基于高效液相色譜特征指紋圖譜法探究不同品種苜蓿中黃酮抗氧化活性的譜-效關(guān)系

關(guān)淑文 潘予琮 寇 偉 年 芳 蔣林樹*

(1.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州730070)

苜蓿(alfalfa)屬多年生草本植物，產(chǎn)量高且營養(yǎng)成分豐富，是世界上最重要的飼料之一[1]。其功能包括增強(qiáng)機(jī)體生長性能、提高奶牛泌乳性能以及增加飼料轉(zhuǎn)化率[2]。苜蓿所富含的黃酮類營養(yǎng)活性物質(zhì)(木樨草素、芹菜素、苜蓿素等)具有抗氧化功能，優(yōu)質(zhì)的苜蓿黃酮含量可達(dá)10.35 mg/g[3]。有研究表明，飼喂紫花苜蓿黃酮顯著增強(qiáng)奶牛血清抗氧化酶、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性，降低丙二醛(MDA)含量[4]。用含0.2%苜蓿黃酮的飼糧飼喂綿羊可增強(qiáng)機(jī)體利用蛋白質(zhì)能力，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝平衡，提高氮利用率，維持能量代謝和體內(nèi)鈣磷平衡，有一定促生長作用[5]。將60 mg/kg苜蓿黃酮添加到奶牛飼糧中，提高了抗氧化酶活性，調(diào)節(jié)了奶牛瘤胃微生物菌群和免疫細(xì)胞數(shù)量，非特異性細(xì)胞的免疫功能得以增強(qiáng)[6-7]。但不同品種苜蓿營養(yǎng)活性成分含量不一[8]，對奶牛生產(chǎn)性能的影響存在差異[9]。因此，確定不同來源苜蓿中黃酮的主成分具有重要意義。

2002年，李戎等[10]最早系統(tǒng)性提出中藥譜-效關(guān)系理論，利用多重統(tǒng)計(jì)分析方法闡明“圖譜”與“效果”的關(guān)系。這極大地幫助了畜牧學(xué)科挖掘天然植物發(fā)揮活性效果時的物質(zhì)基礎(chǔ)以及其內(nèi)部成分的拮抗與協(xié)同作用[11]。譜-效關(guān)系理論的基礎(chǔ)是建立指紋圖譜，最大程度地獲取天然植物中活性成分的化學(xué)信息[12]，其方法是選擇不同品種、地理位置、收獲時間的樣品或利用不同提取方法收集的樣本作為變量，通過液相色譜分析、氣相色譜分析等手段建立對應(yīng)樣本的指紋圖譜，結(jié)合動物或細(xì)胞試驗(yàn)測定植物提取物對某一生物效應(yīng)的數(shù)據(jù)，最后通過主成分分析、相關(guān)性分析和回歸分析等研究手段構(gòu)建相應(yīng)的譜-效關(guān)系，篩選出植物提取物中該生物效應(yīng)的主效因子[13]。

因此，本試驗(yàn)旨在研究從14種苜蓿中提取的黃酮在不同濃度下對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基的清除率和還原力的影響。采用高效液相色譜法(HPLC)對14種苜蓿的黃酮成分分析，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的比對，建立相應(yīng)指紋圖譜，進(jìn)行譜-效關(guān)系分析，進(jìn)而對有效成分進(jìn)行篩選，為苜蓿黃酮作為一種天然抗氧化飼料添加劑在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

14種不同來源品種苜蓿見表1。試驗(yàn)中所用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(≥99%)、苜蓿素(≥98.9%)、芹菜素(≥98.2%)、槲皮素(≥99.2%)、山奈酚(≥99.8%)、異鼠李素(≥99.3%)來自上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、色譜級甲醇、色譜級乙腈來自河北凈森寶貝化工產(chǎn)品有限公司；亞硝酸鈉(NaNO2)、硝酸鋁[Al(NO3)3]、氫氧化鈉(NaOH)、鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])、三氯乙酸鈉(C2HCl3O2)、氯化鐵(FeCl3)購自上海麥克林Macklin生化科技有限公司；DPPH和ABTS-二銨鹽購自Sigma-Aldrich?公司。試驗(yàn)中所用電子天平(ME204/02)來自梅特勒-托利多(METTLER TOLEDO)儀器有限公司，高效液相色譜儀(Waters e2695)及PDA檢測器(2998)來自美國Waters公司，超聲波清洗器(KQ-500DE)來自昆山市超聲儀器有限公司，酶標(biāo)儀(Multiskan FC)來自Thermo公司。

