細(xì)胞治療在腎臟移植中的應(yīng)用前景*

李楊 戎瑞明

器官移植是終末期器官衰竭的重要治療方法之一，但移植術(shù)后的器官結(jié)構(gòu)功能損傷和免疫排斥反應(yīng)影響患者生存時(shí)長(zhǎng)和質(zhì)量。同時(shí)，部分受者在移植后會(huì)患有代謝性疾?。ㄌ悄虿?、高血壓、高血脂）影響預(yù)后[1]。免疫抑制劑的應(yīng)用雖可改善腎移植患者1年生存期，但移植物的長(zhǎng)期存活率并沒(méi)有得到提高[2]。全身應(yīng)用免疫抑制劑會(huì)顯著降低受者自身免疫功能并破壞腫瘤免疫監(jiān)視機(jī)制，增加致命感染風(fēng)險(xiǎn)，誘發(fā)心血管疾病和惡性腫瘤[3]。近年來(lái)，細(xì)胞治療方興未艾，細(xì)胞治療在移植免疫中的研究及潛在價(jià)值日益受到重視。

細(xì)胞治療是指利用功能性細(xì)胞的特性，采用體內(nèi)外獲取/擴(kuò)增、特殊培養(yǎng)等處理后，使這些細(xì)胞具有增強(qiáng)免疫、靶向殺死病原體和有害細(xì)胞、促進(jìn)組織器官再生和機(jī)體康復(fù)等治療效果。細(xì)胞治療本質(zhì)上是給患者輸注血液有效成分，是輸血醫(yī)學(xué)的潛在拓展方向。從血液/骨髓中分離提取具有特定生物學(xué)特點(diǎn)的細(xì)胞，如間充質(zhì)（mesenchymal stem cells，MSCs）/造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSCs）、髓系來(lái)源的抑制性細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）等[4-7]，可以用于實(shí)體器官移植患者的治療，促進(jìn)輸血和器官移植學(xué)科的融合發(fā)展。美國(guó)血液與生物治療協(xié)會(huì)（AABB）已將傳統(tǒng)輸血、細(xì)胞治療、患者血液管理三大部分置于并重的狀態(tài)，因此在輸血醫(yī)學(xué)領(lǐng)域加強(qiáng)細(xì)胞治療研究是其發(fā)展趨勢(shì)，值得國(guó)內(nèi)輸血同行借鑒。目前國(guó)內(nèi)臨床上血液成分單采治療技術(shù)[8]、富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）治療[9]等開(kāi)展已為輸血科介入細(xì)胞治療領(lǐng)域開(kāi)辟了道路。

目前細(xì)胞治療臨床應(yīng)用研究更多集中在腫瘤患者治療中，如造血干細(xì)胞移植（hematopoietic

stem cell transplantation，HSCT）、嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法（chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T）治療血液系統(tǒng)疾病和實(shí)體腫瘤等[10-11]。隨著研究的深入，越來(lái)越多非腫瘤性疾?。ㄆ鞴僖浦瞇12]、自身免疫性疾病[13]等）成為細(xì)胞治療的適應(yīng)證。

本文將以腎臟移植為例，探討細(xì)胞治療在器官移植中的應(yīng)用前景，細(xì)胞治療有望實(shí)現(xiàn)腎移植受者的移植物長(zhǎng)期存活和更低感染概率，使受者免疫抑制劑使用量減到最低甚至脫離使用，從而實(shí)現(xiàn)針對(duì)移植物的特異性免疫耐受。

1 抑制炎癥反應(yīng)，減輕急性腎損傷 急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）常見(jiàn)病因包括缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injrty，IRI）[14]、藥物（順鉑、甲氨蝶呤、萬(wàn)古霉素）毒性[15]、膿毒癥[16]、梗阻性腎病[17]等。AKI是腎移植失敗的危險(xiǎn)因素，在移植早后期均可出現(xiàn)，造成移植物功能延遲（delayed graft function，DGF）或急性惡化，且DGF風(fēng)險(xiǎn)率受AKI分期影響。與器官移植相關(guān)的最重要的AKI是由IRI導(dǎo)致，腎小管上皮細(xì)胞（tubular epithelial cells，TECs）損傷和炎癥反應(yīng)是IRI的核心環(huán)節(jié)。

