。臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自Dynamica公司。生物組織攤片機(jī)購(gòu)自常州市中威醫(yī)療儀器有限公司。組織包埋機(jī)、生物組織脫水機(jī)購(gòu)自湖北亞光公司。賽默飛輪轉(zhuǎn)切片機(jī)購(gòu)自英國(guó)珊頓公司。光學(xué)顯微鏡、倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。垂直電泳槽/電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜槽購(gòu)自北京六一儀器制造公司。凝膠成像系統(tǒng)分析儀購(gòu)自英國(guó)Bio-rad公司。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 rASCs的分離與培養(yǎng) 取3只大鼠，予15%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉后行頸椎脫臼處死。仰臥位固定大鼠，酒精噴灑消毒后取腹股溝皮下脂肪墊，剔除血管筋膜后用PBS沖洗，剪切成碎片，放入膠原酶充分消化，將混合物倒至200目細(xì)胞濾網(wǎng)中吹打過(guò)篩，取濾過(guò)液進(jìn)行離心，取下沉細(xì)胞即rASCs。將rASCs接種于含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和1%青鏈雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱(條件設(shè)置：37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)，按1∶3比例傳代。

1.4.2 rASCs的鑒定 使用Becton Dickinson FACSm Calibur流式細(xì)胞儀分析P3 rASCs。將細(xì)胞(1 ml，1×106cells/ml)與FITC孵育30 min。所使用表面標(biāo)志物抗體包括：CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC和IgG-PE(陰性對(duì)照)，室溫黑暗條件下孵育30 min。使用Cell Quest Pro采集軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。為評(píng)估細(xì)胞分化能力，將P3 rASCs分別在成脂、成骨或成軟骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～3周，然后分別進(jìn)行油紅O染色、茜素紅S染色和甲苯胺藍(lán)染色，顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照。

1.4.3 ICA對(duì)rASCs的干預(yù)及相關(guān)因子檢測(cè) 將rASCs種植于12孔板中培養(yǎng)，密度為2×104cells/孔，加入不同濃度的ICA(0、0.1、1、10 μM)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。提取細(xì)胞總蛋白并進(jìn)行蛋白免疫印跡(Western blot，WB)實(shí)驗(yàn)，分析VEGF、PDGF-BB、FGF-2及IGF-2的蛋白表達(dá)水平。利用Image lab軟件進(jìn)行圖像分析，以GAPDH蛋白為內(nèi)參計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4.4 ICA預(yù)處理rASCs對(duì)超長(zhǎng)隨意皮瓣血管化及存活的影響觀察 選擇大鼠9只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后將其隨機(jī)分為空白對(duì)照組、rASCs組和ICA+rASCs組，每組3只。大鼠麻醉后于背部設(shè)計(jì)8 cm×2 cm皮瓣，去毛，切開(kāi)皮膚、皮下組織、筋膜，在肌膜淺面剝離，掀起皮瓣。根據(jù)分組在皮瓣蒂部注射相應(yīng)細(xì)胞懸液：rASCs組予未處理的rASCs；ICA+rASCs組予1 μM ICA預(yù)處理的rASCs；空白對(duì)照組予等體積PBS。rASCs組和ICA+rASCs組注射的細(xì)胞濃度為1×107cells/ml。3個(gè)部位注射相隔0.5 cm，每個(gè)注射點(diǎn)注射50 μl，絲線縫合皮瓣。在治療后7、14、28 d拍攝各組皮瓣存活情況，通過(guò)肉眼觀察大鼠背部皮瓣各分區(qū)大體存活情況，具體包括皮瓣顏色、質(zhì)地、組織彈性、毛發(fā)生長(zhǎng)情況以及是否發(fā)生壞死[17]。對(duì)于皮瓣壞死的判定，本研究采用如下標(biāo)準(zhǔn)[18]：皮瓣色澤發(fā)黑，質(zhì)地僵硬，組織皺縮，彈性差，且切割組織后無(wú)出血。用筆描繪皮瓣的存活和壞死區(qū)域，通過(guò)Image J軟件測(cè)量皮瓣存活面積及總面積。皮瓣存活情況以皮瓣存活面積比來(lái)評(píng)估，皮瓣存活面積比=(皮瓣存活表面積/皮瓣總表面積)×100%。治療后28 d將大鼠處死后取其皮瓣進(jìn)行后續(xù)組織學(xué)實(shí)驗(yàn)。皮瓣標(biāo)本切片進(jìn)行常規(guī)HE染色[19]，在顯微鏡下觀察皮瓣組織形態(tài)并拍照。

