人源鋅指蛋白ZNF24及其鋅指結(jié)構(gòu)域的表達(dá)、純化及DNA結(jié)合性質(zhì)的研究

蘇曉琴,高寶才,紀(jì) 銳,王 森,李繼喜

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,上海 200438)

轉(zhuǎn)錄因子是控制基因表達(dá)的關(guān)鍵蛋白,能夠以序列特異性方式結(jié)合DNA,直接參與激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程[1]。在真核細(xì)胞中,經(jīng)典的C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域是最常見(jiàn)的DNA結(jié)合基序,經(jīng)常作為轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)鍵部位與DNA結(jié)合,調(diào)控基因的表達(dá)[2],人類基因組包含650多個(gè)C2H2鋅指蛋白[3]。C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域最初是在非洲爪蟾轉(zhuǎn)錄因子ⅢA蛋白(TFⅢA)中發(fā)現(xiàn)的,該蛋白含有9個(gè)重復(fù)的串聯(lián)C2H2基序,通過(guò)中心鋅離子的配位來(lái)穩(wěn)定其折疊,每個(gè)單元由大約30個(gè)氨基酸殘基組成[4]。C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域同源保守序列是(F/Y)-X-C-X2-5-C-X3-(F/Y)-X5-L-X2-H-X3-5-H[5],其中X表示任意氨基酸,兩個(gè)保守的半胱氨酸和組氨酸與鋅離子配位形成ββα折疊結(jié)構(gòu)。C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域經(jīng)常以串聯(lián)的形式出現(xiàn),介導(dǎo)與DNA相互作用,結(jié)合基因的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或抑制區(qū)域,每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)結(jié)合3個(gè)或者更多的堿基,DNA序列偏好結(jié)合鋅指α螺旋的-1、+2、+3和+6的氨基酸[6]。除了串聯(lián)鋅指基序外,C2H2型鋅指蛋白通常在其N末端還含有其他功能結(jié)構(gòu)域,包括BTB(BRoad-Complex,TramTrack和Bric-a-brac)/POZ(痘病毒和鋅指)[7],Krüppel-associated box(KRAB)[8]以及SCAN結(jié)構(gòu)域[9]。這些功能結(jié)構(gòu)域可能通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子之間或其他細(xì)胞成分選擇性結(jié)合來(lái)調(diào)控亞細(xì)胞定位、DNA結(jié)合和基因表達(dá)[10]。

鋅指蛋白ZNF24(Zinc finger protein 24),也稱為ZNF191或KOX17,屬于鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族成員。ZNF24蛋白的N端含有一個(gè)SCAN結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域在鋅指蛋白中主要參與蛋白質(zhì)之間的相互作用,選擇性地介導(dǎo)蛋白的寡聚，但它在ZNF24中的作用仍然未知。C末端含有4個(gè)連續(xù)的Krüppel樣C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域,作為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域[13]。ZNF24鋅指結(jié)構(gòu)域與位于酪氨酸羥化酶基因(TH基因,編碼合成兒茶酚胺的限速酶)第一內(nèi)含子的HUMTH01微衛(wèi)星的TCAT重復(fù)序列相結(jié)合,HUMTH01的等位基因變異對(duì)TH基因表達(dá)有一定的沉默效應(yīng),并影響與ZNF24的結(jié)合[14]。此外,ZNF24能直接與CTNNB1啟動(dòng)子結(jié)合,激活β-catenin的表達(dá),促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖[15]。ZNF24還可直接與VEGF近端啟動(dòng)子的11 bp片段結(jié)合抑制VEGF轉(zhuǎn)錄,并通過(guò)抑制血管生成作為腫瘤生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控因子[16]。ZNF24在胚胎發(fā)育過(guò)程中和成人組織中均有廣泛地表達(dá)[17],ZNF24基因敲除會(huì)導(dǎo)致小鼠胚胎過(guò)早死亡[18],表明ZNF24在胚胎發(fā)育和細(xì)胞增殖過(guò)程起重要作用。此外,在神經(jīng)前體細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)ZNF24表達(dá)上調(diào)會(huì)使這些細(xì)胞保持在活躍的增殖狀態(tài),并抑制神經(jīng)元的分化,表明ZNF24作為促進(jìn)細(xì)胞周期的重要因子,維持神經(jīng)細(xì)胞在祖細(xì)胞階段[19]。ZNF24是一種多效性因子,能調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá),在造血、大腦發(fā)育和腫瘤生長(zhǎng)中發(fā)揮作用[20]。但是目前轉(zhuǎn)錄因子ZNF24識(shí)別和結(jié)合DNA的機(jī)制還不清楚,因此我們對(duì)ZNF24的DNA結(jié)合性質(zhì)進(jìn)行研究,尋找與ZNF24結(jié)合的DNA序列,對(duì)理解ZNF24調(diào)控下游靶基因的類型和調(diào)控機(jī)制具有重要的意義。

