基于味覺信息與主要化學(xué)成分的不同來源貝母藥材的比較研究

王曉蓉，方清茂，王洪蘇，羅 冰，吳 萍，王曉宇*

(1.康定恩威高原藥材野生撫育基地有限責(zé)任公司，四川康定 626002；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川成都 610041)

貝母始載《神農(nóng)本草經(jīng)》，其中川貝母是最具地域代表性，且是以“潤肺”著稱的貝母類藥材之一[1-4]。歷代本草及醫(yī)家認為“川貝母，味甘，潤，能潤肺止咳”[2]，表明“甘味”是川貝母味覺特征之一。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)貝母化學(xué)成分復(fù)雜，不同貝母及不同基原的川貝母均無共同結(jié)構(gòu)的生物堿類成分[1-2]。據(jù)報道，貝母清熱止咳的功效可能與苦味化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)有關(guān)；而川貝母的潤肺作用可能與甘味的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)相關(guān)[5-6]。感官智能分析技術(shù)利用現(xiàn)代信息技術(shù)模仿人的感覺行為，自動獲取檢測對象的感官信息，具有操作簡單、快速、高效等特點。因多數(shù)中藥具有特定的形、色、氣、味，且性狀特征與內(nèi)在化學(xué)成分、基原、產(chǎn)地及采收期等相關(guān)[7-9]。因此，該研究將電子舌分析技術(shù)引入貝母的品質(zhì)評價中，采用紫外-可見分光光度法對貝母中的總多糖、總生物堿含量進行測定，通過比較川貝母與其他貝母的味覺信息值和主要化學(xué)成分的差異，為川貝母藥材的道地性及味覺特征性提供一定的研究基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器SA402B 系列智能味覺分析系統(tǒng)(日本INSENT公司)；CM-5分光測色計(柯尼卡美能達中國投資有限公司)；UV-1800 型紫外可見分光光度計(日本島津科學(xué)儀器有限公司)；電子分析天平(十萬分之一，XS205型，瑞士Mettler Toledo股份有限公司)；KQ2200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DHG-9240型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；電子分析天平(萬分之一，BSA224S型，德國Sartouris股份有限公司)；離心機(LXJ-Ⅱ B型，上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 試藥與試劑西貝母堿對照品(98.00%，批號MUST-18071404)、無水葡萄糖對照品(99.85%，批號MUST-17012905)、貝母素乙對照品(99.88%，批號MUST-18052501)，均購自成都曼斯特生物制品有限公司。色譜純乙腈、色譜純甲醇，TEDIA公司產(chǎn)品；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.3 樣品信息川貝母藥材收集自四川省川貝母道地產(chǎn)區(qū)紅原、松潘、康定等地，浙貝母、伊貝母、平貝母藥材購自成都荷花池藥材市場，經(jīng)四川省中醫(yī)藥科學(xué)院方清茂研究員鑒定分別為川貝母FritillariacirrhosaD.Don、暗紫貝母FritillariaunibracteataHsiao et K.C.Hsia、瓦布貝母FritillariaunibracteataHsiao et K.C.Hsia var.wabuensis(S.Y.Tang et S.C.Yue)Z.D.Liu，S.Wang et S.C.chen、浙貝母FritillariathunbergiiMiq.、伊貝母FritillariapallidifloraSchrenk、平貝母FritillariaussuriensisMaxim.，具體信息見表1。

表1 不同來源貝母樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 生物堿含量測定方法的建立

2.1.1對照品溶液的制備。取西貝母堿對照品適量，精密稱定，加三氯甲烷制成0.2 mg/mL的溶液，即得。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密量取對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、1.0 mL，置25 mL具塞試管中，分別補加三氯甲烷至10.0 mL，精密加水5 mL，再精密加0.05%溴甲酚綠緩沖液(取溴甲酚綠0.05 g，用0.2 mol/L氫氧化鈉溶液6 mL使溶解，加磷酸二氫鉀1 g，加水使溶解并稀釋至100 mL，即得)2 mL，密塞，劇烈振搖1 min，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，放置30 min。取三氯甲烷液，用干燥濾紙濾過，取續(xù)濾液，以相應(yīng)的試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法，在415 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.3供試品溶液的制備。取本品粉末(過3號篩)約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加濃氨試液3 mL，浸潤1 h，加三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液40 mL，置80 ℃水浴加熱回流2 h，放冷，濾過濾液置50 mL容量瓶中，用適量三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液洗滌藥渣2～3次，洗液并入同一容量瓶中，加三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液至刻度，搖勻備用。

2.1.4測定方法。精密量取5.0 mL，置25 mL具塞試管中，水浴上蒸干，精密加入三氯甲烷10 mL 使溶解，按照“2.1.2”方法，自“精密加水5 mL”起，依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中西貝母堿的重量(mg)計算，即得。本品按干燥品計算，含總生物堿以西貝母堿(C27H43NO3)計，不得少于0.050%。