MSCs是一類(lèi)多能性干細(xì)胞，可分泌多種細(xì)胞因子：包括趨化因子、抑炎因子和生長(zhǎng)因子，具有免疫調(diào)節(jié)的功能。當(dāng)MSCs遷移到損傷部位，可以與炎性微環(huán)境相互作用，微環(huán)境中的炎癥因子可以影響MSCs的旁分泌效果，如蛋白、核酸和脂質(zhì)等，MSCs也可借助自身分泌釋放胞外囊泡或細(xì)胞因子調(diào)控炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。我們的研究發(fā)現(xiàn)MSCs可以減輕腎IRI[18]。劉必成等[19]報(bào)道人MSCs分泌出富含miR-125b-5p囊泡可優(yōu)先靶向受損的TECs并抑制P53蛋白表達(dá)，從而緩解細(xì)胞周期阻滯和凋亡。另外，可向腎譜系分化并形成體外三維腎小管結(jié)構(gòu)的胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）、成人腎干細(xì)胞也可作為理想的治療候選細(xì)胞[20-22]。

AKI期間釋放的損傷相關(guān)分子模式和病原體相關(guān)分子可以激活免疫系統(tǒng)，傳導(dǎo)下游效應(yīng)，如產(chǎn)生促炎/趨化因子，NK細(xì)胞/巨噬細(xì)胞等活化，遞呈抗原引發(fā)排斥反應(yīng)。因此，靶向免疫分子及細(xì)胞也是減輕AKI的策略之一。研究表明免疫負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞（MDSCs和Tregs）也參與調(diào)節(jié)AKI。YAN等[23]研究發(fā)現(xiàn)G-CSF通過(guò)誘導(dǎo)MDSCs減輕腎缺血再灌注損傷。Foxp3+Tregs細(xì)胞參與缺血性急性腎損傷的修復(fù)[24]。此外，MSCs與免疫細(xì)胞的交互作用在抑炎和保護(hù)AKI中起到重要作用。單核細(xì)胞樣髓系來(lái)源的抑制性細(xì)胞（monocyte like myeloid-derived suppressor cells,M-MDSCs）來(lái)源的IL-15可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的MSCs向肌成纖維細(xì)胞分化，這種作用是通過(guò)Ras-ERK1/2-Smad2/3信號(hào)通路介導(dǎo)的[25]。SONG等[26]報(bào)道MSCs經(jīng)過(guò)IL-1β預(yù)處理，通過(guò)調(diào)節(jié)miR-146a誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2表型（M2表型為選擇性活化的巨噬細(xì)胞，具有抗炎作用）分化，強(qiáng)化了免疫調(diào)節(jié)功能，更好地對(duì)急性腎損傷起保護(hù)作用。我們發(fā)現(xiàn)MSCs通過(guò)分泌SOS蛋白（一種鳥(niǎo)苷酸交換因子）可以促進(jìn)Tregs分化、趨化和免疫抑制功能增強(qiáng)—賦能調(diào)控免疫微環(huán)境（未發(fā)表）。TAN等報(bào)道自體MSCs通過(guò)抑制T細(xì)胞增殖和單核細(xì)胞分化，并調(diào)節(jié)NK細(xì)胞和B細(xì)胞功能發(fā)揮免疫抑制的作用，應(yīng)用于活體供腎移植，與抗IL-2受體抗體誘導(dǎo)相比，可降低急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率，同時(shí)降低機(jī)會(huì)性感染的風(fēng)險(xiǎn)[27]。

由此可見(jiàn)，干細(xì)胞（MSCs、ESCs、iPSCs）及其衍生物、MDSCs、Tregs在抑制炎癥反應(yīng)，減輕急性腎損傷中都發(fā)揮了重要作用。不同類(lèi)型細(xì)胞的交互影響（協(xié)同或拮抗）也為細(xì)胞治療在腎移植中的臨床應(yīng)用提供了新的可能。

2 抗排斥反應(yīng)，誘導(dǎo)免疫耐受 同種異體免疫排斥是腎移植后的一個(gè)重要并發(fā)癥，可由T細(xì)胞或抗體介導(dǎo)。細(xì)胞免疫排斥反應(yīng)以T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)為主，體液免疫排斥反應(yīng)涉及MHC分子識(shí)別和補(bǔ)體系統(tǒng)激活。通過(guò)輸注免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)患者體內(nèi)免疫微環(huán)境，控制和降低移植器官損傷引發(fā)的固有免疫反應(yīng)和供受體刺激誘導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答，可以提高移植器官的存活率。目前已證實(shí)Tregs、MDSCs和HSCs在抗腎移植排斥反應(yīng)、誘導(dǎo)免疫耐受中發(fā)揮了一定的作用。

