利用肝臟類器官探究CEBPD和HMGA2對膽管細胞向肝細胞轉(zhuǎn)分化的作用

金 丹,魏勁松,趙 冰

(復旦大學 生命科學學院,上海 200438)

肝臟是人體內(nèi)最大的實質(zhì)器官,主要由肝實質(zhì)細胞及膽管上皮細胞構(gòu)成,發(fā)揮著營養(yǎng)物質(zhì)代謝、解毒及免疫等重要生理功能。肝臟具有強大的再生能力,能夠在損傷后快速完成自我修復,這對于肝臟解毒功能的實現(xiàn)非常關(guān)鍵。損傷發(fā)生后,成熟的肝實質(zhì)細胞能夠快速啟動自我復制以補充損傷的組織[1],是損傷修復的主要細胞來源[2]。酒精及毒素等成分的長期接觸,會導致肝實質(zhì)細胞再生能力受損,門靜脈周的膽管細胞可轉(zhuǎn)分化形成肝實質(zhì)細胞[3-4],對損傷修復也有著重要貢獻。然而,膽管細胞向肝實質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的分子機制仍有待探索。膽管類器官,能夠保持膽管細胞特征并在體外長期擴增,同時具備向成熟肝實質(zhì)樣細胞分化的潛能[5],為體外探究肝臟發(fā)育及譜系轉(zhuǎn)化提供了新的途徑。腺相關(guān)病毒(Adeno-Associated Virus, AAV)可高效便捷地實現(xiàn)膽管類器官感染與基因操控[6],進一步拓寬肝臟類器官的應(yīng)用前景。

CCAAT/增強子結(jié)合蛋白δ(CCAAT/Enhancer Binding Protein Delta, CEBPD)通過亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域結(jié)合DNA,在多種細胞類型中調(diào)控基因表達[7]。CEBPD的表達受到促炎細胞因子、皮質(zhì)類固醇、低氧低糖等多種因素的誘導[7-8],對于細胞應(yīng)激、炎癥發(fā)生及細胞周期的調(diào)節(jié)至關(guān)重要[9-10]。例如,CEBPD可響應(yīng)促炎因子白細胞介素IL-1β,促進培養(yǎng)成骨細胞及血管平滑肌細胞的增殖[11-12]；營養(yǎng)和空間的限制可誘導CEBPD的表達,促進乳腺上皮細胞和成纖維細胞的接觸抑制[13]。肝臟具有解毒功能,如果長期接觸內(nèi)源毒素、藥物、尼古丁等物質(zhì),那么快速地響應(yīng)損傷信號、啟動細胞更新及譜系轉(zhuǎn)化的能力對于它來說就至關(guān)重要,而作為協(xié)助多類組織細胞應(yīng)激的CEBPD在肝臟細胞命運決定中的功能還未有過報道。

高遷移率蛋白A2(High Mobility Group A2, HMGA2),可與基因上AT富集區(qū)結(jié)合,改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)象進而調(diào)控基因表達,是一種結(jié)構(gòu)性轉(zhuǎn)錄因子[14]。人與小鼠胚胎發(fā)育早期的肝臟組織高表達HMGA2蛋白,隨著發(fā)育進行,在妊娠晚期該蛋白表達逐漸下調(diào),出生后健康肝臟組織中檢測不到其表達[15]。此類表達模式提示HMGA2可能參與肝祖細胞的譜系維持。此外,HMGA2還是重要的原癌基因,參與調(diào)控TGF-β/Smad2/ERK、Notch等多條信號通路[16]。在慢性肝臟代謝疾病、原發(fā)性肝癌及肝內(nèi)膽管癌組織中,HMGA2表達水平均異常上調(diào),與炎癥加重、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細胞周期異常及不良預后高度相關(guān)[17-19]。然而HMGA2在肝臟發(fā)育及干性維持中的功能尚未見報道。

