噬菌體在動(dòng)物源性食品致病菌控制中的應(yīng)用

聶長(zhǎng)麗，張明，董浩，宋鋼，張國(guó)清，郭曉華，申照華，張德福*，勵(lì)建榮

(1. 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，渤海大學(xué)海洋研究院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州，121013；2. 山東美佳集團(tuán)有限公司，山東 日照，276806；3. 凌海市達(dá)蓮海珍品養(yǎng)殖有限責(zé)任公司，遼寧 錦州，121211；4. 錦州市龍海馨港科技有限公司, 遼寧 錦州 121211;5. 錦州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務(wù)中心水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，遼寧 錦州，121000)

動(dòng)物性食品是人類攝取優(yōu)質(zhì)蛋白的重要來源，但是動(dòng)物集約化養(yǎng)殖導(dǎo)致其機(jī)體免疫力下降，易被細(xì)菌感染，從而導(dǎo)致食源性疾病的發(fā)生，嚴(yán)重危及消費(fèi)者健康與食品安全。目前，養(yǎng)殖業(yè)者主要使用藥物治療或者通過在飼料中添加抗菌藥物預(yù)防食用動(dòng)物的細(xì)菌性疾病，達(dá)到防控動(dòng)物性食品細(xì)菌污染的目的。然而，長(zhǎng)期使用抗菌藥物會(huì)產(chǎn)生副作用，如藥物殘留、耐藥性等，給養(yǎng)殖業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失，因此迫切需要尋找綠色環(huán)保安全的方法控制食用動(dòng)物的細(xì)菌性疾病，從而為人們提供安全優(yōu)質(zhì)的蛋白。

上個(gè)世紀(jì)中葉，青霉素等抗生素的發(fā)現(xiàn)及使用使噬菌體受到冷落。近年來，噬菌體作為一種新型抗菌劑重新受到人們的關(guān)注[1]。噬菌體是生態(tài)系統(tǒng)中最豐富的生物之一，其可感染宿主菌并進(jìn)行復(fù)制、增殖，最終裂解宿主菌釋放子代噬菌體，從而達(dá)到抗菌的效果，并且噬菌體對(duì)動(dòng)物、人類無害，可作為一種有潛力的生物防治劑，用于防控細(xì)菌感染[2]。目前，荷蘭、德國(guó)、美國(guó)等國(guó)家已有針對(duì)單增李斯特菌、大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌等主要食源性致病菌的噬菌體制劑實(shí)現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用，如ListShieldTM，EcoShieldTM等[3]。

本研究綜述了噬菌體在控制動(dòng)物性食品中致病菌方面的研究進(jìn)展，分析噬菌體治療的優(yōu)勢(shì)與面臨的挑戰(zhàn)，為噬菌體制劑在防控食用動(dòng)物細(xì)菌性疾病、提高食品原料安全性方面的研究與應(yīng)用提供參考。

1 噬菌體概述

1.1 噬菌體的發(fā)現(xiàn)

1896年，英國(guó)細(xì)菌學(xué)家Hankin首次發(fā)現(xiàn)在印度的恒河和亞穆那河水中含有抗菌活性的物質(zhì)，可殺滅霍亂弧菌，抑制霍亂病的流行[4]。1915年，英國(guó)微生物學(xué)家Frederick Twort在研究牛痘病毒時(shí)，發(fā)現(xiàn)存在一種物質(zhì)能通過微孔過濾器并破壞培養(yǎng)的細(xì)菌，他公布了這一發(fā)現(xiàn)，但沒有引起人們的重視[5]。1917年，加拿大微生物學(xué)家Félix d’Hérelle發(fā)現(xiàn)了痢疾桿菌噬菌體，并進(jìn)行了命名。Félix d’Hérelle對(duì)噬菌體進(jìn)行了大量的研究，并嘗試了利用噬菌體治療人體細(xì)菌的感染，從此開始了將噬菌體應(yīng)用于臨床的研究[6]。