本文中,我們構(gòu)建了人源鋅指蛋白ZNF24和其鋅指結(jié)構(gòu)域ZNF24(243～368)原核表達(dá)載體,在大腸桿菌中成功表達(dá)并獲得了高純度可溶性的目的蛋白。凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA)進(jìn)一步驗(yàn)證ZNF24全長(zhǎng)蛋白和其鋅指結(jié)構(gòu)域與雙鏈DNA底物結(jié)合情況,為后續(xù)鋅指蛋白ZNF24的結(jié)構(gòu)和功能研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和主要試劑

1.1.1 材料

原核表達(dá)載體pSMT3為實(shí)驗(yàn)室?guī)齑尜|(zhì)粒,感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)購(gòu)于上海唯地生物公司,Ni-NTA Superflow購(gòu)于Qiagen,SP陽(yáng)離子交換層析柱和凝膠過(guò)濾層析柱購(gòu)于GE Healthcare,DNA底物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶(BamH Ⅰ和XhoⅠ)購(gòu)于NEB公司,同源重組酶購(gòu)于Novoprotein公司,PrimeStar GXL DNA聚合酶購(gòu)于TaKaRa公司,質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)于Axygen,HEPES、氯化鋅、IPTG、DTT粉末均購(gòu)于上海生工,β-巰基乙醇購(gòu)于Sigma,蛋白Marker購(gòu)于Thermo Fisher,蛋白高速離心濃縮管(10 kDa/30 kDa)購(gòu)于Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 鋅指蛋白ZNF24全長(zhǎng)和ZNF24(243～368)原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以含有ZNF24基因(NP_008896.2)的質(zhì)粒作為模板,引物5’端引入載體同源序列,通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因,選擇BamH Ⅰ和XhoⅠ酶切大腸桿菌表達(dá)載體pSMT3,采用同源重組的方法將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與線性化載體連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中。通過(guò)菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆,選取2～3個(gè)陽(yáng)性克隆送至擎科生物公司測(cè)序。

1.2.2 鋅指蛋白ZNF24全長(zhǎng)和ZNF24(243～368)蛋白的表達(dá)與純化

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)細(xì)胞中,挑取生長(zhǎng)較好的菌落接種至含有50 μg/mL卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃條件下220 r/min振蕩過(guò)夜培養(yǎng)。再將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液按每15 mL轉(zhuǎn)接至1 L含有20 μmol/L ZnCl2和50 μg/mL卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基,37 ℃條件下220 r/min培養(yǎng)。待菌液濃度OD600達(dá)到0.6～0.8時(shí),降溫至16 ℃,加入IPTG至終濃度為0.3 mmol/L培養(yǎng)20 h。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后,4 ℃條件下6 000 r/min離心15 min收集菌體,用緩沖液A(50 mmol/L Tris pH 8.0,500 mmol/L NaCl,10 mmol/L咪唑,5%甘油,2 mmol/L β-巰基乙醇)充分重懸后經(jīng)高壓破菌儀破碎,于4 ℃ 18 000 r/min離心1 h去除細(xì)胞碎片,留取上清。

收集到的上清流過(guò)緩沖液A平衡的Ni介質(zhì)后,用50 mmol/L咪唑緩沖液(50 mmol/L Tris pH 8.0,500 mmol/L NaCl,50 mmol/L咪唑,5%甘油,2 mmol/L β-巰基乙醇)洗掉結(jié)合介質(zhì)的雜蛋白,再用緩沖液B(50 mmol/L Tris pH 8.0,500 mmol/L NaCl,250/500 mmol/L咪唑,5%甘油,2 mmol/L β-巰基乙醇)洗脫目的蛋白。經(jīng)ULP1酶切透析后再通過(guò)Ni-NTA親和層析去除6×His-Sumo標(biāo)簽。