Tregs被認(rèn)為是免疫耐受的核心，也是器官移植免疫耐受形成的原因和標(biāo)志。CD4+CD25+Foxp3+Tregs是Tregs中最重要功能性亞群，F(xiàn)oxp3表達(dá)和功能穩(wěn)定可幫助Tregs產(chǎn)生抗炎性細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cells，APCs）功能、消耗生長(zhǎng)因子、破壞代謝途徑和誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡[28-29]。供者抗原或者受者APCs可驅(qū)動(dòng)預(yù)存體內(nèi)的Tregs擴(kuò)增，但數(shù)量較少，不足以抗衡誘導(dǎo)移植排斥反應(yīng)的免疫細(xì)胞[30]，因此需要輸注外源性Tregs或移植前輸注同種抗原，以擴(kuò)增或誘導(dǎo)特異性Tregs，將受體的免疫系統(tǒng)轉(zhuǎn)向接受同種異體移植。一項(xiàng)天然調(diào)節(jié)性Tregs細(xì)胞（nTregs）應(yīng)用于腎移植受者的Ⅰ/Ⅱa期臨床試驗(yàn)顯示，治療組的患者中有8例（8/11，73%）T細(xì)胞活化被抑制，實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定的單藥免疫抑制治療，而對(duì)照組仍接受標(biāo)準(zhǔn)的雙聯(lián)或三聯(lián)免疫抑制藥物[31]。另一項(xiàng)研究顯示，給腎移植小鼠輸注人工誘導(dǎo)的CD4+CD25+Tregs細(xì)胞（iTregs）降低了循環(huán)供體特異性抗體的水平和移植物內(nèi)抗體沉積，減少了CD4+T細(xì)胞、CD8+IFN-γ+細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞和M1表型巨噬細(xì)胞（經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞，具有促炎作用）在炎性部位的浸潤(rùn)[32]。

Tregs的體外編輯與回輸是誘導(dǎo)腎移植免疫耐受很具有吸引力的新研究方向。仿照CAR-T細(xì)胞治療思路，擴(kuò)增經(jīng)過(guò)基因工程改造以表達(dá)識(shí)別標(biāo)靶抗原的合成受體（CAR）的多克隆Tregs，如HLA-A2 CAR，已被應(yīng)用于臨床試驗(yàn)[33]。HLA-A2是大多數(shù)種族尤其是亞洲人共有的主要組織相容性抗原，A2-CARTregs能特異性抑制HLA-A2抗原激活，而不會(huì)引發(fā)相關(guān)細(xì)胞因子激活，對(duì)異種皮膚移植的效果明顯好于多克隆Tregs[33]。另外，通過(guò)A2-CAR激活修飾nTregs導(dǎo)致其信號(hào)傳導(dǎo)、增殖和免疫抑制功能增強(qiáng)，但細(xì)胞表型和表觀(guān)遺傳學(xué)的穩(wěn)定性不受影響[34]。CAR-Tregs提高了誘導(dǎo)免疫耐受的特異性，避免受者免疫抑制過(guò)低和易患腫瘤風(fēng)險(xiǎn)，已成為治療腎臟移植排斥反應(yīng)和誘導(dǎo)免疫耐受的新策略。

MDSCs是具有抗炎和免疫抑制功能的未成熟的髓樣細(xì)胞群。MDSCs在建立腎移植免疫耐受過(guò)程中的作用日漸被認(rèn)識(shí)。MDSCs免疫抑制機(jī)制多樣[35-37]：可抑制T細(xì)胞、B細(xì)胞增殖，促進(jìn)T細(xì)胞凋亡；通過(guò)TGF-β和IFN-γ使NK細(xì)胞數(shù)量減少，功能失活；上調(diào)血紅素氧合酶1的表達(dá)，抑制樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）成熟，促進(jìn)IL-10生成并具有細(xì)胞保護(hù)作用；通過(guò)細(xì)胞間作用（CD40/CD40L）和細(xì)胞因子（IL-10，TGF-β及IFN-γ）調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞，誘導(dǎo)Tregs生成。有文獻(xiàn)報(bào)道，相比單次大量回輸MDSCs，少量多次輸注更利于免疫抑制作用的發(fā)揮[38]。在腎臟移植模型中，MDSCs抑制效應(yīng)T細(xì)胞的增殖，并以接觸依賴(lài)的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，不影響Treg功能[39]。而在臨床研究方面，LUAN等[40]研究發(fā)現(xiàn)腎移植受者體內(nèi)CD11b+CD33+HLA-DR-MDSCs增多，并且MDSCs累積與Tregs的增加呈線(xiàn)性相關(guān)。