1.4.5 皮瓣組織的膠原含量計(jì)算及微血管密度(mean blood vessel density，MVD)計(jì)數(shù) 皮瓣組織石蠟切片脫蠟復(fù)水后使用Masson麗春紅酸性復(fù)紅染液復(fù)染，苯胺藍(lán)顯色。在顯微鏡下進(jìn)行觀察，每組皮瓣切片在100倍鏡下隨機(jī)挑選3個(gè)視野拍照。Image J軟件分析藍(lán)染面積比例，取均值，計(jì)為皮瓣組織的膠原含量。行CD31的免疫組化染色，鏡下觀察管樣形狀，以棕色為陽(yáng)性染色。每組取3張切片，100倍鏡下對(duì)每張切片隨機(jī)挑選3個(gè)視野，計(jì)數(shù)CD31陽(yáng)性血管，取均值，計(jì)為皮瓣組織的MVD。

1.4.6 皮瓣組織中血管生成因子的蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 從各組部分皮瓣組織中提取組織蛋白，通過(guò)WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)組織中VEGF、PDGF-BB、FGF-2及IGF-2的蛋白表達(dá)水平。利用Image lab軟件進(jìn)行圖像分析，以GAPDH蛋白為內(nèi)參計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1原代rASCs形態(tài) 顯微鏡下可見(jiàn)大部分rASCs

貼壁生長(zhǎng)，狀態(tài)良好，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或多邊形，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的經(jīng)典形態(tài)。培養(yǎng)6 d后，大量細(xì)胞增殖成團(tuán)生長(zhǎng)。見(jiàn)圖1。

?培養(yǎng)48 h(×100)；?培養(yǎng)48 h(×200)；?ASCs培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞形態(tài)(×400)；?培養(yǎng)6 d(×100)；?培養(yǎng)6 d(×200)；?培養(yǎng)6 d(×400)圖1 原代rASCs形態(tài)圖

2.2rASCs成脂、成骨、成軟骨分化能力鑒定及表面標(biāo)志物表達(dá)情況 成脂誘導(dǎo)14 d后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞變圓，胞內(nèi)充滿大量脂肪滴，細(xì)胞核被擠壓到邊緣。油紅O染色顯示細(xì)胞內(nèi)脂肪細(xì)胞液滴呈紅色，符合脂肪細(xì)胞特征(圖2?)。成骨誘導(dǎo)14 d后，細(xì)胞由梭形向多邊形、不規(guī)則形態(tài)轉(zhuǎn)變，呈多層生長(zhǎng)，細(xì)胞表面鈣鹽沉積，經(jīng)茜素紅染色，顯微鏡下可見(jiàn)橙色鈣沉積結(jié)節(jié)(圖2?)。在軟骨形成誘導(dǎo)21 d后，細(xì)胞呈多邊形或準(zhǔn)圓形，局部形成多個(gè)結(jié)節(jié)狀結(jié)構(gòu)。甲苯胺藍(lán)染色后，軟骨結(jié)節(jié)狀結(jié)構(gòu)被染成藍(lán)色(圖2?)。流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示rASCs中CD29、CD44呈高表達(dá)，CD45為低表達(dá)(圖2?～?)。

?成脂誘導(dǎo)，油紅O染色，脂滴染紅(×100)；?成骨誘導(dǎo)，茜素紅染色，鈣化結(jié)節(jié)呈橙紅色(×100)；?軟骨形成誘導(dǎo)，甲苯胺藍(lán)染色，結(jié)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)呈藍(lán)色(×100)；?～?rASCs表面標(biāo)志物鑒定的流式細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖2 誘導(dǎo)rASCs多分化結(jié)果圖