ZNF24(243～368)可通過(guò)陽(yáng)離子交換柱進(jìn)行純化除去標(biāo)簽雜蛋白。首先將蛋白溶液鹽濃度稀釋到100 mmol/L,然后上樣到緩沖液(50 mmol/L Tris pH 8.0,100 mmol/L NaCl,5%甘油)平衡好的SP陽(yáng)離子交換柱上,標(biāo)簽蛋白不結(jié)合陽(yáng)離子柱,結(jié)合S柱的目的蛋白通過(guò)KTA pure系統(tǒng)用高鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫,將目的蛋白與標(biāo)簽蛋白分離。最后將純化得到的ZNF24全長(zhǎng)和鋅指結(jié)構(gòu)域蛋白濃縮至2 mL,上樣至緩沖液(20 mmol/L HEPES pH 7.5,100 mmol/L NaCl,20 μmol/L ZnCl2,2 mmol/L DTT)平衡好的Superdex200 16/600凝膠過(guò)濾層析柱上進(jìn)一步純化ZNF24全長(zhǎng)和鋅指結(jié)構(gòu)域蛋白,收集蛋白出峰樣品。以上各組分均進(jìn)行SDS-PAGE電泳,檢測(cè)蛋白表達(dá)及純度，方法見(jiàn)文獻(xiàn)[21]。

1.2.3 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)

Ni-NTA親和層析純化的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后,300 mA恒流條件下濕轉(zhuǎn)1 h到硝酸纖維素(NC)膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,用5%脫脂牛奶(1×TBST)室溫下封閉1 h,1×TBST洗膜5 min,重復(fù)3次。加入一抗(Anti-6×His tag鼠抗)室溫孵育2 h或4 ℃過(guò)夜孵育,洗膜3次；加入二抗(HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗)室溫孵育1 h,洗膜3次后滴加顯影液進(jìn)行顯色。

1.2.4 動(dòng)態(tài)光散射分析

動(dòng)態(tài)光散射(Dynamic Light Scattering, DLS)測(cè)定步驟參考文獻(xiàn)[22],在DynaProStar(Wyatt Technology, USA)的DYNAMICS軟件上完成,光源波長(zhǎng)為658 nm,固定散射角為90°,將高純度的蛋白樣品稀釋至1 mg/mL,稀釋緩沖液成分為20 mmol/L HEPES pH 7.5,100 mmol/L NaCl,20 μmol/L ZnCl2,2 mmol/L DTT,每個(gè)樣品測(cè)量10次。

1.2.5 凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)

Zhao等[23]發(fā)現(xiàn)ZNF24鋅指結(jié)構(gòu)域傾向于結(jié)合AT和AGGG的DNA序列,因此本實(shí)驗(yàn)合成了DNA序列5’-GAAATAATGTTA-3’和5’-GGAGGGTGGTTA-3’及其互補(bǔ)序列,退火形成的雙鏈DNA底物分別用S1、S2表示。通過(guò)凝膠遷移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ZNF24全長(zhǎng)蛋白和鋅指結(jié)構(gòu)域ZNF24(243～368)蛋白與核酸底物的結(jié)合能力。將合成好的單鏈DNA用緩沖液(20 mmol/L HEPES pH 7.5,100 mmol/L NaCl)稀釋,在PCR管中等體積加入兩條互補(bǔ)配對(duì)的DNA單鏈,吹打混勻后放入PCR儀中,運(yùn)行如下退火程序: 95 ℃加熱5 min后開(kāi)始逐步降溫,每降1 ℃維持90 s,直到溫度降至4 ℃,退火成雙鏈的DNA底物保存于-20 ℃。

將雙鏈DNA底物稀釋為4 μmol/L,蛋白稀釋為4、8、16、32、64 μmol/L,然后將蛋白與雙鏈DNA底物各取5 μL混合后,放冰上孵育1 h。反應(yīng)結(jié)束后,加入2 μL 6×EMSA Loading buffer進(jìn)行凝膠電泳。整個(gè)電泳過(guò)程在低溫條件下進(jìn)行,電壓設(shè)置為100 V,電泳進(jìn)行30～45 min。電泳結(jié)束后,將凝膠用GelRed核酸染料置于暗處染色5 min,磷屏壓片放射自顯影后,用Typhoon FLA9000掃描凝膠成像。