本文以膽管類器官體外分化系統(tǒng)為實驗模型,通過AAV-DJ實現(xiàn)基因操控,初步探究CEBPD與HMGA2這兩個轉(zhuǎn)錄因子在肝細胞干性維持、譜系轉(zhuǎn)化過程中的功能,提示了肝臟損傷后膽管細胞激活并形成肝實質(zhì)細胞的機制,為類器官在再生醫(yī)學中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

C57BL/6小鼠購自上海模式生物研究中心,飼養(yǎng)于SPF級鼠房。所有涉及動物的操作均得到復旦大學動物保護與使用委員會的許可(SYXK(滬)2020-0032)。

1.1.2 主要試劑

Advanced DMEM/F12、DMEM、磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline, PBS。含NaCl 137 mmol/L,KCl 2.7 mmol/L,Na2HPO44.3 mmol/L,KH2PO41.4 mmol/L的水溶液)、青霉素-鏈霉素(P/S,含10 000 U/mL青霉素和10 000 U/mL鏈霉素)、谷丙氨酸二肽(GlutaMAX-Ⅰ)、B27細胞無血清培養(yǎng)添加劑均購自Gibco公司,乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine)、煙酰胺(Nicotinamide)、胃泌素([Leu15]-gastrin)、DAPT、地塞米松(Dexamethasone)、膠原酶、中性蛋白酶Ⅱ均購自Sigma公司,TrypLE購自Life Technologies公司,Matrigel Matrix、Cell Recovery Solution均購自Corning公司,表皮生長因子(Epidermal Growth Factor, EGF)購自Invitrogen公司,成纖維細胞生長因子10(Fibroblast Growth Factor, FGF10)、R-spondin-1購自Kactus公司,肝細胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor, HGF)購自北京義翹神州科技股份有限公司,A83-01購自Torcris Bioscience公司,無蛋白快速封閉液購自雅酶公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠膽管類器官分離培養(yǎng)及傳代

分離培養(yǎng): 取6～8周齡小鼠肝臟左葉,棄掉門管區(qū)域的肝臟組織,在預冷的PBS中清洗3次；在(含1%胎牛血清、0.5%P/S的DMEM)中將組織剪碎為0.5 mm3的小塊,轉(zhuǎn)移至15 mL管內(nèi),加入10 mL預冷的Wash buffer,輕輕吹打后,通過靜置1 min或低速800 r/min離心10 s,棄掉上清以達到清洗的目的,重復3次；加入5 mL預置于37 ℃的消化液(含膠原酶與中性蛋白酶Ⅱ的Wash Buffer),水平放置在37 ℃搖床內(nèi),消化30～60 min；靜置1～2 min或低速離心800 r/min 10 s,收集上清,轉(zhuǎn)移至50 mL離心管；加入Wash Buffer至50 mL清洗,搖晃均勻后4 ℃ 200 g離心5 min,棄掉上清,重復兩次；收集沉淀中膽管加入Matrigel,輕柔混勻后接種于24孔板,置于37 ℃培養(yǎng)箱10 min使Matrigel凝固,加入400 μL擴增培養(yǎng)基(Expansion Medium, EM)。每3天更換一次培養(yǎng)基。小鼠膽管類器官擴增培養(yǎng)基EM的成分: 添加10 mmol/L Nicotinamide、0.5 μg/mL R-Spondin-1、50 ng/mL EGF、100 ng/mL FGF10、50 ng/mL HGF、10 nmol/L[Leu15]-gastrin的Advanced DMEM/F12(含工作濃度的P/S、B27、GlutaMax-I、N-acetylcysteine)。

類器官傳代: 用移液槍將包被在Matrigel的類器官輕輕刮下,轉(zhuǎn)移至Eppendorf管內(nèi),加入預冷的PBS輕輕吹打,1 000 r/min離心1 min,棄上清；加入400 μL TrypLE,置于37 ℃培養(yǎng)箱進行消化,每隔1 min輕輕吹打,共消化5～6 min；加入1 mL預冷的PBS終止消化,吹打均勻,800 r/min離心3 min；棄上清,包被在Matrigel內(nèi)接種入24孔培養(yǎng)板中。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染與重組AAV-DJ病毒包裝