1.2 噬菌體的分類

噬菌體是能感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱[7]。其存在于多種生態(tài)環(huán)境中，種類繁多，數(shù)量可達(dá)1031，約為細(xì)菌數(shù)量的10倍[8-9]。噬菌體分類有多種不同的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)遺傳物質(zhì)不同，可將其分為DNA噬菌體和RNA噬菌體；按照宿主來源的不同可分為植物噬菌體、細(xì)菌噬菌體、動(dòng)物噬菌體等；根據(jù)是否有尾可將其分為有尾噬菌體和無尾噬菌體,據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道96%的噬菌體屬于有尾噬菌體目[10]。其中，有尾噬菌體目可分為肌尾噬菌體科(Myoviridae)、短尾噬菌體科(Podoviridae)和長(zhǎng)尾噬菌體科(Siphoviridae)。根據(jù)形態(tài)可分為瓶狀、球狀、桿狀、絲狀、鏈狀、多面體等[11]。

根據(jù)噬菌體的生活周期不同可以分為烈性噬菌體(Lytic phage)和溫和噬菌體(Temperate phage)[12]。烈性噬菌體是指在短時(shí)間內(nèi)能連續(xù)完成裂解周期而實(shí)現(xiàn)繁殖的噬菌體，其侵染宿主細(xì)胞后短時(shí)間內(nèi)可完成吸附、侵入、增殖、裝配和裂解5個(gè)階段，最終導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡(圖1)[13-15]。溫和噬菌體吸附并且侵入宿主細(xì)胞后將基因組整合到宿主菌的染色體中，并隨宿主基因組的復(fù)制而進(jìn)行同步復(fù)制，一般不進(jìn)行增殖和引起宿主細(xì)胞裂解[16]。因此，目前具有實(shí)用價(jià)值的噬菌體主要是烈性噬菌體。

1.3 噬菌體的殺菌機(jī)制

噬菌體的殺菌作用是通過裂解酶實(shí)現(xiàn)的。裂解酶(Endolysin或Lysin)是雙鏈DNA噬菌體在自身復(fù)制晚期合成的一類細(xì)胞壁水解酶，又稱作內(nèi)溶素、溶胞壁酶[17-18]。

圖1 噬菌體的生命周期Fig.1 Life cycle of bacteriophages

大多數(shù)的噬菌體能夠吸附在細(xì)菌表面的受體上，受體大部分是蛋白質(zhì)(多糖)。噬菌體感染后期，內(nèi)溶素破壞細(xì)菌細(xì)胞壁上各種分子的共價(jià)鍵，達(dá)到裂解細(xì)胞壁的作用[19-20]。在裂解細(xì)胞壁時(shí)，多數(shù)內(nèi)溶素因缺少信號(hào)肽需要與孔蛋白(Holin)協(xié)同作用。孔蛋白是一種疏水性的跨膜蛋白，他可以在細(xì)胞膜上形成同源低聚物而損害膜或形成非特異性孔洞，促使細(xì)胞壁水解酶接近肽聚糖上的作用靶點(diǎn)；孔蛋白也可控制酶的釋放量，從而控制內(nèi)溶素在體內(nèi)裂解時(shí)間，達(dá)到水解宿主細(xì)胞壁的目的，同時(shí)起到殺菌作用[20-21]。少數(shù)有信號(hào)肽序列的內(nèi)溶素參與宿主細(xì)胞的分泌機(jī)制，不與孔蛋白協(xié)同作用。噬菌體的殺菌機(jī)制見圖2[20]。

圖2 細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)、內(nèi)溶素的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)及噬菌體的殺菌機(jī)制Fig.2 Structure of bacterial cell wall, structure site of endolysin and bactericidal mechanism of bacteriophage(A)細(xì)菌細(xì)胞壁及內(nèi)溶素作用示意圖?？椎鞍?)；內(nèi)溶素()；(B)肽聚糖結(jié)構(gòu)及內(nèi)溶素的攻擊位點(diǎn)。數(shù)字是內(nèi)溶素的攻擊位點(diǎn)：1：酰胺酶(Amidase)；2、3：肽鏈內(nèi)切酶(Endopeptidase)；4：N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramidase)；5：N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和轉(zhuǎn)糖基酶(N-acetylglucosaminidases, Transglycosylase)