1.2.6 生物信息學(xué)分析

通過(guò)Expasy ProtParam(https:∥web.expasy.org/protparam/)計(jì)算蛋白的分子量、理論等電點(diǎn)和消光系數(shù)。IUPred2(http:∥iupred2a.elte.hu.)是目前常用的用于預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)內(nèi)部無(wú)序區(qū)域的網(wǎng)站,將蛋白序列提交后,IUPred2可以對(duì)每一個(gè)氨基酸殘基在0到1之間打分,得分在0.5以上的殘基為無(wú)序度較高的殘基。二級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)是通過(guò)Clustal W(https:∥www.genome.jp/tools-bin/clustalw)網(wǎng)站進(jìn)行,然后用ESPript 3.0(https:∥espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)進(jìn)行顯示。

2 結(jié)果與分析

2.1 人源鋅指蛋白ZNF24生物信息學(xué)分析

ZNF24全長(zhǎng)共含有368個(gè)氨基酸,理論相對(duì)分子量約為42.1 kDa,等電點(diǎn)為5.82。它的N端包含一個(gè)SCAN結(jié)構(gòu)域,C端為鋅指區(qū),由4個(gè)連續(xù)的鋅指結(jié)構(gòu)組成(圖1(a)，見(jiàn)第170頁(yè))。將人源ZNF24的SCAN結(jié)構(gòu)域與人源ZNF305、ZNF500、ZNF213、ZNF174、ZNF197以及鼠源ZFP206的SCAN結(jié)構(gòu)域序列進(jìn)行比對(duì)分析可知,ZNF24的SCAN序列在α3螺旋區(qū)域的氨基酸序列非常保守(圖1(b)，見(jiàn)第170頁(yè))。ZNF24每個(gè)鋅指均有兩個(gè)保守的半胱氨酸和組氨酸,屬于典型的C2H2型鋅指,其中F/Y/L氨基酸構(gòu)成鋅指結(jié)構(gòu)域的疏水核(圖1(c)，見(jiàn)第170頁(yè))。IUPred2預(yù)測(cè)結(jié)果顯示ZNF24蛋白N端氨基酸23～45、110～140得分(Score)高于0.5,表明這兩處均存在無(wú)序區(qū)域；C端鋅指結(jié)構(gòu)域得分在0.5以下,表明整體有序度較高(圖1(d)，見(jiàn)第170頁(yè))。

圖1 人源鋅指蛋白ZNF24序列分析Fig.1 Sequence analysis of Zinc finger protein 24(a) ZNF24全長(zhǎng)蛋白結(jié)構(gòu)域組成示意圖；(b) 不同鋅指蛋白SCAN結(jié)構(gòu)域多重序列比對(duì);(c) ZNF24鋅指結(jié)構(gòu)域氨基酸序列；(d) ZNF24蛋白有序度分析結(jié)果。

2.2 ZNF24的表達(dá)與純化

測(cè)序結(jié)果表明目的基因成功連接到載體上,構(gòu)建好的重組質(zhì)?？捎糜谙乱徊侥康牡鞍椎谋磉_(dá)。重組質(zhì)粒表達(dá)的目的蛋白N端帶有6×His-Sumo標(biāo)簽,因此先通過(guò)Ni-NTA親和層析進(jìn)行蛋白純化。6×His-Sumo標(biāo)簽包含122個(gè)氨基酸,帶有標(biāo)簽的ZNF24蛋白含有490個(gè)氨基酸,其相對(duì)分子量為約為55.9 kDa,理論等電點(diǎn)為5.87。將蛋白樣品進(jìn)行Western blot驗(yàn)證,誘導(dǎo)后ZNF24蛋白在大腸桿菌中高效表達(dá),蛋白條帶在55～70 kDa之間,且大部分目的蛋白均在可溶性的上清中(圖2(a))。將洗脫的目的蛋白純度加入U(xiǎn)LP1過(guò)夜酶切透析,切掉N端的6×His-Sumo標(biāo)簽,再經(jīng)2次Ni-NTA親和層析純化,將目的蛋白與標(biāo)簽分離(圖2(b))。最后利用凝膠過(guò)濾層析進(jìn)一步純化目的蛋白,ZNF24蛋白出峰位置在66.53 mL(圖2(c)),推算其相對(duì)分子量約為135 kDa,因此可以判斷ZNF24全長(zhǎng)蛋白在溶液中以三聚體形式存在,且峰形較為對(duì)稱,SDS-PAGE結(jié)果顯示最終得到的ZNF24蛋白純度在90%左右(圖2(d))。