選用威格拉斯生物技術(shù)有限公司的VigoFect高效真核轉(zhuǎn)染試劑,進行293T細胞轉(zhuǎn)染。細胞密度為50%～70%時進行轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染前1 h更換新鮮預置于37 ℃培養(yǎng)箱的培養(yǎng)基；按照產(chǎn)品說明書的指示配制DNA與VigoFect混合的轉(zhuǎn)染工作液,滴入細胞培養(yǎng)皿,輕輕混勻；24～48 h后收取細胞樣品。

本課題用到的AAV-DJ病毒[6]為三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法包裝獲得。將AAV-DJ核心表達質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒按照比例混合后,用VigoFect轉(zhuǎn)染293T細胞。48 h后,棄培養(yǎng)上清,輕輕加入預冷的PBS清洗殘余培養(yǎng)基,棄PBS；加入適當體積預冷的PBS,利用細胞刮刮下所有細胞,與PBS一同轉(zhuǎn)移至Eppendorf管中,凍于-80 ℃冰箱15 min,轉(zhuǎn)入37 ℃水浴鍋15 min,每3 min渦旋振蕩；重復以上凍存復溫步驟2次,充分裂解細胞后,4 ℃ 14 000 r/min離心15 min,取上清即為病毒粗提液,按需求分裝存于-80 ℃冰箱。

1.2.3 平面化AAV-DJ轉(zhuǎn)導類器官及分化[6]

“平面化感染法”: 對48孔板進行預處理,每孔滴入5 μL 50%濃度的Matrigel(PBS稀釋),用槍頭將其攤開鋪滿孔底,將孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱10 min使其凝固；用槍頭將類器官和Matrigel一同輕輕掛下,轉(zhuǎn)移至Eppendorf管內(nèi),加入預冷的PBS,輕輕吹打分離基質(zhì)膠；1 000 r/min離心1 min,棄上清,利用含有10%～25%體積AAV-DJ病毒提取液的培養(yǎng)基重懸類器官,轉(zhuǎn)移至預處理后的孔內(nèi)。置于37 ℃培養(yǎng)箱感染12 h；將類器官及培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至Eppendorf管,離心棄病毒上清；加1 mL預冷PBS輕柔吹打清洗病毒液,離心棄病毒上清,將沉淀包被在Matrigel內(nèi)種入培養(yǎng)板中,置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

AAV-DJ感染后的類器官在EM中培養(yǎng)48 h,棄培養(yǎng)基,PBS洗凈殘余培養(yǎng)基。加入第1階段分化培養(yǎng)基(Differentiation Medium-1, DM-1),每天更換一次DM-1,持續(xù)4 d；第5天更換第2階段分化培養(yǎng)基DM-2,每天更換一次DM-2,持續(xù)3 d。小鼠膽管類器官第1階段分化培養(yǎng)基DM-1的成分: 添加了50 ng/mL EGF、100 ng/mL FGF10、10 nmol/L[Leu15]-gastrin Ⅰ、50 nmol/L A83-01、10 μmol/L DAPT的Advanced DMEM/F12(含工作濃度的P/S、B27、GlutaMax-I、N-acetylcysteine)；第2階段分化培養(yǎng)基DM-2的成分: 在DM-1的基礎(chǔ)上添加3 μmol/L dexamethasone。