2 噬菌體在動(dòng)物性食品原料安全控制中的應(yīng)用

2.1 噬菌體控制水生動(dòng)物的細(xì)菌

水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)是世界上發(fā)展最快的行業(yè)之一，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中發(fā)揮著非常重要的作用[22]。隨著大規(guī)模高密度集約化養(yǎng)殖模式的發(fā)展，許多與水產(chǎn)動(dòng)物疾病相關(guān)的問題逐漸暴露出來，制約了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展。目前，控制細(xì)菌性疾病主要依賴抗菌藥物，但原農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)生產(chǎn)和使用的水產(chǎn)養(yǎng)殖用抗菌藥物種類較少，而且抗菌藥物的不合理使用不僅會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性增強(qiáng)，還會(huì)帶來環(huán)境污染與藥物殘留等問題，因此尋找綠色環(huán)保的方法控制水產(chǎn)養(yǎng)殖中的細(xì)菌性病害成為當(dāng)務(wù)之急，噬菌體治療因此成為人們采用的方法之一[23-24]。同時(shí)相關(guān)研究表明，噬菌體對(duì)水生動(dòng)物中的弧菌、假單胞菌、愛德華氏菌、鏈球菌、柱狀黃桿菌等多種致病菌有較好的防治效果。表1總結(jié)了噬菌體療法在水產(chǎn)品的部分代表性致病菌防治中的應(yīng)用。

表1 噬菌體在水產(chǎn)品養(yǎng)殖領(lǐng)域的應(yīng)用Tab.1 The application of bacteriophage in aquaculture

2.1.1 噬菌體控制溶藻弧菌

溶藻弧菌是海洋環(huán)境中常見的一種嗜鹽性的致病性弧菌，可引起蝦、魚、牡蠣(Ostreidae)、海參等感染發(fā)病，導(dǎo)致發(fā)病動(dòng)物死亡。Zhang等[31]利用浸浴的方式研究混合噬菌體對(duì)刺參(Apostichopusjaponicus)的治療效果，結(jié)果顯示，感染復(fù)數(shù)分別為10.0、1.0和0.1的混合噬菌體浸浴過的刺參存活率分別為73%、50%和47%(n=30)，高于沒有噬菌體的對(duì)照組(3%，n=30)，與強(qiáng)霉素和卡那霉素處理組的存活率(80%和47%)沒有顯著差異。畢曉澤[46]用浸浴的方式評(píng)價(jià)溶藻弧菌噬菌體制劑(4.32×107CFU/mL 噬菌體、0.125 mg/mL大蒜素、2.5 mmol/mL NaCl、5.0 mmol/mL MgCl2)對(duì)大菱鲆(Scophthalmusmaximus)弧菌病的治療效果。結(jié)果表明，噬菌體制劑處理的大菱鲆的存活率(70.00%，n=10)高于單一噬菌體處理組(53.33%，n=10)和大蒜素處理組(40.00%，n=10)。說明噬菌體制劑比單一噬菌體或大蒜素對(duì)感染溶藻弧菌的大菱鲆治療效果更顯著。

2.1.2 噬菌體控制副溶血性弧菌

副溶血性弧菌是一種對(duì)人和海洋動(dòng)物均有致病性的革蘭氏陰性菌，能夠?qū)е卖~、蝦、牡蠣等水生動(dòng)物患病，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，如由副溶血性弧菌引起的對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病(AHPND)一直是東南亞和拉丁美洲對(duì)蝦(PenaeusOrientalis)養(yǎng)殖中最棘手的疾病之一[25]。食用了該菌污染的食品還可能引起腹瀉、嘔吐等癥狀，給食品安全和消費(fèi)者身體健康帶來隱患。Zhang等[47]研究了噬菌體OMN對(duì)牡蠣(Crassostreahongkongensis)中副溶血性弧菌的防控效果表明，應(yīng)用噬菌體OMN處理48 h、72 h后，牡蠣表面的副溶血性弧菌分別減少90%和99%。胡蝶等[48]將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0 g/kg 的噬菌體微膠囊混于方斑東風(fēng)螺(Babyloniaareolata)的餌料中，經(jīng)飼喂后，東風(fēng)螺腸道宿主菌平均減少96%，水體中宿主菌平均減少72%；將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5 g/kg的噬菌體微膠囊加入凡納濱對(duì)蝦(Penaeusvannamei)餌料中，經(jīng)飼喂后，對(duì)蝦腸道宿主菌平均減少86%，水體中宿主菌平均減少68%。Mateus等[22]評(píng)估了3株噬菌體混合物(VP-1、VP-2和VP-3)及單一噬菌體防控副溶血性弧菌的效果。結(jié)果表明，單一噬菌體VP-1、VP-2和VP-3及噬菌體“雞尾酒模式”都可以降低副溶血性弧菌的數(shù)量，且與單獨(dú)使用VP-3和噬菌體“雞尾酒”的效果相似，說明單一噬菌體及其“雞尾酒模式”對(duì)副溶血性弧菌均具有較好的防控效果。