2.1.5精密度試驗。取同一對照品溶液，按“2.1.2”方法，自“精密加水5 mL”起，依法測定吸光度，連續(xù)測定5次，記錄吸光度，RSD分別為0.96%、0.91%、0.97%、1.20%、1.31%，表明儀器精密度良好。

2.1.6重復(fù)性試驗。取同一川貝母樣品2 g，平行取5份，精密稱定，按照“2.1.3”方法制備供試品溶液，按“2.1.2”方法，自“精密加水5 mL”起，依法測定吸光度，RSD分別為1.07%、1.11%、1.01%、0.92%、0.89%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7穩(wěn)定性試驗。取同一批川貝母供試品溶液，按“2.1.2”方法，自“精密加水5 mL”起，依法測定吸光度，分別于0、2、4、6、12 h測定，記錄各時間段的吸光度，RSD分別為0.89%、1.24%、1.13%、0.97%、1.08%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8加樣回收率試驗。精密稱取已知總生物堿含量的川貝母供試品粉末約1.0 g，精密稱定6份，加入對照品儲備液適量，按“2.1.3”方法制備供試品溶液，按“2.1.2”方法，自“精密加水5 mL”起，依法測定吸光度，計算得到西貝母堿的平均加樣回收率分別為99.31%、100.77%、99.81%、101.34%、100.57%、99.92%，RSD分別為0.98%、1.56%、1.98%、0.88%、2.32%、0.91%，表明該方法加樣回收率良好。

2.1.9樣品測定及結(jié)果。取貝母樣品粉末，平行2份，按“2.1.3”方法制備供試品溶液，按“2.1.2”方法，自“精密加水5 mL”起，依法測定吸光度，計算樣品含量。測定結(jié)果見表2。由表1～2可知，不同基原的川貝母均含有生物堿，且均能達到藥典規(guī)定[3]；其中栽培5年的瓦布貝母(編號3)含量最高，與文獻報道一致[10-11]。暗紫貝母(編號1、2、5、6、7、13)的生物堿含量較低，同時暗紫貝母栽培品(編號5～7)的生物堿含量均大于野生品(編號1、2、13)，分析可能與生長年限、施用肥料等有關(guān)。隨著生長年限的增加，生物堿含量有逐步遞增的趨勢。

表2 不同來源貝母樣品總生物堿和總多糖的含量測定結(jié)果(n=2)

2.2 多糖含量測定方法的建立

2.2.1對照品溶液的制備。取無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加超純水制成0.4 mg/mL的溶液，即得。

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密量取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL置25 mL具塞試管中，分別補加超純水至2.0 mL，再精密加入6%苯酚水溶液1.0 mL，再迅速加入濃硫酸5.0 mL，混勻后迅速在冰水浴中冷卻，以相應(yīng)的試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法，在490 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.3供試品溶液的制備。取本品粉末(過3號篩)約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加石油醚(60～90 ℃)30 mL，回流提取3次，每次1 h，保留濾渣，揮干溶劑；加入80%乙醇溶液30 mL，回流提取2 h，保留濾渣，揮干溶劑；再加入超純水100 mL，回流提取2 h，趁熱濾過，取濾液5 mL，置50 mL容量瓶中，加超純水至刻度，搖勻備用。

2.2.4測定方法。精密量取供試品溶液1.0 mL，置25 mL具塞試管中，分別補加超純水至2.0 mL，以相應(yīng)的試劑為空白，按照“2.2.2”方法，依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中葡萄糖的重量(mg)計算，即得。

2.2.5精密度試驗。取同一對照品溶液，按“2.2.2”方法，依法測定吸光度，連續(xù)測定5次，記錄吸光度，RSD分別為0.89%、0.94%、0.99%、1.21%、1.35%，表明儀器精密度良好。

2.2.6重復(fù)性試驗。取同一川貝母樣品2 g，平行取5份，精密稱定，按照“2.2.3”方法制備供試品溶液，按“2.2.2”方法，依法測定吸光度，RSD分別為0.99%、1.03%、0.95%、1.12%、0.98%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7穩(wěn)定性試驗。取同一批川貝母供試品溶液，按“2.2.2”方法，依法測定吸光度，分別于0、2、4、6、12 h測定，記錄各時間段的吸光度，RSD分別為0.89%、1.29%、1.40%、0.96%、0.94%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8加樣回收率試驗。精密稱取已知總多糖含量的川貝母供試品粉末約1.0 g，精密稱定6份，加入對照品儲備液適量，按“2.2.3”方法制備供試品溶液，按“2.2.2”方法，依法測定吸光度，計算得到葡萄糖的平均加樣回收率分別為99.45%、100.32%、99.89%、101.22%、100.57%、100.80%，RSD分別為0.97%、1.37%、1.93%、0.91%、2.50%、0.92%，表明該方法加樣回收率良好。

2.2.9樣品測定及結(jié)果。取貝母樣品粉末，平行2份，按“2.2.3”方法制備供試品溶液，按“2.2.2”方法，依法測定吸光度，計算樣品含量。測定結(jié)果見表2。由表2可知，除浙貝母(編號9)外，不同來源的貝母多糖含量均較高，與文獻一致[12-13]；且川貝母的多糖含量整體大于浙貝母。