圖2 ZNF24蛋白純化結(jié)果Fig.2 Purification results of ZNF24 protein(a) Western blot檢測(cè)結(jié)果。M為蛋白Marker,N為未誘導(dǎo)全菌,T為誘導(dǎo)后全菌,S為破菌離心后的上清,P為離心后的沉淀,FT為上清流過(guò)Ni介質(zhì)的組分,泳道30、50、100、250、500為不同濃度咪唑緩沖液洗脫的蛋白組分。(b) ZNF24蛋白ULP1酶切和2次Ni-NTA親和層析純化結(jié)果。M為蛋白Marker,B為ULP1酶切前蛋白,A為酶切后蛋白,FT為切后流穿,E為250 mmol/L咪唑緩沖液洗脫樣品。(c) ZNF24蛋白凝膠過(guò)濾層析純化蛋白峰圖。66.53 mL為蛋白的出峰位置的體積。(d) SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果。泳道M表示蛋白Marker,L表示分子篩上樣時(shí)樣品,數(shù)字表示的是收集的樣品對(duì)應(yīng)的體積。

2.3 ZNF24(243～368)蛋白的表達(dá)與純化

ZNF24的鋅指結(jié)構(gòu)域包含C端243～368位,共126個(gè)氨基酸殘基,相對(duì)分子量約為14.4 kDa,理論等電點(diǎn)為9.6。通過(guò)Ni-NTA親和層析、ULP1酶切、陽(yáng)離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析純化后,獲得高純度可溶性的ZNF24(243～368)蛋白,凝膠過(guò)濾層析蛋白出峰體積在67.31 mL(圖3(a)),可以判斷ZNF24(243～368)蛋白在溶液中以單體形式存在,SDS-PAGE結(jié)果顯示蛋白純度在95%以上(圖3(b))。

圖3 ZNF24(243～368)純化結(jié)果Fig.3 Purification results of ZNF24(243～368)protein(a) ZNF24(243～368)凝膠過(guò)濾層析純化結(jié)果；(b) SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果。

2.4 動(dòng)態(tài)光散射分析

DLS測(cè)定用于確定蛋白在溶液中的顆粒粒徑分布,分布系數(shù)(Particle Dispersion Index, PDI)<20時(shí),可將體系看作單分散系。DLS結(jié)果表明ZNF24蛋白在溶液中粒徑(Radius,R)為5.4 nm的顆粒質(zhì)量分?jǐn)?shù)(w)為99.9%,PDI值為31.2(圖4(a)),高于單一分散系的臨界點(diǎn)20,說(shuō)明蛋白在溶液聚合狀態(tài)不均一。ZNF24(243～368)蛋白在溶液中粒徑為2.7 nm的顆粒質(zhì)量分?jǐn)?shù)(w)為92.1%,PDI值為2.8,說(shuō)明蛋白在溶液中是均勻分布的(圖4(b))。

圖4 ZNF24蛋白DLS測(cè)定結(jié)果Fig.4 DLS analysis of ZNF24 protein(a) DLS分析ZNF24全長(zhǎng)蛋白在溶液中的分布；(b) DLS分析ZNF24(243～368)在溶液中的分布。

2.5 全長(zhǎng)ZNF24和ZNF24(243～368)與DNA底物結(jié)合

凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)用于體外驗(yàn)證蛋白質(zhì)與核酸結(jié)合活性的研究,主要基于蛋白質(zhì)與核酸結(jié)合形成蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物,分子量變大,在凝膠電泳過(guò)程中遷移速率慢,未結(jié)合蛋白的核酸分子量小,遷移速率快,從而出現(xiàn)條帶的遷移。因此我們根據(jù)條帶的遷移可以判斷蛋白質(zhì)與核酸是否有相互作用,依據(jù)蛋白與核酸的濃度可以估算其結(jié)合的比例。