表1 14種不同來源品種苜蓿

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苜蓿黃酮提取

參考潘予琮[3]提取條件，采用乙醇超聲提取法，各取1 g不同品種苜蓿粉末，加入30 mL 80%的乙醇溶液，超聲提取35 min。將提取液用真空冷凍干燥器進(jìn)行濃縮干燥，成固體狀備用。將制備好的14種不同苜蓿黃酮提取物配制成濃度為4 mg/mL的溶液，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 DPPH自由基清除

分別吸取14種不同濃度的苜蓿黃酮提取物溶液加入96孔板中，每孔100 μL，再添加100 μL DPPH試劑，充分混勻，室溫下避光孵育30 min。使用酶標(biāo)儀于517 nm處測定吸光值，記為A1；同時取100 μL不同品種苜蓿黃酮提取物溶液加入100 μL 95%乙醇，以同樣方法測定吸光度，記為A2；對照組取100 μL DPPH試劑加入100 μL 95%乙醇，吸光值記為A0。重復(fù)4次上述操作。按下面的公式計(jì)算DPPH自由基清除率：

1.2.3 ABTS自由基清除

用95%乙醇稀釋ABTS工作液得到ABTS自由基儲備液。調(diào)節(jié)ABTS儲備液在734 nm波長下的吸光值為0.70±0.05。然后在96孔板中分別加入0.6 mL不同濃度的14種苜蓿黃酮提取物溶液，再吸取2.4 mL配制好的ABTS儲備液，室溫下避光孵育10 min，使用酶標(biāo)儀在734 nm處測定吸光值，記為A1；對照組吸取0.6 mL 95%乙醇加入2.4 mL ABTS儲備液，用上述方法測另一吸光值，記為A2。重復(fù)3次上述操作。按下面的公式計(jì)算ABTS自由基的清除率：

自由基清除率越大，抗氧化活性就越強(qiáng)，反之抗氧化活性越弱[18]。

1.2.4 還原力測定

取2.5 mL 1% K3[Fe(CN)6]溶液和2.5 mL濃度為0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液，調(diào)節(jié)pH至6.6，分別加入含有1 mL不同濃度的14種苜蓿黃酮提取物溶液的試管中，置于50 ℃水浴鍋中搖晃20 min至均勻，反應(yīng)充分后急速冷卻，取出。加入2.5 mL 10% C2HCl3O2溶液，振蕩混勻，置于離心機(jī)內(nèi)，在3 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min，棄去沉淀，取上清液2.5 mL移入另一試管中。加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 1% FeCl3溶液，振蕩混勻，于700 nm波長處測定各管吸光值。根據(jù)吸光度值大小可以推測不同苜蓿來源黃酮的還原力，表示為吸光值越高，苜蓿黃酮的還原力越強(qiáng)。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

分別稱取2.5 mg芹菜素、山奈酚、苜蓿素、槲皮素、異鼠李素和蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)品加入裝有色譜級甲醇的25 mL定容瓶中，在超聲下溶解。立刻取以上6種溶液各0.5 mL，置于5 mL離心管中，加入甲醇稀釋，振蕩混勻后立刻取2 mL過濾，得到濃度為20 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.6 HPLC條件

將濃度為4 mg/mL的14種不同品種苜蓿黃酮提取物溶液用于高效液相色譜儀分析。選擇Phenomenex的Luna C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相采用低濃度，乙腈(A)：0.5%磷酸溶液(B)。梯度洗脫：0～15 min，漸變至15%～20% B；15～20 min，變?yōu)?0% B；20～55 min，漸變?yōu)?0%～35% B；55～60 min，0.5%磷酸溶液逐漸由35%升至85%；60～90 min，維持在85% B。進(jìn)樣量10 μL，柱溫25 ℃，流速1.0 mL/min；在350 nm下檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

測定數(shù)據(jù)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)誤及可決系數(shù)(R2)通過Excel 2016進(jìn)行計(jì)算。采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，并結(jié)合Origin模型計(jì)算半數(shù)抑制濃度系數(shù)(IC50)并進(jìn)行單因素方差分析和標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)分析，相似度評價參考《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012)》進(jìn)行評估。