2.3 不同來源貝母中多糖與生物堿比值分析由表2可知，貝母多糖與生物堿含量比值的差異明顯，野生川貝母(編號1、2、11、12、13)的多糖與生物堿含量比值均較高，在30左右，而栽培品的比值均較小；浙貝母(編號9)的多糖與生物堿含量比值最低，為5.32。表明多糖與生物堿含量比值能夠有效區(qū)分不同產(chǎn)地、不同基原的貝母藥材。

2.4 貝母粉末水提液的味覺信息值測定方法

2.4.1電子舌參比液的制備。精密稱定2.236 5 g氯化鉀和0.045 0 g酒石酸用500 mL蒸餾水溶解，然后轉(zhuǎn)移到1 000 mL容量瓶，定容。

2.4.2供試品溶液的制備。取貝母樣品粉末(過4號篩)約2.0 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，精密加入蒸餾水100 mL，稱定重量，加熱回流提取1 h，放冷，補足減失重量，搖勻，4 000 r/min離心10 min，取上清液作為供試品溶液。

2.4.3電子舌測試方法。在清洗液中清洗90 s，接著用參比液清洗2次，傳感器在平衡位置歸零30 s，達到平衡條件后，開始測試，測試時間30 s；在2組參比液中分別短暫清洗3 s，傳感器插入新的參比液中測試回味30 s，循環(huán)測試4次，去掉第一循環(huán)，取后3次平均數(shù)據(jù)作為測試結(jié)果。

2.4.4不同來源貝母藥材味覺信息值測定結(jié)果。采用電子舌技術(shù)對不同來源的貝母藥材味道進行數(shù)字定量化測定，收集3次平行測試數(shù)據(jù)，求得平均值，結(jié)果見表3。

表3 不同來源貝母味覺信息值測定結(jié)果(n=3)

由圖1可知，不同來源貝母的整體味覺信息值存在差異，但差異不顯著。樣品間差異主要體現(xiàn)在酸味、鮮味和咸味上；最顯著的是酸味，其中浙貝母(編號9)的酸味值最高(-20.63)，川貝母(瓦布貝母，即編號3)的酸味值最低(-35.08)；其次是鮮味，浙貝母的鮮味值最低(5.27)，而川貝母(瓦布貝母)較高(10.91)，其中川貝母栽培品(編號3～7)的鮮味值大于野生品(編號11～13)。浙貝母的味覺信息值與其他來源貝母的差異較大，其酸味值(-20.63)、澀味回味值(-0.04)均最高，苦味值(9.70)、鮮味值(5.27)和甜味值均最低(13.54)。

圖1 13種不同來源貝母的味覺信息值雷達圖Fig.1 Radar chart of taste information values of Fritillaria ussuriensis from different sources

由圖2可知，川貝母藥材(暗紫貝母)的味覺信息野生品與栽培品存在一定差異。野生品酸味較強，咸味較弱；而栽培品呈與之相反的趨勢。

圖2 川貝母(暗紫貝母)野生品與栽培品的味覺信息值比較Fig.2 Comparison of taste information values between wild and cultivated Fritillaria cirrhosa(Fritillaria unibracteata)

由圖3～4可知，不同產(chǎn)地貝母的味覺信息值在酸味值上差異明顯，其中川貝母與浙貝母的味覺差異較顯著，尤其體現(xiàn)在酸味、咸味及鮮味上；川貝母不同基原間的味覺信息值差異最顯著的是酸味，其次是咸味。

圖3 不同產(chǎn)地貝母的味-覺信息值比較Fig.3 Comparison of taste information values of Fritillaria ussuriensis from different habitats

圖4 川貝母不同基原的味覺信息值比較Fig.4 Comparison of taste information values of different primitives of Fritillaria ussuriensis

3 小結(jié)

歷來貝母藥材的基原眾多，產(chǎn)地復(fù)雜，且價格高，尤以川貝母混偽品較多[8-9]。傳統(tǒng)各類貝母均以粒小、均勻、完整、質(zhì)堅實、色純白、具有光澤者為佳，三大類川貝母優(yōu)劣順序為松貝、青貝、爐貝[14]。因此，有效鑒別川貝母與其他貝母的研究急需進一步深入。

通過研究表明，電子舌測得的味覺信息值可用于區(qū)分不同產(chǎn)地的貝母藥材以及不同基原的川貝母藥材；在主要化學(xué)成分上，可通過總多糖含量、多糖/生物堿含量的比值區(qū)分浙貝母與其他產(chǎn)地貝母藥材。

人工栽培對川貝母藥材的品質(zhì)有一定影響。暗紫貝母野生品的生物堿含量較低，栽培品的含量有所升高；且野生品與栽培品的味覺信息值在酸味、咸味上差異較大，推測可能與生長年限、施用農(nóng)家肥等有關(guān)。