2.3不同濃度ICA預(yù)處理rASCs血管生成相關(guān)因子蛋白表達(dá)水平的情況 WB結(jié)果顯示，rASCs中VEGF、PDGF-BB、FGF-2、IGF-2的蛋白表達(dá)水平隨ICA濃度的增加而上升，呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系。見(jiàn)圖3。

與0 μM組比較，*P<0.05；與1 μM組比較，#P<0.05圖3 四組rASCs血管生成相關(guān)因子蛋白表達(dá)水平比較的WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖

2.4ICA預(yù)處理對(duì)rASCs促進(jìn)超長(zhǎng)隨意皮瓣存活的影響 在治療后7 d、14 d，rASCs組和ICA+rASCs組的皮瓣存活面積比均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)。在治療后28 d，ICA+rASCs組的皮瓣存活面積比顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)，但rASCs組與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1，圖4。

表1 三組大鼠超長(zhǎng)隨意皮瓣存活情況比較 [皮瓣存活面積比，

圖4 三組大鼠皮瓣存活情況大體圖

2.5三組皮瓣組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果 HE染色及馬松染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組的真皮層膠原纖維排列紊亂、稀疏，恢復(fù)效果不佳。rASCs組及ICA+rASCs組皮瓣組織中的纖維數(shù)量增加，且與空白對(duì)照組相比排列更為緊密、整齊有序。見(jiàn)圖5。

?HE染色；?馬松染色；?CD31免疫組化染色，微血管為紅色箭頭所指棕色管樣形狀圖5 三組皮瓣組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果圖

2.6三組皮瓣組織膠原含量和MVD比較 三組皮瓣組織的膠原含量和MVD比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.179，P=0.004；F=20.816，P=0.002)。rASCs組及ICA+rASCs組的膠原含量和MVD顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)，且ICA+rASCs組水平較rASCs組更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

與空白對(duì)照組相比，*P<0.05；與rASCs組相比，#P<0.05圖6 三組皮瓣組織膠原含量和MVD比較圖

2.7三組皮瓣組織血管生成相關(guān)因子表達(dá)水平比較

WB結(jié)果顯示，rASCs組和ICA+rASCs組的VEGF、PDGF-BB和FGF-2蛋白表達(dá)水平均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)，且ICA+rASCs組的VEGF、PDGF-BB蛋白表達(dá)水平較rASCs組更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ICA+rASCs組IGF-2的蛋白表達(dá)水平高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖7。

與空白對(duì)照組相比，*P<0.05；與rASCs組相比，#P<0.05圖7 三組皮瓣組織血管生成相關(guān)因子表達(dá)水平比較的WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖

3 討論

3.1皮瓣的存活取決于術(shù)后早期的血供。術(shù)后血管栓塞、血管痙攣等因素可引起局部缺血，不利于皮瓣存活。皮瓣缺血性壞死是血管破裂后血管痙攣和循環(huán)阻塞導(dǎo)致血流減少的主要后果。目前，提高皮瓣存活率的方法包括術(shù)后經(jīng)驗(yàn)性使用抗痙攣藥物和物理治療，從而緩解血管痙攣，改善血流[20]。然而，由于移植物與周圍組織的早期血管生成是降低壞死率的關(guān)鍵，重建微循環(huán)對(duì)皮瓣的長(zhǎng)期存活更為重要。因此，許多學(xué)者致力于探索血管生成的機(jī)制，并開(kāi)發(fā)候選優(yōu)化方法來(lái)改善再生組織的血管生成。