2.1.3 噬菌體控制哈維氏弧菌

哈維氏弧菌也是一種水生動(dòng)物致病菌，其可以引起對(duì)蝦的發(fā)光弧菌病等。Vinod等[49]采用浸浴的方式研究哈維氏弧菌噬菌體治療斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)中的發(fā)光弧菌病。結(jié)果顯示，噬菌體治療組中斑節(jié)對(duì)蝦的存活率(70%、80%)高于對(duì)照組(25%)；田間試驗(yàn)表明，對(duì)于自然爆發(fā)的發(fā)光弧菌病，噬菌體處理可提高幼蝦的存活率，減少孵化池中哈維氏弧菌的數(shù)量。Wang等[35]研究噬菌體治療澳大利亞綠邊鮑(Haliotislaevigata)感染哈維氏弧菌的效果，結(jié)果表明噬菌體處理組鮑的存活率高于對(duì)照組。Karunasagar等[50]用噬菌體(Viha10、Viha8)和抗菌藥物治療幼蝦，噬菌體治療組的存活率(86%、88%)高于抗菌藥物治療組(65%、68%)。

2.1.4 噬菌體控制腐敗希瓦氏菌

噬菌體也可用來防控水生動(dòng)物中的腐敗菌。腐敗希瓦氏菌是水產(chǎn)品中的特定腐敗菌，抑制腐敗菌的生長(zhǎng)可以防止水產(chǎn)品腐敗。呂孫建等[51]采用滴注法觀察寬譜噬菌體NTHP01噬菌效果，結(jié)果顯示，NTHP01能夠有效抑制水產(chǎn)養(yǎng)殖中的大多數(shù)致病菌，如副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、變形假單胞菌、溶藻弧菌、遲緩愛德華氏菌等，尤其對(duì)溫和氣單胞菌、腐敗希瓦氏菌的裂解能力最強(qiáng)。宋亞雄[45]研究了噬菌體PSM-1防治仿刺參中希瓦氏菌的能力。結(jié)果顯示，噬菌體PSM-1腹腔注射組可將仿刺參的存活率從0%提升至80%以上，浸浴組可將仿刺參的存活率從0%提升到60%以上。兩組實(shí)驗(yàn)在最佳給藥時(shí)間和最高給藥濃度時(shí)，對(duì)仿刺參保護(hù)率均高于90%。

2.2 噬菌體治療陸生動(dòng)物的致病菌

噬菌體治療也可作為控制陸生動(dòng)物細(xì)菌感染的一種方式。早在1919年，噬菌體即被用來控制沙門氏菌的感染。利用噬菌體控制陸生動(dòng)物細(xì)菌性疾病的研究主要集中在噬菌體的治療方式上，通過優(yōu)化抗菌策略，防止或減少陸生動(dòng)物疾病或病原體的傳播。大腸桿菌、沙門氏菌、彎曲桿菌、金黃色葡萄球菌是陸生動(dòng)物4種主要的致病菌[52]。表2總結(jié)了噬菌體在預(yù)防上述4種細(xì)菌引起的陸生動(dòng)物疾病方面的相關(guān)研究。

表2 噬菌體在陸生動(dòng)物致病菌防治中的應(yīng)用Tab.2 The application of bacteriophage in pathogens control of land animals