循環(huán)單核細(xì)胞HLA-DR密度被用作腎移植過(guò)繼細(xì)胞療法（adoptive cell therapy，ACT）試驗(yàn)中的安全標(biāo)志物，接受潑尼松龍治療的腎移植受者HLA-DR密度降低，與單核細(xì)胞源性MDSCs的積聚有關(guān)，依據(jù)隨訪(fǎng)結(jié)果，受者HLA-DR密度過(guò)低，患惡性腫瘤幾率高[41]。另外，腎移植受者患皮膚鱗狀細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)上升也與MDSCs數(shù)量增加有關(guān)[42]。說(shuō)明MDSCs不僅與移植耐受有關(guān)，而且與腫瘤免疫監(jiān)測(cè)有關(guān)。未來(lái)需要更多研究來(lái)評(píng)估腎移植受者M(jìn)DSCs水平升高的預(yù)后價(jià)值和臨床意義。

HSCs是誘導(dǎo)腎臟移植免疫耐受較早得到臨床驗(yàn)證的細(xì)胞之一。我們?cè)缭?009年就開(kāi)展了供者HSCs輸注聯(lián)合腎移植的國(guó)際注冊(cè)臨床研究（注冊(cè)號(hào)：ChiCTR-TNC-09000399），發(fā)現(xiàn)患者術(shù)后Tregs比例增加，出現(xiàn)一過(guò)性嵌合體并減少了免疫抑制劑的用量，表明成功誘導(dǎo)了部分免疫耐受。目前已發(fā)現(xiàn)HSCs可通過(guò)供者反應(yīng)性克隆清除、共刺激信號(hào)阻斷、誘導(dǎo)嵌合體[43]、促進(jìn)調(diào)節(jié)細(xì)胞分化[44]等機(jī)制誘導(dǎo)供者特異性免疫耐受。西北大學(xué)LEVENTHAL團(tuán)隊(duì)對(duì)8名HLA不相合腎病患者進(jìn)行腎移植聯(lián)合HSCs輸注，移植術(shù)前注射氟達(dá)拉濱（days-4，-3，和-2）和200-cGy全身照射（days-1）以清除受體免疫系統(tǒng)，術(shù)后第一天輸注CD34+供者HSCs，同時(shí)輸注輔助細(xì)胞取得了更好的誘導(dǎo)免疫耐受效果，5名受試者體內(nèi)產(chǎn)生了長(zhǎng)期的嵌合體并完全撤除了免疫抑制劑[45]。由此可見(jiàn)，在移植受者體內(nèi)建立持久的高濃度供體嵌合體對(duì)HSCs發(fā)揮功能性的免疫抑制作用有重要意義。

3 減輕纖維化 腎移植引發(fā)的氧化炎性損傷和細(xì)胞/抗體介導(dǎo)免疫排斥反應(yīng)，最終導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮。腎纖維化是所有慢性腎?。╟hronic kidney disease，CKD）包括移植腎失功的共同結(jié)局。研究表明MSCs與腎纖維化關(guān)系密切。不同來(lái)源的MSCs（脂肪來(lái)源MSCS、骨髓來(lái)源MSCs、胚胎干細(xì)胞）對(duì)腎纖維化都有一定的修復(fù)作用[46-49]。MSCs的治療劑型和是否與其他藥物聯(lián)合使用影響腎纖維化的治療效果。與未治療組和靜脈注射MSCs組相比，細(xì)胞片劑的MSCs存活率更高，分泌HGF和VEGF更持久，顯著抑制腎功能障礙、微血管損傷和纖維化[50]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs）聯(lián)合低劑量FK506可以改善免疫抑制功能,有效減少移植腎的慢性退行性改變和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑對(duì)移植腎結(jié)構(gòu)的毒性作用[51]。此外，腎損傷后炎癥微環(huán)境的MSCs（內(nèi)源性MSCs）發(fā)生活化，通過(guò)旁分泌和賦能方式，并根據(jù)組織炎癥強(qiáng)度直接調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。本課題組在IRI誘導(dǎo)的腎纖維化組織中發(fā)現(xiàn)，腎組織駐留MSCs向肌成纖維細(xì)胞分化的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象可被M-MDSCs通過(guò)Ras-Erk1/2-Smad2/3信號(hào)通路抑制[25]?；谕庠葱訫SCs來(lái)源廣、獲取方便、免疫原性低、不良反應(yīng)低等優(yōu)點(diǎn)而受到重視，外源性MSCs的輸注或靶向遞送基因或分子可達(dá)到修復(fù)損傷組織的目的。而如何調(diào)控炎癥微環(huán)境的MSCs，避免過(guò)度纖維化是修復(fù)腎組織結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵。