2 結(jié)果與分析

2.1 指紋圖譜的建立

2.1.1 HPLC指紋圖譜建立

將濃度為4 mg/mL的14種不同品種的苜蓿黃酮提取物溶液按上述條件進(jìn)行HPLC分析，將出峰時間和色譜峰面積記錄下來制成圖表。利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012)》評估14種苜蓿的黃酮色譜數(shù)據(jù)的相似度，時間窗寬度為0.5 min，采用中位數(shù)對照圖譜生成法，將S1設(shè)為參照圖譜，得到14種苜蓿來源的黃酮HPLC疊加圖，如圖1所示。

圖1 14種苜蓿中的黃酮HPLC疊加圖

2.1.2 相似度評價

通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》對14種苜蓿來源的黃酮相似度進(jìn)行評估。結(jié)果的數(shù)值越大，相似度越高。如表2所示，不同品種苜蓿來源黃酮相似度存在差異，范圍在0.471～0.976，除S3、S9和S13與標(biāo)準(zhǔn)品相似度較差，其他苜蓿來源黃酮相似性較高。這表明不同來源苜蓿中黃酮類活性物質(zhì)種類和含量相似。

2.1.3 共有峰指證

通過對濃度為4 mg/mL的14種苜蓿來源黃酮的色譜進(jìn)行比對，從中提取9個共有峰，如圖2所示。本實(shí)驗(yàn)室前期研究中，通過共有峰與相同濃度標(biāo)準(zhǔn)品之間的比對，指認(rèn)出峰2為芹菜素，峰3為苜蓿素，峰4為山奈酚，而峰5、峰6、峰7、峰8、峰9色譜峰分離徹底，無拖尾現(xiàn)象，保留峰面積穩(wěn)定[3]，因此選用峰8作為參照峰，通過HPLC統(tǒng)計(jì)出14種苜蓿來源的黃酮共有峰面積如表3所示。

表2 14種苜蓿來源的黃酮相似度

圖2 14種苜蓿來源的黃酮共有峰

表3 14種苜蓿來源的黃酮9個共有峰的面積

續(xù)表3樣品Samples峰1Peak 1峰2Peak 2峰3Peak 3峰4Peak 4峰5Peak 5峰6Peak 6峰7Peak 7峰8Peak 8峰9Peak 9S11147 493273 063110 81838 667121 89368 293131 615407 56956 404S12117 22420 26694 76036 570107 94182 683116 972386 03656 053S1373 43967 93675 5508 050113 09833 64574 561517 74962 282S1484 777176 34897 20728 77871 31757 12996 288267 14738 005

2.2 不同苜蓿來源的黃酮抗氧化能力

2.2.1 不同苜蓿來源的黃酮對DPPH自由基的清除率

如表4所示，將不同濃度14種苜蓿來源的黃酮清除率數(shù)據(jù)導(dǎo)入Origin 8.0軟件中，利用線性曲線擬合得到表4中的公式，其中，除S8和S32樣品為三項(xiàng)式擬合外，其他均為二項(xiàng)式擬合，且R2均在0.995～0.999，有較高的擬合度，不同品種苜蓿中的黃酮對DPPH自由基清除率影響不同，IC50從小到大依次為：S13

表4 14種苜蓿來源的黃酮清除DPPH自由基的IC50

2.2.2 不同苜蓿來源的黃酮對ABTS自由基的清除率

同2.2.1所述方法，計(jì)算得出ABTS自由基清除擬合公式如表5所示，S1、S2、S8、S10、S12樣品的清除率擬合曲線為三項(xiàng)式，其余的均為二項(xiàng)式擬合，且R2的值在0.992～0.999，ABTS自由基清除率IC50值由小到大依次為：S1

2.2.3 不同苜蓿來源的黃酮的還原力

同2.2.1所述方法，計(jì)算得出14種苜蓿中黃酮的還原力擬合公式如表6所示，均符合對數(shù)函數(shù)趨勢，且R2的值在0.961～0.989，還原力的半數(shù)最大效應(yīng)濃度系數(shù)(EC50)值由小到大依次為：S2