3.2血管生成是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程，涉及內(nèi)皮細(xì)胞增殖、激活、遷移、侵襲，以及基底膜形成和新生血管形成等多種生物學(xué)機(jī)制。ASCs具有多向分化潛力、獲取方便、來(lái)源豐富、免疫原性低、生物學(xué)性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，是組織工程理想的種子細(xì)胞，在臨床中廣泛應(yīng)用于血管形成、神經(jīng)損傷修復(fù)、骨和軟骨再生重建等方面。近年來(lái)，ASCs已被逐漸應(yīng)用于輔助皮瓣移植治療并取得良好效果。有研究證實(shí)，使用ASCs輔助大鼠皮瓣移植能夠顯著提高皮瓣毛細(xì)血管的密度，促進(jìn)缺血性損傷的恢復(fù)[3，21]。Pak等[22]也發(fā)現(xiàn)ASCs能夠通過(guò)促進(jìn)組織中血管生成提高皮瓣存活率。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，使用rASCs注射于大鼠超長(zhǎng)隨意皮瓣蒂部能夠顯著改善皮瓣的存活情況，而且，皮瓣中MVD、膠原含量、血管生成相關(guān)因子水平顯著提高，說(shuō)明rASCs可能通過(guò)提高皮瓣血運(yùn)重建促進(jìn)皮瓣存活并提高皮瓣的質(zhì)量，這與既往的研究結(jié)果相符。

3.3ASCs能夠分泌多種血管生成因子，包括VEGF、PDGF-BB、IGF-2、FGF-2等[23-25]，這些因子已被證實(shí)在血管重建中發(fā)揮關(guān)鍵作用。雖然ASCs也被發(fā)現(xiàn)能夠在體內(nèi)分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞[26]，但Yuan等[27]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大部分移植的ASCs進(jìn)入活體后很快就會(huì)死亡，故推斷ASCs在活體內(nèi)的促組織再生功能主要依賴于其旁分泌功能。本課題組的既往研究表明，通過(guò)藥物(如人參皂苷Rg1)[7]或自體來(lái)源生物材料[如富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)/富血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin，PRF)等][8]均能夠提高ASCs中血管生成相關(guān)旁分泌因子的表達(dá)水平，進(jìn)而提高ASCs促進(jìn)移植物血運(yùn)建立的能力，提高移植物的存活率。目前已有許多學(xué)者報(bào)道了優(yōu)化ASCs生物功能的多種方法[28-29]，其中一些優(yōu)化方法已被應(yīng)用于臨床實(shí)踐，并取得了良好的療效[30]。本研究發(fā)現(xiàn)使用一定濃度的ICA(1～10 μM)預(yù)處理rASCs能夠顯著提高細(xì)胞中血管生成因子VEGF、PDGF-BB、FGF-2、IGF-2的表達(dá)水平。VEGF及PDGF可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的活動(dòng)，誘導(dǎo)血管新生[31-32]。FGF及IGF則可與VEGF產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，促進(jìn)血管新生[33-34]，為缺血性組織修復(fù)創(chuàng)造良好的條件，說(shuō)明ICA可能是優(yōu)化ASCs促進(jìn)組織再生修復(fù)的潛在佐劑。進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在皮瓣術(shù)后第7、14及28天，ICA+rASCs組的皮瓣存活面積比分別為(71.56±6.24)%、(79.17±7.88)%及(84.59±4.89)%，而rASCs組的皮瓣存活率則分別為(71.98±8.71)%、(76.07±8.50)%及(68.73±9.75)%，提示ICA預(yù)處理能進(jìn)一步優(yōu)化rASCs促進(jìn)大鼠超長(zhǎng)隨意皮瓣存活的功能。此外，組織學(xué)結(jié)果顯示ICA+rASCs組的皮瓣組織中膠原含量和MVD顯著高于rASCs組；WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，ICA+rASCs組皮瓣組織中的VEGF和PDGF-BB表達(dá)水平較rASCs組顯著升高，表明ICA+rASCs組大鼠皮瓣血管重建過(guò)程較rASCs組更為活躍，而該組的皮瓣組織修復(fù)效果也更好。

綜上所述，ICA不僅能夠提高rASCs促進(jìn)大鼠超長(zhǎng)隨意皮瓣的存活，同時(shí)還能促進(jìn)皮瓣組織中膠原的重塑，提高皮瓣的質(zhì)量，這可能與ICA能夠上調(diào)ASCs血管生成相關(guān)旁分泌因子的表達(dá)水平，并能提高rASCs在組織中的促血管生成能力有關(guān)。