寵物飼料中8種水溶性維生素同步分析方法研究

嚴(yán) 華 李 蘭 王繼彤 賈 錚 姚 婷 劉 佳徐思遠 田 靜 樊 霞*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京100081；2.北京市獸藥飼料監(jiān)測中心，北京102200)

當(dāng)前我國寵物飼料市場發(fā)展迅猛，據(jù)統(tǒng)計，僅2021年我國寵物配合飼料和寵物添加劑預(yù)混合飼料的生產(chǎn)總量就接近113萬t，與2020年相比增長17.3%[1]。維生素對于維持動物的生長發(fā)育具有重要作用，是寵物配合飼料的重要必需營養(yǎng)補充成分，也是評價寵物飼料質(zhì)量的重要指標(biāo)。然而，在現(xiàn)行有效的飼料標(biāo)準(zhǔn)體系中[2-10]，對水溶性維生素的檢測仍以單一成分為主，缺少多種目標(biāo)物同時聯(lián)檢的方法；同時，樣品基質(zhì)主要為養(yǎng)殖動物飼料或添加劑預(yù)混合飼料，但寵物飼料與養(yǎng)殖動物飼料的組成不同，因此，建立同步、準(zhǔn)確測定寵物配合飼料中的多種水溶性維生素方法，對于進一步完善飼料標(biāo)準(zhǔn)體系、合理評價寵物飼料質(zhì)量具有重要意義。

維生素B1(鹽酸硫銨或硝酸硫銨，VB1)、維生素B2(核黃素，VB2)、維生素B6(吡哆醇，VB6)、煙酸(尼克酸)和煙酰胺(尼克酰胺)、D-泛酸(遍多酸)、D-生物素、葉酸(喋酰谷氨酸)、維生素B12(氰鈷胺，VB12)、維生素C(L-抗壞血酸，VC)和膽堿等化合物的共同特征是都帶有氨基、羥基等極性基團，易溶于水，統(tǒng)稱為水溶性維生素。水溶性維生素分析方法主要包括分光光度法、微生物法、電化學(xué)法、毛細管電泳法、液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜法等，其中微生物法可用于VB2、VB6的測定，分光光度法可用于VB1、VB2和生物素的測定，但微生物法耗時長、準(zhǔn)確度低，日常檢測中已較少使用；分光光度法和電化學(xué)法難以實現(xiàn)多種維生素的同時測定[11]；毛細管電泳法的靈敏度不如液相色譜法[12]；目前多以液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜法為主。高效液相色譜(HPLC)法成本低，易于普及，可用于測定基質(zhì)相對簡單的添加劑預(yù)混合飼料(包括復(fù)合預(yù)混合飼料和維生素預(yù)混合飼料)中的水溶性維生素[13-15]。梁琳等[13]采用HPLC法同步測定維生素預(yù)混合飼料中5種B族維生素；張憬等[14]等采用沸水浴提取，在267和280 nm雙波長條件下檢測添加劑預(yù)混合飼料中6種水溶性維生素；Forghieri等[15]建立了預(yù)混合飼料中VB2、煙酰胺、D-泛酸、VB6和葉酸的同時提取方法。

配合飼料基質(zhì)復(fù)雜，特別是寵物配合飼料中常常含有較多的動物源性成分，檢測時基質(zhì)干擾嚴(yán)重，難以采用紫外檢測器實現(xiàn)多種水溶性維生素的同時測定。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)在選擇性、準(zhǔn)確性和靈敏度方面優(yōu)勢明顯，利用質(zhì)譜系統(tǒng)對目標(biāo)化合物進行選擇性離子監(jiān)測，可以較大程度上減少色譜共流出物的影響，實現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中多種水溶性維生素的同時測定。目前，該方法在食品領(lǐng)域的應(yīng)用較多，如嚴(yán)華等[16]采用超高效液相色譜-穩(wěn)定同位素稀釋法檢測嬰幼兒配方粉中10種水溶性維生素；Porter等[17]用親水相互作用色譜(HILIC)柱結(jié)合質(zhì)譜檢測器檢測蔬菜中4種水溶性維生素；El-Hawiet等[18]采用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜(UPLC-ESI-MRM/MS)法測定蜂蜜中9種水溶性維生素，但目前尚無文獻報道將該方法用于配合飼料中多種維生素的測定。