表5 14種苜蓿來源的黃酮清除ABTS自由基的IC50

表6 14種苜蓿來源的黃酮還原力的EC50

2.3 譜效關(guān)系分析

2.3.1 主成分分析

采用SPSS 26.0軟件，對共有峰面積以及14種苜蓿來源的黃酮對DPPH、ABTS自由基的IC50值和還原力的EC50值進(jìn)行Z標(biāo)準(zhǔn)化處理，計(jì)算得出DPPH、ABTS的IC50和還原力的EC50三者的初始特征值、提取特征值，結(jié)果如表7所示，DPPH的方差貢獻(xiàn)率為56.962%，ABTS的貢獻(xiàn)率為27.014%，還原力的貢獻(xiàn)率為16.024%，其中DPPH貢獻(xiàn)率最大，因此能更好地反映抗氧化效果。

表7 主成分分析

2.3.2 偏最小二乘法分析

首先將共有峰面積和DPPH、ABTS的IC50值和還原力的EC50值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。然后將DPPH、ABTS的IC50值和還原力的EC50值分別作為Y1、Y2、Y3，9個共有峰面積分別作為X1～X9值。最后利用SIMCA 14.1軟件計(jì)算X對Y的標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)(圖3所示)，得到回歸方程為Y1=0.589X1-0.231X2+0.183X3-0.013X4-0.396X5+1.046X6-0.315X7+0.559X8-0.902X9，峰1、峰3、峰6、峰8的回歸系數(shù)為正值，其余峰的回歸系數(shù)為負(fù)值；Y2=0.653X1+0.115X2-2.131X3+1.383X4+0.734X5-0.233X6+0.145X7+0.713X8-1.237X9，峰1、峰2、峰4、峰6、峰7的回歸系數(shù)為正值，其余峰的回歸系數(shù)均為負(fù)值；Y3=0.033X1-0.787X2+1.411X3-0.98X4-0.593X5-0.073X6+0.43X7+0.045X8+0.529X9，峰1、峰3、峰7、峰8的回歸系數(shù)為正值，其余峰的回歸系數(shù)均為負(fù)值。

圖3 自由基清除的回歸系數(shù)

2.3.3 多變量間的相關(guān)分析

將共有峰面積與DPPH、ABTS的IC50值和還原力的EC50值利用SPSS 26.0軟件進(jìn)行多變量相關(guān)分析，結(jié)果如表8所示，峰1、峰6的面積與DPPH抗氧化活性顯著相關(guān)(P<0.05)，且均為正相關(guān)；峰2的面積與還原力的活性顯著相關(guān)(P<0.05)，且為負(fù)相關(guān)。

3 討 論

通過建立黃酮類化合物特征指紋圖并結(jié)合其作用效果進(jìn)行譜-效關(guān)系分析是一個熱門應(yīng)用方法，使人們能夠更加準(zhǔn)確、快速地把握黃酮類化合物的作用。本試驗(yàn)通過高效液相色譜法測定了14種苜蓿來源的黃酮提取物，建立了不同品種苜蓿中黃酮的特征指紋圖譜。結(jié)果顯示不同苜蓿來源中黃酮之間的相似度范圍在0.471～0.976，說明不同品種之間黃酮類別存在著差異。黃酮類化合物的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)是2個通過C3鍵鏈接的苯環(huán)，不同黃酮類化合物苯環(huán)上的基團(tuán)不同，主要包括以下幾種：查爾酮類、二氫黃酮類、黃烷醇類和異黃酮類等[2]。因此，不同品種苜蓿中黃酮類物質(zhì)具有多樣性，對不同自由基的清除存在著差異。