將全長(zhǎng)ZNF24和ZNF24(243～368)分別與雙鏈DNA底物S1、S2進(jìn)行孵育,待反應(yīng)結(jié)束后,進(jìn)行凝膠電泳。隨著ZNF蛋白濃度的提高,游離的DNA底物S1、S2量沒(méi)有減少(圖5(a,d)),說(shuō)明ZNF24全長(zhǎng)蛋白幾乎不結(jié)合底物S1、S2。隨著ZNF24(243～368)濃度的提高,游離的DNA底物S1、S2的量明顯減少(圖5(b,e))。由于蛋白在緩沖液中帶正電,不能進(jìn)入到膠孔中,因此與蛋白結(jié)合的DNA底物有一部分滯留在膠孔,還有一部分隨著蛋白跑向內(nèi)槽電泳液中,因此EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明ZNF24(243～368)能與雙鏈DNA底物S1、S2發(fā)生結(jié)合。全長(zhǎng)蛋白相較于鋅指結(jié)構(gòu)域與底物S1、S2的結(jié)合比例存在明顯差異,鋅指結(jié)構(gòu)域蛋白與底物S1、S2的結(jié)合能力相近(圖5(c,f))。

圖5 鋅指結(jié)構(gòu)域ZNF24和鋅指結(jié)構(gòu)域ZNF24(243～368)與DNA底物結(jié)合情況Fig.5 Interaction of ZNF24 and ZNF24(243～368) protein with DNA substrate(a) ZNF24與底物S1 EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果；(b) ZNF24(243～368)與底物S1 EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果；(c) ZNF24和ZNF24(243～368)與底物S1結(jié)合百分比,通過(guò)Imag J軟件計(jì)算膠圖中每個(gè)泳道游離DNA底物條帶的灰度值,結(jié)合比例=1-相應(yīng)蛋白濃度泳道的灰度值/泳道1的灰度值；(d) ZNF24與底物S2 EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果；(e) ZNF24(243～368)與底物S2 EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果；(f) ZNF24和ZNF24(243～368)與底物S2結(jié)合百分比。

3 討 論

本文中,我們構(gòu)建了人源鋅指蛋白ZNF24和鋅指結(jié)構(gòu)域ZNF24(243～368)原核表達(dá)載體,并在大腸桿菌中成功表達(dá)目的蛋白。通過(guò)Ni-NTA親和層析、陽(yáng)離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析純化手段,獲得了高純度的可溶性目的蛋白。我們發(fā)現(xiàn)ZNF24全長(zhǎng)蛋白在溶液中以三聚體形式存在,而ZNF24的鋅指結(jié)構(gòu)域在溶液中為單體。研究表明SCAN結(jié)構(gòu)域是一個(gè)高度保守富含亮氨酸的結(jié)構(gòu)域,一般含有84個(gè)氨基酸,位于C2H2鋅指蛋白家族的N端附近[24]。生化結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明ZNF24的SCAN結(jié)構(gòu)域是一個(gè)選擇性寡聚結(jié)構(gòu)域,單獨(dú)的SCAN結(jié)構(gòu)域蛋白在溶液中可形成不對(duì)稱的同源二聚體[12],這表明ZNF24蛋白N端的SCAN結(jié)構(gòu)域能夠促進(jìn)全長(zhǎng)蛋白的寡聚化,因此ZNF24全長(zhǎng)蛋白在溶液中是多聚體的形式。同時(shí)SCAN結(jié)構(gòu)域與鋅指結(jié)構(gòu)之間的序列為固有無(wú)序區(qū)域(圖1(d)),無(wú)序區(qū)域容易形成無(wú)規(guī)則卷曲,可能會(huì)引起蛋白的聚合[25-26]。

通過(guò)EMSA實(shí)驗(yàn)體外驗(yàn)證了鋅指結(jié)構(gòu)域ZNF24(243～368)蛋白能夠結(jié)合雙鏈DNA序列5’-GAAATAATGTTA-3’和5’-GGAGGGTGGTTA-3’,但全長(zhǎng)ZNF24蛋白不能與這兩個(gè)雙鏈DNA底物結(jié)合,表明全長(zhǎng)蛋白的寡聚可能會(huì)導(dǎo)致與DNA底物結(jié)合的鋅指結(jié)構(gòu)域氨基酸位點(diǎn)被隱藏,使ZNF24全長(zhǎng)蛋白與DNA結(jié)合的能力變?nèi)?這也預(yù)示著ZNF24蛋白N端的SCAN結(jié)構(gòu)域會(huì)影響ZNF24調(diào)控基因表達(dá)作用的發(fā)揮。通過(guò)對(duì)鋅指蛋白ZNF24體外純化和DNA結(jié)合性質(zhì)的研究,為進(jìn)一步研究鋅指蛋白ZNF24調(diào)控基因表達(dá)提供基礎(chǔ),同時(shí)表明SCAN結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的蛋白寡聚可能代表了一種新的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)機(jī)制。