因此，本文從提取試劑、水浴溫度、水浴時間以及pH等方面，系統(tǒng)研究了寵物配合飼料中8種水溶性維生素(VB1、VB2、VB6、煙酸、煙酰胺、葉酸、D-泛酸和D-生物素)的樣品前處理方法，通過超高效液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜法對8種水溶性維生素進行檢測，并采用內(nèi)標(biāo)法定量。經(jīng)方法學(xué)驗證，該方法準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、線性范圍寬，可通過一個操作流程實現(xiàn)寵物配合飼料中8種水溶性維生素的同步檢測，提高了實驗效率，并對18個寵物配合飼料中水溶性維生素的含量進行了比較分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

SCIEX ExionLCTM超高效液相色譜儀系統(tǒng)，配備AD二元泵、AD自動進樣器、AC柱溫箱、控制器；AB SCIEX QTRAP 6500+四級桿-線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀，配備電噴霧離子源(美國AB SCIEX公司)；XMTD-7000電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)，3K15高速冷凍離心機(德國Sigma公司)，Milli-Q純水器(美國Millipore公司)，Lab 855型酸度計(德國SI Analytics公司)。

維生素標(biāo)準(zhǔn)品：VB1(純度>98%)、VB2(純度>98%)、煙酸(純度>98%)、煙酰胺(純度>98%)、VB6(純度>98%)、D-生物素(純度>99%)、D-泛酸鈣(純度>94.3%)和葉酸(>91.3%)(德國Dr. Ehrenstorfer公司)；內(nèi)標(biāo)：VB1-13C3(純度>97%)、VB2-13C415N2(純度>95%)、煙酸-D4(純度>98%)、煙酰胺-D4(純度>98%)、VB6-D3(純度>94%)、D-泛酸-13C315N(純度>97%)、D-生物素-D4(純度>95%)、葉酸-D4(純度>97%)(加拿大Toronto Research Chemical公司)；甲醇、乙腈、正己烷和乙酸銨(色譜純，美國Fisher Chemical公司)；鹽酸(HCl)、氨水及其他試劑均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；試驗用水為經(jīng)Milli-Q處理后的一級水(>18.2 MΩ)。

犬糧和貓糧樣品由國家飼料質(zhì)量檢驗檢測中心(北京)提供，具有代表性。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取10 mg(精確到0.01 mg)8種水溶性維生素標(biāo)準(zhǔn)品，分別置于10 mL棕色容量瓶中，煙酸、煙酰胺、VB6、D-泛酸鈣和D-生物素用甲醇溶解并定容至刻度；VB1用0.01 mol/L HCl溶液溶解并定容；VB2用1 mL HCl超聲溶解后，用水定容；葉酸用0.1 mol/L碳酸鈉(Na2CO3)溶液溶解并定容，分別配制成標(biāo)準(zhǔn)儲備液。準(zhǔn)確吸取適量上述維生素標(biāo)準(zhǔn)儲備液置于同一容量瓶中，用水稀釋配制成混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，濃度為10 μg/mL；再用水逐級稀釋成濃度為5、10、20、50、100、250、500、1 000及2 000 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。混合工作溶液均添加一定體積的內(nèi)標(biāo)溶液，使內(nèi)標(biāo)最終濃度為20 ng/mL。

1.2.2 樣品前處理

精密稱取1.00 g寵物配合飼料，置于50 mL具蓋離心管中，加入100 μL濃度為10 μg/mL混合內(nèi)標(biāo)溶液，再加入20 mL 1% HCl溶液，50 ℃水浴40 min，取出迅速冷卻至室溫，再用10%氨水溶液調(diào)節(jié)pH至5.5～6.5，用水定容至50 mL；靜置，沉淀后，取上清液，過0.2 μm濾膜，上機檢測。

1.2.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-AQ C18色譜柱(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)；柱溫：40 ℃；進樣量：1 μL；流動相流速：250 μL/min；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件