表8 共有峰與DPPH、ABTS的IC50值和還原力的EC50值的相關(guān)性分析

本試驗(yàn)采用體外抗氧化法，測定不同品種苜蓿黃酮對DPPH、ABTS的IC50和還原力的EC50。將不同濃度苜蓿黃酮清除DPPH、ABTS的能力以及還原力通過線性擬合，計(jì)算該數(shù)值為50%時，所需苜蓿黃酮的濃度，即IC50(EC50)值，IC50(EC50)的值越小，表示該品種的苜蓿黃酮抗氧化活性越強(qiáng)，反之，表示苜蓿黃酮抗氧化活性越弱。結(jié)果顯示，苜蓿黃酮清除DPPH自由基和ABTS自由基的能力呈劑量依賴式增強(qiáng)。這與郭新穎等[14]研究結(jié)果一致，隨著苜蓿黃酮濃度的增加，DPPH自由基清除率越高。但在達(dá)到一定濃度后繼續(xù)升高苜蓿黃酮的濃度并不能進(jìn)一步加強(qiáng)其自由基清除力。本試驗(yàn)中不同苜蓿品種來源的黃酮清除自由基的IC50值不同，S13品種苜蓿的黃酮DPPH自由基清除率最高(1.12 mg/mL)，S4品種苜蓿的黃酮對DPPH清除率最低(2.149 mg/mL)；S1品種苜蓿的黃酮對ABTS自由基的清除率最高(0.309 mg/mL)，S9品種苜蓿的黃酮清除ABTS自由基的效率最低(0.759 mg/mL)；S2品種苜蓿的黃酮還原力的EC50最高(0.035 mg/mL)，S13品種苜蓿的黃酮還原力的EC50最小(0.143 mg/mL)?？党萚15]的研究表明，提取自不同品種芒果核中的多酚和黃酮類化合物清除超氧陰離子和羥基自由基的能力不同，這與本研究結(jié)果相似。由此可以看出，不同苜蓿來源的黃酮對不同氧化自由基清除能力不同，可能由于不同苜蓿來源的黃酮組成成分及含量不同所造成。這一結(jié)果為苜蓿黃酮作為抗氧化活性物在動物飼料添加劑中的篩選提供有效依據(jù)。

錢松等[16]通過體外法研究15批次地稔醇提物的抗氧化能力，采用主成分分析法，發(fā)現(xiàn)DPPH自由基清除率貢獻(xiàn)值最大。本試驗(yàn)將DPPH、ABTS的IC50值和還原力的EC50值進(jìn)行主成分分析，得出DPPH自由基清除率貢獻(xiàn)值最大(56.962%)，其次是ABTS(27.014%)，最后為還原力(16.024%)，說明DPPH自由基清除率能更好地反映14種苜蓿來源黃酮的抗氧化活性。為了進(jìn)一步探究14種苜蓿中黃酮的譜效關(guān)系，利用偏最小二乘法建立共有峰面積與DPPH、ABTS的IC50值及還原力EC50值的回歸方程。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)可知峰1、峰3(苜蓿素)、峰6、峰8對DPPH自由基清除率影響呈正相關(guān)，各成分之間通過協(xié)同作用促進(jìn)自由基的清除，其余峰均為負(fù)相關(guān)，有抑制自由基清除的作用；峰1、峰2(芹菜素)、峰4(山奈酚)、峰6、峰7對ABTS自由基清除回歸系數(shù)為正值，其余峰的回歸系數(shù)均為負(fù)值；峰1、峰4(山奈酚)、峰7、峰8與還原力的回歸系數(shù)為正值，其余峰的回歸系數(shù)均為負(fù)值。因此，這說明抗氧化活性是由多種黃酮類成分共同所決定的，而不同的成分對不同的自由基清除有不同的結(jié)果[17]。通過多變量間的相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，對在清除DPPH自由基方面，峰1和峰6表現(xiàn)出顯著正相關(guān)；在還原力方面，峰2與其表現(xiàn)出顯著負(fù)相關(guān)。這與通過偏最小二乘法分析得出結(jié)果一致，說明該分析具有可靠性。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)主要以14種苜蓿來源的黃酮為原料，通過體外法分別測定了14種苜蓿中黃酮清除DPPH、ABTS的能力和還原力，結(jié)果顯示，來自S13品種的黃酮對DPPH自由基清除力最佳，S1品種的黃酮對ABTS自由基清除力最佳，S2品種的黃酮的還原力最強(qiáng)。通過不同苜蓿來源的黃酮指紋圖譜構(gòu)建，初步確定了黃酮中具有抗氧化活性的成分，即峰1、峰3(苜蓿素)、峰6、峰8為DPPH自由基清除主效因子，峰1、峰2(芹菜素)、峰4(山奈酚)、峰6、峰7為ABTS自由基清除主效因子，峰1、峰4(山奈酚)、峰7、峰8為還原力的主效因子，為苜蓿黃酮作為一種天然抗氧化飼料添加劑在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。