2.2.1 噬菌體控制大腸桿菌

大腸桿菌是養(yǎng)殖業(yè)常見的條件致病菌之一，可以導(dǎo)致家禽死亡，給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[64]。李敏等[65]以1日齡羅曼雞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象探索噬菌體BP16的防治效果。結(jié)果顯示，雛雞感染大腸桿菌前6 h使用噬菌體能有效預(yù)防大腸桿菌病，在感染時(shí)至感染后6 h內(nèi)使用噬菌體，能有效治療大腸桿菌病，且噬菌體治療效果優(yōu)于氟苯尼考。Guo等[66]也證實(shí)了噬菌體能有效治療大腸桿菌病，連續(xù)3天向感染后的奶牛乳房?jī)?nèi)分別注入噬菌體混合物或抗生素，結(jié)果表明，噬菌體混合物可顯著減少細(xì)菌和體細(xì)胞中炎癥因子的數(shù)量，緩解奶牛乳房炎的癥狀，達(dá)到與抗生素相同的治療效果。在實(shí)驗(yàn)的第6天，抗生素組和噬菌體組幾乎檢測(cè)不到細(xì)菌。反芻動(dòng)物腸道中的大腸桿菌O157∶H7在屠宰期間可能會(huì)污染肉類。雖然噬菌體可以通過直接給藥、口服治療的方式對(duì)反芻動(dòng)物進(jìn)行治療，但研究發(fā)現(xiàn)口服治療可能會(huì)降低噬菌體的數(shù)量[1]。主要原因可能有：噬菌體可能與胃腸道或瘤胃中的物質(zhì)發(fā)生非特異性結(jié)合，接觸胃酸時(shí)失去活性，口服的噬菌體到達(dá)胃腸道中數(shù)量減少。Stanford等[67]研究將噬菌體包裹在甲基丙烯酸酯聚合物中制成膠囊丸劑，可在低pH時(shí)保護(hù)噬菌體，并且口服這種膠囊丸劑后排出的糞便中含有的大腸桿菌數(shù)量顯著減少。

2.2.2 噬菌體控制沙門氏菌

沙門氏菌是普遍公認(rèn)的食源性致病菌，人感染沙門氏菌主要是食用了該菌污染的動(dòng)物性食品(雞蛋、禽肉等)所致。據(jù)疾病預(yù)防控制中心(Centers for Disease Control and Prevention, CDC)統(tǒng)計(jì)，2002—2017年，韓國(guó)報(bào)道的4 265例食源性疾病事件中約9.3%是由沙門氏菌引起的[52]。王曦等[68]用糞便移植和噬菌體混合物聯(lián)合的方法對(duì)被沙門氏菌感染的SPF雛雞進(jìn)行治療，雛雞的死亡率降低、腸道炎癥損傷癥狀得到緩解。Kumar等[69]研究噬菌體NINP13076對(duì)小鼠體內(nèi)沙門氏菌的作用效果及對(duì)腸道菌群的影響。結(jié)果表明，小鼠連續(xù)5 d口服沙門氏菌噬菌體NINP13076后，肺、腎、心、肝、腸等重要臟器未見明顯病理變化，并且典型的益生菌菌群的生長(zhǎng)即使在與沙門氏菌噬菌體孵育至24 h后仍然不受影響。Hong等[70]利用噬菌體PA13076在小鼠模型中進(jìn)行測(cè)試，與對(duì)照組相比，經(jīng)過噬菌體治療的小鼠體內(nèi)多個(gè)組織和器官中的沙門氏菌濃度顯著降低，小鼠的存活率與噬菌體濃度呈正相關(guān)。

2.2.3 噬菌體控制彎曲桿菌

彎曲桿菌是革蘭氏陰性菌，其存在于家禽和牛的腸道中，是最常見的人畜共患病原菌。人感染彎曲桿菌主要是攝入受污染的食物如牛奶、生肉和飲用水等。彎曲桿菌每年給農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)等造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，但噬菌體療法可防控家禽感染彎曲桿菌。D′Angelantonio等[71]研究了噬菌體(Φ16-izsam和Φ7-izsam)對(duì)肉雞腸道中彎曲桿菌的抑制作用，在屠宰前24 h，將最佳感染復(fù)數(shù)(Optimal Multiplicity of Infection, MOI)為0.1和1.0的噬菌體(Φ16-izsam和Φ7-izsam)使用兩步噬菌體給藥的方式對(duì)空腸中的彎曲桿菌進(jìn)行控制，感染的肉雞中細(xì)菌減少了1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，這說明噬菌體可以控制肉雞中感染的彎曲桿菌。Carla等[56]通過口服和飼喂兩種方式評(píng)估了噬菌體對(duì)彎曲桿菌的控制效果，結(jié)果顯示，口服灌胃和將混合噬菌體添加至雛雞的食物中進(jìn)行飼喂這兩種方式都能夠降低雛雞的彎曲桿菌數(shù)量。然而，當(dāng)飼喂噬菌體“雞尾酒”時(shí)，彎曲桿菌的數(shù)量比口服灌胃的方式顯著降低。說明噬菌體可能受到胃酸的影響，導(dǎo)致噬菌體的活性下降。