質(zhì)譜采用電噴霧電離源，離子源條件為：電離模式為正離子模式(ESI+)，電噴霧電壓為5 500.0 V，離子源溫度為500 ℃，氣簾氣流速為35.0 L/min，霧化氣流速為50.0 L/min，輔助氣流速為50.0 L/min；液質(zhì)聯(lián)用采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，8種水溶性維生素及內(nèi)標(biāo)的駐留時間均設(shè)為10 ms。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及圖形繪制采用SPSS 17.0進行，用Shapiro-Wilk檢驗探討各變量的正態(tài)性，符合正態(tài)分布用單因素方差分析與Duncan氏多重比較分析前處理條件對測定結(jié)果的影響，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件優(yōu)化

2.1.1 提取試劑對提取結(jié)果的影響

本試驗的前處理過程依據(jù)的原理為采用一定的提取溶劑使水溶性維生素溶出，再用氨水溶液調(diào)節(jié)pH，使溶出的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)在等電點形成沉淀。比較不同提取試劑[水、1%HCl、1%乙酸(HAc)、1%甲酸(FA)溶液]對提取結(jié)果的影響，方差分析結(jié)果表明：提取試劑對VB1、VB2和煙酸的檢測結(jié)果有顯著影響(VB1：F=12.288，P=0.002；VB2：F=10.658，P=0.004；煙酸：F=14.055，P=0.005)，對其他5種維生素的影響不顯著(煙酰胺：F=0.563，P=0.677；D-泛酸：F=0.853，P=0.503；VB6：F=0.802，P=0.527；D-生物素：F=0.580，P=0.645；葉酸：F=1.734，P=0.237)。對影響顯著的3種維生素含量進行分析(圖1)，結(jié)果表明：VB1用1%HCl提取比用水、1%HAc和1%FA提取的測定值分別高50%、22%和27%，VB2用1%HCl提取比用水提取的測定值高19%，煙酸用水和1%HCl提取的結(jié)果高于用1%HAc和1%FA，其余維生素用4種提取溶劑的提取效果差別不大。因此，選擇1%HCl作為提取劑。

圖1 不同提取試劑對提取結(jié)果的影響

2.1.2 水浴溫度對提取結(jié)果的影響

比較水浴溫度對提取結(jié)果的影響，方差分析結(jié)果表明：水浴溫度對D-泛酸和VB6檢測結(jié)果有顯著影響(D-泛酸：F=32.611，P<0.001；VB6：F=16.788，P<0.001)，對VB1、VB2、煙酸、煙酰胺和D-生物素有一定影響(VB1：F=2.911，P=0.036；VB2：F=6.849，P=0.001；煙酸：F=6.409，P=0.001；煙酰胺：F=6.353，P=0.001；D-生物素：F=3.266，P=0.024)，對葉酸的影響不顯著(F=1.781，P=0.160)。對含量結(jié)果(圖2)分析可見，D-泛酸和VB6在溫度高于60 ℃時含量呈降低趨勢，其中D-泛酸在100 ℃條件下提取后的測定值為在50 ℃條件下提取后測定值的74%；VB2和葉酸則適合高溫提取，在100 ℃條件下提取后VB2和葉酸的測定值比常溫提取提高了16%。綜合比較，選擇水浴溫度為50 ℃。

圖2 水浴溫度對提取結(jié)果的影響

2.1.3 水浴時間對提取結(jié)果的影響

進一步比較水浴時間的影響，方差分析結(jié)果表明：水浴時間對各維生素的影響均比較顯著(VB1：F=7.702，P=0.001；VB2：F=14.677，P<0.001；煙酸：F=105.880，P<0.001；煙酰胺：F=52.924，P<0.001；D-泛酸：F=121.362，P<0.001；VB6：F=16.001，P<0.001；D-生物素：F=17.948，P<0.001；葉酸：F=16.123，P<0.001)。對含量結(jié)果(圖3)分析可見，VB1和D-泛酸在40 min以內(nèi)，測定值比較穩(wěn)定，水浴時間超過40 min后，測定值有減小趨勢；煙酸和煙酰胺隨時間延長有減小趨勢；VB2、D-生物素和葉酸則隨水浴時間延長有增長趨勢，VB2從10～40 min，測定值提高了20%，隨后趨于穩(wěn)定。綜合比較，選擇水浴時間為40 min。