1.2.4 類器官染色

棄去孔板內(nèi)的培養(yǎng)基,用預冷PBS沖洗；加入預冷的Cell Recovery Solution,置于4 ℃水平搖床1～2 h溫和溶解Matrigel,轉(zhuǎn)移至Eppendorf管中,低溫離心去上清；預冷PBS清洗后,加入預冷4%多聚甲醛置于4 ℃搖床固定30 min；預冷PBS清洗3次,加入含有0.25% Triton X-100的PBS,透化處理15 min,離心棄上清；加入PBST(含0.1%Tween 20的PBS)清洗3次；利用PBST稀釋的無蛋白快速封閉液,室溫封閉30 min,離心棄上清；加入一抗4 ℃孵育過夜,PBST清洗3次；加入二抗室溫孵育1 h,PBST清洗3次；離心后保留約100 μL上清,重懸類器官并轉(zhuǎn)移至載玻片上,避免類器官聚集在一起,吸干多余水分,滴加抗淬滅封片劑,封片。

1.2.5 類器官RNA的提取及Realtime Quantitative PCR(RT-qPCR)

用移液槍將包被在Matrigel的類器官輕輕刮下,轉(zhuǎn)移至Eppendorf管內(nèi),加入預冷的PBS輕輕吹打,離心棄上清；使用RNA提取試劑盒(Tiangen, Cat.DP420)進行RNA提??；使用NanoDrop進行RNA濃度及純度測定。利用GoScriptTM(Promega, Cat.A5000)反轉(zhuǎn)錄試劑盒,按照說明反轉(zhuǎn)1 μg RNA；使用2×SYBR Green Master Mix(Bimake, Cat.B21202)進行熒光定量PCR實驗,每個樣品設(shè)置3個技術(shù)重復。實驗所用引物序列見表1。

表1 實驗所用引物

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

所有值均表示為平均值±標準差形式。采用GraphPad軟件進行統(tǒng)計分析。采用t檢驗和雙向ANOVA檢驗比較兩組間的差異,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。每個實驗獨立重復至少3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建AAV-DJ過表達質(zhì)粒并驗證病毒感染效率

我們首先在AAV-DJ的核心表達質(zhì)粒中插入N端帶有Flag標簽蛋白的人源CEBPD、HMGA2編碼序列,分別命名為AAV-Flag-CEBPD、AAV-Flag-HMGA2,質(zhì)粒表達框架示意圖如圖1(a)所示；同時以帶有GFP序列的質(zhì)粒AAV-GFP作為對照。通過將核心質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)染293T細胞,48 h后裂解細胞獲得AAV-DJ病毒粗提液。

為評估包裝提取的病毒在體外感染細胞并表達目的基因的能力,分別利用AAV-Flag-HMGA2、AAV-Flag-CEBPD病毒感染293T細胞,24 h后收取細胞制成蛋白樣品,進行Western blot試驗,通過孵育Flag抗體檢測目的蛋白的表達。如圖1(b)所示,可檢測到感染AAV-DJ組的293T細胞中目的基因CEBPD、HMGA2有顯著表達,證實構(gòu)建表達質(zhì)粒成功,包裝的AAV-DJ病毒具有轉(zhuǎn)導細胞的能力。

圖1 構(gòu)建表達CEBPD、HMGA2的AAV質(zhì)粒并驗證病毒轉(zhuǎn)導效率Fig.1 Construction of AAV vectors expressing CEBPD,HMGA2 and verification of the transduction efficiency(a) 為表達人源CEBPD、HMGA2基因的AAV核心質(zhì)粒,目的基因N端為Flag標簽序列；(b) 表達CEBPD、HMGA2基因的AAV-DJ感染293T細胞后,收取蛋白樣品,Western blot試驗檢測帶有Flag標簽目的蛋白的表達。