2.2.4 噬菌體控制金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的致病菌，制約著乳業(yè)的發(fā)展。嚴(yán)亞賢等[72]模擬環(huán)境觀察抑制金黃色葡萄球菌的能力。結(jié)果顯示，事先經(jīng)過噬菌體噴霧處理后的平板上，金黃色葡萄球菌的數(shù)量減少，甚至沒有生長(zhǎng)。說明噬菌體可以作為環(huán)境消毒劑抑制環(huán)境中的金黃色葡萄球菌。Shetru等[73]研究了噬菌體ΦDMSA-2對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用。結(jié)果表明，用噬菌體ΦDMSA-2處理的小鼠表現(xiàn)出更快的上皮再形成和更快的組織重塑。在所有噬菌體處理組中，感染組織中的細(xì)菌數(shù)量都減少了，并使小鼠100%存活。涂尊方等[74]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，噬菌體PhMASA-WJ對(duì)小鼠無毒副作用，敗血癥小鼠經(jīng)噬菌體PhMASA-WJ治療后存活率為60%，對(duì)照組全部死亡，噬菌體PhMASA-WJ治療顯著提高了小鼠的存活率。

2.3 噬菌體在食品中的應(yīng)用

由食源性致病菌引起的食品安全問題越來越受消費(fèi)者關(guān)注。熱殺菌這種傳統(tǒng)的殺菌方式并不適合于所有食品，并且對(duì)食品的感官和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有影響；防腐劑的使用雖然能有效延長(zhǎng)食品保質(zhì)期，但濫用的問題層出不窮。為了滿足消費(fèi)者對(duì)含更少化學(xué)防腐劑、更高質(zhì)量食品的需求，噬菌體這種高效、無殘留、發(fā)展前景良好的生物滅菌劑成為了研究熱點(diǎn)。噬菌體能降低致病菌污染風(fēng)險(xiǎn)、延長(zhǎng)食品保質(zhì)期，在保障食品的質(zhì)量與安全方面具有較好潛力。

表3 噬菌體在食品中的應(yīng)用Tab.3 The application of bacteriophage in food

2.3.1 噬菌體對(duì)食品原料中病原菌的控制

肉類食品在生產(chǎn)過程中極易受到多種致病菌的污染。Sun等[88]研究了冷藏羊肉中噬菌體PSDA-2對(duì)沙門氏菌的控制效果。結(jié)果表明，與無噬菌體的對(duì)照相比，在感染復(fù)數(shù)分別為100和10 000時(shí)，噬菌體PSDA-2可將4 ℃下的羊肉中的沙門氏菌分別減少1.7 lg CFU/mL和2.1 lg CFU/mL。Dewanggana等[89]探索了噬菌體在控制各種食品中產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)中的應(yīng)用，不同孵化時(shí)間(1 d和6 d)的噬菌體DW-EC顯著降低了雞肉(80.93%、87.29%)、魚肉(63.78%、87.89%)兩種不同食品樣品中的ETEC種群數(shù)量。鄭小雙等[90]用副溶血性弧菌模擬污染黃魚(Pseudosciaenacrocea)片來研究噬菌體VppMIX的抑菌效果，結(jié)果顯示在25 ℃恒溫保藏12 h后，不同劑量噬菌體VppMIX處理的黃魚樣品中副溶血性弧菌數(shù)量比對(duì)照組降低了1.41～4.98 lg CFU/g。楊振泉[91]用噬菌體SPMIX3-156來控制鯰魚(Ictaluruspunctatus)中的腐敗希瓦氏菌的生長(zhǎng)，結(jié)果顯示噬菌體SPMIX3-156可防控冷凍魚片中的腐敗希瓦氏菌的數(shù)量。同時(shí)，他篩選的噬菌體SppYZU05可作為食品添加成分或生物保鮮劑抑制食品生產(chǎn)過程和貯藏中的腐敗希瓦氏菌[92]。