最近，免疫細(xì)胞在腎纖維化中的治療效果也得到了證實(shí)。QIU等在單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）誘導(dǎo)的小鼠腎纖維化模型中發(fā)現(xiàn)過(guò)繼轉(zhuǎn)移MDSCs或GM-CSF預(yù)處理可有效改善細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積,有效延緩腎小管間質(zhì)纖維化，促進(jìn)腎臟Tregs浸潤(rùn)，同時(shí)下調(diào)Th1細(xì)胞（一種輔助性T淋巴細(xì)胞）[52]。從腎損傷、再生到纖維化，免疫反應(yīng)變化錯(cuò)綜復(fù)雜，不同免疫細(xì)胞在腎損傷后的急慢性發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著不同作用。早期Tregs擴(kuò)增不僅保護(hù)腎臟免受初始損傷，還可防止晚期腎纖維化的發(fā)展。同時(shí)，Tregs細(xì)胞可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型和功能，以控制炎癥和促進(jìn)修復(fù)。不同MDSCs亞型的免疫抑制調(diào)控機(jī)制有所差異。MDSCs，尤其是粒細(xì)胞樣髓系來(lái)源的抑制性細(xì)胞（granulocyte like myeloid-derived suppressor cells,G-MDSCs），在慢性腎臟炎癥和纖維化期間積聚在腎臟中，通過(guò)控制效應(yīng)T細(xì)胞、DC和巨噬細(xì)胞的過(guò)度擴(kuò)增，抑制腎臟炎癥和纖維化?；诖?，確定腎損傷后急慢性階段的Tregs和MDSCs異質(zhì)性，利于提供有針對(duì)性的腎纖維化細(xì)胞治療策略。

4 展望 現(xiàn)階段，細(xì)胞治療在腎移植中的應(yīng)用場(chǎng)景主要集中在以下3個(gè)方面：（1）抑制炎癥反應(yīng)，減輕急性腎損傷；（2）抗排斥反應(yīng)，誘導(dǎo)免疫耐受；（3）減輕纖維化。細(xì)胞治療的臨床療效存在較大的個(gè)體化差異，原因可能與多種因素有關(guān)，包括患者臨床狀況及細(xì)胞治療時(shí)間點(diǎn)、治療細(xì)胞的來(lái)源和劑量、擴(kuò)增和改造，細(xì)胞產(chǎn)品半衰期和體內(nèi)動(dòng)力學(xué)等。考慮到當(dāng)前細(xì)胞治療在器官移植臨床應(yīng)用過(guò)程中的切實(shí)問(wèn)題和移植免疫學(xué)的發(fā)展，我們展望未來(lái)細(xì)胞治療在器官移植中的應(yīng)用將在以下幾個(gè)方面有所偏重與突破：（1）進(jìn)一步深入研究并明確不同細(xì)胞治療調(diào)節(jié)器官移植免疫平衡的機(jī)制；（2）明確器官移植前后細(xì)胞治療時(shí)機(jī)、給藥方式；（3）提供穩(wěn)定、安全和有效的細(xì)胞產(chǎn)品，降低移植受者感染和患癌風(fēng)險(xiǎn)；（4）建立統(tǒng)一嚴(yán)苛的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品品質(zhì)的一致性，包括規(guī)范生產(chǎn)工藝、提高技術(shù)/研究人員操作熟練程度、加強(qiáng)微生物檢測(cè)。同時(shí)，個(gè)體化治療是細(xì)胞療法取得更好治療效果的必由之路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突