2.2 表達CEBPD、HMGA2的AAV-DJ對小鼠膽管類器官感染效率驗證

為進一步觀察包裝的AAV-DJ病毒對于完整膽管類器官的感染能力,我們采用了如圖2(a)(見第162頁)平面化的感染方式,即通過輕輕吹打的方式將生長至合適大小的膽管類器官從Matrigel中分離,與病毒液混勻后,轉(zhuǎn)移至50%Matrigel預處理的平面感染12 h,將其收集至管中通過離心去除病毒液,恢復3D培養(yǎng)。此種感染方式避免了3D培養(yǎng)體系對病毒感染的干擾,預處理后的培養(yǎng)板能提供介于3D與平面間的培養(yǎng)環(huán)境,支持完整類器官的感染,避免消化成單細胞后感染帶來的損傷及較長培養(yǎng)時間。

再次恢復3D培養(yǎng)48 h后,將類器官從膠中剝離,孵育Flag抗體進行免疫熒光染色,在奧林巴斯FV3000熒光倒置顯微鏡下觀察其感染效率。如圖2(b)(見第162頁)所示,感染AAV-Flag-CEBPD、AAV-Flag-HMGA2的類器官中,可見大部分細胞均為Flag陽性,即成功感染AAV并表達了目的蛋白。以上結(jié)果說明包裝提取的AAV-DJ對完整的小鼠膽管類器官有較高的轉(zhuǎn)導效率。

圖2 過表達CEBPD、HMGA2的AAV-DJ高效感染小鼠膽管類器官Fig.2 Representative immunofluorescence images of mouse liver ductal organoids transduced with AAV-DJ expressing GFP, Flag-CEBPD or Flag-HMGA2(a) 為AAV-DJ平面化感染膽管類器官的實驗流程示意圖。將完整的膽管類器官從Matrigel中剝離后,與含病毒的培養(yǎng)基混合,轉(zhuǎn)移至Matrigel預處理后的平面孵育12 h,PBS去除病毒后,將類器官恢復3D環(huán)境培養(yǎng)。(b) 為轉(zhuǎn)導AAV-GFP(上)、AAV-Flag-CEBPD(中)、AAV-Flag-HMGA2(下)24 h的小鼠膽管類器官,在熒光倒置顯微鏡下成像。綠色: Flag(顯示CEBPD或HMGA2的表達),藍色: Hoechst3342(顯示細胞核)。比例尺為50 μm。

2.3 過表達CEBPD可促進膽管類器官的分化

體外培養(yǎng)及誘導膽管類器官需要加入多種生長因子,從培養(yǎng)基中撤去Wnt信號通路激動劑R-spondin1,同時添加A83-01、DAPT分別阻斷TGF-β、Notch信號通路。據(jù)文獻報道TGF-β信號通路在膽管的形成和發(fā)育中具有重要作用,Notch信號通路對膽管細胞的分化十分關(guān)鍵[20]。借助類器官模型,我們研究了CEBPD、HMGA2在膽管向肝實質(zhì)細胞分化過程的功能。

AAV-DJ感染類器官后,對類器官進行7 d分化處理,收集類器官提取RNA,熒光實時定量PCR檢測膽管細胞及肝實質(zhì)細胞相關(guān)標志基因表達水平。EM-GFP指感染AAV-GFP后培養(yǎng)在擴增培養(yǎng)基中的類器官,DM-GFP指感染AAV-GFP后培養(yǎng)在分化培養(yǎng)基中的類器官,感染AAV-CEBPD或AAV-HMGA2后培養(yǎng)在分化培養(yǎng)基中的類器官,分別記為DM-CEBPD或DM-HMGA2。

如圖3所示,與EM-GFP組相比,DM-GFP組類器官中膽管標志基因Sox9、Spp1的表達顯著下調(diào),多個肝實質(zhì)細胞標志性基因,如白蛋白基因Albumin、甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白基因Ttr、細胞色素P450家族成員基因Cyp3a11、載脂蛋白基因Apoa1、尿蛋白編碼基因Mup20等顯著上調(diào),表明該分化處理能顯著誘導膽管類器官向肝實質(zhì)細胞分化。