2.3.2 噬菌體對(duì)乳及乳制品中病原菌的控制

經(jīng)巴氏殺菌的乳及乳制品中仍然存在病原菌。Bao等[93]用沙門氏菌噬菌體PA13076和PC2184的混合物探索其對(duì)沙門氏菌的控制效果。結(jié)果顯示，4 ℃處理5 h后，巴氏殺菌奶中沙門氏菌數(shù)減少了1.5～4.0 lg CFU/mL。李虹嬌等[94]用噬菌體TBC-1對(duì)牛乳和乳粉中的阪崎腸桿菌ATCCBAA894和ATCC25944進(jìn)行控制。結(jié)果顯示，室溫25 ℃培育3 h，在MOI為106時(shí)，能將牛乳中102CFU/mL的阪崎腸桿菌抑制到檢出限以下；在25 ℃與37 ℃溫度下分別培育3 h，乳粉中的阪崎腸桿菌ATCCBAA894菌量都減少到檢出限以下，在25 ℃培育3～12 h，乳粉中阪崎腸桿菌ATCC25944菌量均在檢出限以下?？梢姡删wTBC-1對(duì)牛乳與乳粉中兩種阪崎腸桿菌均有良好的抑制作用。蔡天舒等[95]研究噬菌體qdsa001在牛奶中的抑菌作用。結(jié)果顯示，4 ℃和37 ℃牛奶中的金黃色葡萄球菌的數(shù)量均降低。說明噬菌體可應(yīng)用于抑制乳品中金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，對(duì)乳制品生產(chǎn)過程中控制金黃色葡萄球菌具有重大意義。

2.3.3 噬菌體對(duì)即食食品中病原菌的控制

即食(Ready to Eat, RTE)食品是指無需第二次加熱可立即食用的食品。RTE食品在加工、包裝、配送過程中極易受病原菌污染，儲(chǔ)存條件不當(dāng)導(dǎo)致細(xì)菌增殖，會(huì)引發(fā)食源性疾病。Guenther等[96]使用寬宿主譜沙門氏菌噬菌體FO1-E2防控多種RTE食品中鼠傷寒沙門氏菌的污染，如熱狗、炸雞、海鮮、巧克力牛奶及蛋黃等，8 ℃時(shí)，噬菌體處理6 h，可將沙門氏菌數(shù)量降低到檢測(cè)限以下，其中15 ℃時(shí)巧克力牛奶和炸雞中沙門氏菌數(shù)量降低得最多，其次是熱狗和海鮮。You等[97]研究了噬菌體VPT02對(duì)即食生魚片中副溶血性弧菌的抑制效果，當(dāng)噬菌體VPT02感染復(fù)數(shù)為10時(shí)，與對(duì)照相比，噬菌體VPT02使副溶血性弧菌減少3.9個(gè)數(shù)量級(jí)，表明噬菌體VPT02有抑菌的潛力。袁琳等[98]研究了噬菌體SHOU24對(duì)即食對(duì)蝦中副溶血性弧菌的抑制效果。結(jié)果表明，經(jīng)噬菌體處理的副溶血性弧菌的生長(zhǎng)延滯期增長(zhǎng)了4.04 h，噬菌體在常溫條件下能使即食蝦中副溶血性弧菌的濃度下降1個(gè)數(shù)量級(jí)。噬菌體SHOU24可顯著降低即食對(duì)蝦中的副溶血性弧菌數(shù)量。

3 噬菌體治療的優(yōu)勢(shì)及面臨的挑戰(zhàn)

抗菌藥物是一種可以針對(duì)細(xì)胞壁合成或蛋白質(zhì)合成等生理過程進(jìn)行選擇性破壞的化學(xué)物質(zhì)，而裂解性噬菌體則是對(duì)病原菌進(jìn)行特異性結(jié)合而將其殺滅。噬菌體治療就是利用裂解性噬菌體的特性治療細(xì)菌性疾病。噬菌體與抗菌藥物相比有許多優(yōu)勢(shì)：一是噬菌體分離相對(duì)快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)，但若考慮噬菌體的裂解性能、廣譜范圍和非轉(zhuǎn)導(dǎo)性就比較耗時(shí)。二是噬菌體產(chǎn)生抗性的速度慢。三是特異性高。噬菌體以宿主菌的細(xì)胞壁受體為靶標(biāo)，不影響其他的微生物群，而抗菌藥物可能會(huì)損害或干擾正常微生物群。四是固有毒性低。噬菌體是由核酸和蛋白質(zhì)組成，毒性低。五是宿主菌密度極低時(shí)，噬菌體仍能夠繼續(xù)復(fù)制增殖。六是噬菌體能夠適應(yīng)不斷變化的環(huán)境條件。七是可以破壞細(xì)菌的生物膜。八是噬菌體一般能夠承受食品加工環(huán)境的條件。

噬菌體治療可以防治細(xì)菌引起的感染，但在實(shí)際的應(yīng)用過程中也面臨著許多問題，例如噬菌體治療細(xì)胞內(nèi)病原體作用有限；噬菌體中含有一些大分子蛋白，給病人用高濃度的噬菌體或反復(fù)使用同一種噬菌體時(shí)，可能會(huì)引起極端反應(yīng)，如過敏反應(yīng)等[99]；烈性噬菌體和溫和噬菌體都可能會(huì)攜帶毒力基因或耐藥性編碼基因，可能會(huì)通過一般或特殊的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制增加宿主菌毒性或產(chǎn)生新型致病菌株，如CTXΦ噬菌體通過轉(zhuǎn)移產(chǎn)生毒素的毒力因子，增強(qiáng)了霍亂弧菌的毒力等[100]；宿主菌在噬菌體存在的生存壓力下會(huì)發(fā)生突變，有可能產(chǎn)生抗噬菌體菌株。噬菌體治療在養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用需更深入的研究，以提高噬菌體治療的效率。噬菌體的特異性通常被認(rèn)為是噬菌體的優(yōu)勢(shì)特征，但在治療時(shí)可能會(huì)成為弊端；再者噬菌體治療可能會(huì)受到治療方式、動(dòng)物健康狀況等條件的影響；在動(dòng)物模型中飼喂噬菌體不足或過量，動(dòng)物可能不會(huì)產(chǎn)生任何反應(yīng)等。因此，噬菌體在食用動(dòng)物致病菌控制中的廣泛應(yīng)用仍然需要深入的研究。

4 結(jié)語與展望

本研究總結(jié)了噬菌體在動(dòng)物源性食品中致病菌控制方面的研究進(jìn)展，同時(shí)分析了噬菌體治療的優(yōu)勢(shì)與存在的問題?？梢钥闯?，噬菌體完全取代抗菌藥物治療食用動(dòng)物中致病菌引起的感染還需要更多的研究以解決目前存在的問題，比如還未形成噬菌體作為生物防治劑的標(biāo)準(zhǔn)化方法、缺乏相應(yīng)的法律法規(guī)、噬菌體應(yīng)用的可操作性和實(shí)用性仍有待提高以及噬菌體在臨床的應(yīng)用需要獲得監(jiān)管部門的批準(zhǔn)等。另外，由于噬菌體的病毒屬性，并沒有被廣大民眾完全接受?！霸谑称飞蠂姙⒉《尽钡南敕赡軙?huì)引起消費(fèi)者的抵制，因此，目前中國(guó)還未批準(zhǔn)任何噬菌體成為食品添加劑。需要加大對(duì)公眾和食品加工者關(guān)于噬菌體的安全性、有效性和廣泛性等方面的宣傳。細(xì)菌對(duì)噬菌體產(chǎn)生抗性的問題可以通過研發(fā)多種噬菌體混合而成的“雞尾酒”模式減緩產(chǎn)生抗性的速度，噬菌體宿主譜窄的問題可通過基因編輯噬菌體，拓寬噬菌體的宿主譜，賦予噬菌體多種特性。在噬菌體安全方面，可研發(fā)噬菌體的蛋白產(chǎn)品如酶制劑進(jìn)行解決。

任何抗菌策略都存在利與弊，噬菌體具有特異性高、自我增殖快、分離周期短、綠色環(huán)保等抗菌藥物無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，可作為一種有潛力的生物防治劑。隨著分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)、合成生物技術(shù)的發(fā)展與成熟及對(duì)噬菌體研究的深入，噬菌體治療的效率將會(huì)提高；研究噬菌體與宿主菌相互進(jìn)化的機(jī)制，觀察細(xì)菌是如何進(jìn)化對(duì)噬菌體產(chǎn)生抗性的，從而進(jìn)一步保證噬菌體的安全性，相信今后隨著噬菌體控制致病菌技術(shù)的不斷完善，噬菌體的商業(yè)化應(yīng)用終將實(shí)現(xiàn)，最終可以替代抗菌藥物來控制食用動(dòng)物中的致病菌，成為保障人類健康和食品安全的手段之一。