圖3 過表達CEBPD促進膽管類器官向?qū)嵸|(zhì)細胞分化Fig.3 Overexpression of CEBPD enhances the differentiation of cholangiocytes into hepatocytesqRT-PCR檢測膽管上皮細胞標志基因: Sox9(a),Spp1(b),與肝實質(zhì)細胞標志基因: Albumin(c),Ttr(d),Cyp3a11(e),Apoa1(f),Mup20(g)的相對表達量,內(nèi)參基因為β-Actin。EM-GFP、DM-GFP為感染AAV-GFP后分別培養(yǎng)于擴增培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基的類器官,DM-CEBPD為感染AAV-Flag-CEBPD后于分化培養(yǎng)基培養(yǎng)同等時長的類器官。統(tǒng)計數(shù)據(jù)為平均值±標準差,n=3,**表示P<0.01,***表示P<0.001。

與DM-GFP組相比,膽管類器官中過表達CEBPD基因且經(jīng)過誘導分化可進一步顯著下調(diào)膽管標志基因Sox9、Spp1的mRNA水平；而Albumin、Ttr、Cyp3a11、Apoa1、Mup20等指示肝細胞成熟的基因mRNA水平均顯著升高,指示該轉(zhuǎn)錄因子能夠促進膽管上皮細胞向?qū)嵸|(zhì)細胞分化。

2.4 過表達HMGA2對膽管類器官的分化起抑制影響

在膽管類器官中過表達HMGA2并誘導分化,譜系轉(zhuǎn)化相關(guān)基因表達如圖4(見第164頁)所示。與DM-GFP組相比,在分化過程中下調(diào)的膽管細胞標志基因Spp1的mRNA水平顯著升高,Sox9mRNA水平無顯著差異。盡管肝實質(zhì)細胞經(jīng)典標志基因Albumin在HMGA2過表達組與DM-GFP組中無顯著差異,但是多個肝實質(zhì)細胞標志基因mRNA水平均顯著下調(diào),如Ttr、Cyp3a11、Mup20、Apoa1；值得注意的是,在膽汁排泌和葡糖苷酸修飾的膽紅素轉(zhuǎn)運過程中起重要作用的基因Mrp2,其mRNA水平也顯著下調(diào)；此外,關(guān)鍵的磺基轉(zhuǎn)移酶基因Sult1a1的mRNA水平在HMGA2過表達組也顯著下調(diào),磺基轉(zhuǎn)移酶不僅能修飾膽汁酸、毒素以降低其細胞毒性,其加工對于藥物、激素等物質(zhì)的轉(zhuǎn)運非常重要,其表達也是肝功能代謝實現(xiàn)的一個重要標志。可見在膽管類器官向?qū)嵸|(zhì)細胞分化過程中,HMGA2能夠多維度地抑制肝臟的蛋白合成、膽汁排泌、載脂等功能,對膽管細胞轉(zhuǎn)分化過程起抑制作用。

圖4 過表達HMGA2抑制膽管類器官向?qū)嵸|(zhì)細胞分化Fig.4 Overexpression of HMGA2 inhibits the differentiation of cholangiocytes into hepatocytesqRT-PCR檢測膽管細胞標志基因: Sox9(a),Spp1(b),與肝實質(zhì)細胞標志基因: Albumin(c),Ttr(d),Cyp3a11(e),Mup20(f),Mrp2(g),Apoa1(h),Sult1a1(i)的相對表達量,內(nèi)參基因為β-Actin。EM-GFP、DM-GFP為感染AAV-GFP后分別培養(yǎng)于增殖培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基的類器官,DM-HMGA2為感染AAV-Flag-HMGA2后于分化培養(yǎng)基培養(yǎng)同等時長的類器官。統(tǒng)計數(shù)據(jù)為平均值±標準差,n=3,*表示P<0.05,***表示P<0.001。

3 討 論

目前肝臟類器官培養(yǎng)材料多取于成體肝臟的膽管組織,可長期擴增,并具備向肝實質(zhì)細胞分化的潛能[5],高度還原體內(nèi)環(huán)境肝臟細胞轉(zhuǎn)分化,可作為探究體內(nèi)肝臟發(fā)育及細胞可塑性的理想模型。AAV對于類器官高效的基因操控效果,加速了類器官的廣泛應(yīng)用。本工作結(jié)合AAV的高效轉(zhuǎn)導與膽管類器官體外分化系統(tǒng),在體外首次揭示了CEBPD、HMGA2對肝實質(zhì)細胞分化的重要影響。

在本文工作中我們發(fā)現(xiàn),在膽管類器官中過表達CEBPD后進行分化處理,不僅可以進一步下調(diào)膽管的標志基因Sox9、Spp1,同時促進肝臟功能基因Albumin、細胞色素P450家族成員Cyp3a11、載脂蛋白編碼基因Apoa1的表達。研究證實該蛋白可協(xié)助膽管類器官更強烈地響應(yīng)分化相關(guān)信號分子,增強分化程度,加速膽管細胞向肝實質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)化,這和過去工作揭示的CEBPD響應(yīng)應(yīng)激、參與細胞周期調(diào)節(jié)與命運決定的功能一致。類器官體外分化模型高度模擬體內(nèi)譜系轉(zhuǎn)化過程,因此CEBPD是否參與調(diào)控體內(nèi)膽管細胞響應(yīng)損傷信號、大量擴增并向肝實質(zhì)細胞分化等過程,值得進一步探究。

在膽管類器官分化過程中,HMGA2蛋白的過表達能顯著抑制肝臟功能相關(guān)多基因的表達,包括膽汁酸修飾相關(guān)的Sult1a1、解毒相關(guān)的細胞色素P450家族成員基因Cyp3a11、膽紅素轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因Mrp2、載脂蛋白編碼基因Apoa1等。該蛋白抑制肝細胞功能基因的潛力可能對應(yīng)其在胚胎肝臟中高表達的模式,其高表達可維持細胞干性,抑制細胞分化,該蛋白在發(fā)育晚期顯著下調(diào)對于肝實質(zhì)細胞成熟非常關(guān)鍵[21]。HMGA2可抑制分化過程中干性相關(guān)標志基因Spp1的下調(diào),臨床數(shù)據(jù)庫的深度挖掘發(fā)現(xiàn)Spp1可能是肝細胞癌發(fā)生早期的敏感指標,與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、凋亡抑制高度相關(guān)[22],HMGA2與Spp1表達的正相關(guān)性是否與其在非酒精性脂肪性肝炎、肝癌及肝內(nèi)膽管癌中異常表達相關(guān),也是值得深入探討的生物學問題。

成體組織來源的肝類器官,不僅能夠在體外還原不同類型肝臟疾病[23-25]及肝腫瘤[26]基因的表達與關(guān)鍵特征,作為移植材料還能在體內(nèi)修復功能缺陷肝實質(zhì)細胞[23],重建膽囊壁[27],展現(xiàn)了其在肝臟發(fā)育、疾病模擬、再生醫(yī)學等領(lǐng)域中的巨大潛力。高脂食物、藥物、酒精的長期攝入及精神壓力會導致慢性肝損傷,肝臟再生能力受損,此時膽管細胞同時體現(xiàn)出膽管及肝實質(zhì)細胞的表達譜,譜系追蹤也發(fā)現(xiàn)膽管細胞具有雙向分化潛能,對肝臟修復具有重要作用[3,28]。肝類器官的運用能夠加速膽管細胞轉(zhuǎn)分化過程中不同轉(zhuǎn)錄因子的功能解析,加深對膽管類器官命運調(diào)控的理解,這不僅助力肝臟疾病的體外建模及相關(guān)藥物的研發(fā),還能夠更精準高效地調(diào)控細胞譜系轉(zhuǎn)化,為再生醫(yī)學的發(fā)展提供豐富的理論基礎(chǔ)。