2.1.4 pH對提取結(jié)果的影響

比較pH從3.5～7.5對提取結(jié)果的影響，方差結(jié)果表明：pH對VB1、VB2和葉酸的檢測結(jié)果有顯著影響(VB1：F=3.287，P=0.023；VB2：F=3.076，P=0.030；葉酸：F=17.775，P<0.001)，對其他5種維生素的影響不顯著(煙酸：F=0.538，P=0.794；煙酰胺：F=0.676，P=0.690；D-泛酸：F=1.472，P=0.246；VB6：F=1.042，P=0.441；D-生物素：F=1.545，P=0.222)。對含量結(jié)果(圖4)分析可見，葉酸在pH為3.5和4.0時測定值較低，當(dāng)pH>5.0時，葉酸的檢測結(jié)果趨于穩(wěn)定；pH為5.0～7.0時，VB1和VB2的測定結(jié)果差異性不大，且在此pH范圍內(nèi)，試樣溶液沉淀速度快，因此選擇pH 6.0為最佳條件。

圖3 水浴時間對結(jié)果的影響

圖4 pH對提取結(jié)果的影響

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用電噴霧離子源，在正離子電離模式下對8種水溶性維生素的母離子、子離子、碰撞能量及去簇電壓等質(zhì)譜條件進行優(yōu)化，優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 8種維生素及其內(nèi)標(biāo)MRM質(zhì)譜參數(shù)

2.3 色譜條件優(yōu)化

采用Agilent ZORBAX SB-AQ C18色譜柱，以高比例水相(95%的0.1%甲酸水溶液)為初始流動相，逐漸過渡到高比例有機相(90%的0.1%甲酸乙腈水溶液)，8種水溶性維生素及其同位素內(nèi)標(biāo)在10 min內(nèi)均得到有效保留和分離(圖5)，8種目標(biāo)化合物按出峰順序分別是VB1[相對保留時間(RT)2.33 min]、煙酰胺(RT 3.24 min)、VB6(RT 3.24 min)、煙酸(RT 3.43 min)、D-泛酸(RT 4.95 min)、葉酸(RT 6.43 min)、VB2(RT 6.58 min)和D-生物素(RT 6.71 min)。

圖5 8種維生素及其同位素內(nèi)標(biāo)的提取離子色譜圖

2.4 線性范圍與定量限

根據(jù)寵物配合飼料中各種水溶性維生素的添加量范圍(1～200 mg/kg)，確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍為5.0～2 000 ng/mL，結(jié)果表明：目標(biāo)化合物在此濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，曲線相關(guān)系數(shù)(R2)>0.995 0；以3倍和10倍基線噪音所對應(yīng)的維生素含量分別計算方法的檢出限和定量限，8種水溶性維生素的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表3。

表3 8種維生素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.5 方法準(zhǔn)確性及精密度

采用配方犬糧和配方貓糧作為基質(zhì)，在測定本底值的基礎(chǔ)上，設(shè)定VB1、VB2、煙酸、煙酰胺、D-泛酸和VB6的3個添加水平分別為10、20和30 mg/kg，D-生物素、葉酸的3個添加水平分別為1.25、2.50和3.75 mg/kg，每個水平重復(fù)6次，計算添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，評價方法準(zhǔn)確性及精密度，結(jié)果見表4和表5。由表可知，配方犬糧加標(biāo)回收率為80.0%～117.3%，RSD(n=6)為1.04%～5.28%；配方貓糧加標(biāo)回收率為81.0%～112.2%，RSD(n=6)為1.06%～10.2%。試驗結(jié)果表明，8種水溶性維生素的添加回收率高，相對偏差小，說明本方法準(zhǔn)確度高、精密度良好。

表4 犬糧中8種維生素的回收率和精密度

表5 貓糧中8種維生素的回收率和精密度

續(xù)表5維生素Vitamins本底值Background values/(mg/kg)添加水平Supplemental levels/(mg/kg)測定值Measured values/(mg/kg)回收率Recovery/%相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD/%1023.3±1.098.5±10.14.35煙酸 Niacin13.42034.0±0.8103.0±4.22.483044.8±2.4104.7±8.15.401054.1±0.897.9±8.21.51煙酰胺 Niacinamide44.32063.2±0.794.6±3.41.063076.3±2.4106.6±8.13.201033.1±0.997.3±9.32.80D-泛酸 D-pantothenic acid23.42043.5±2.4100.4±12.15.563053.0±2.598.6±8.24.661023.8±1.295.3±12.22.11維生素B6 VB614.02032.6±1.992.9±9.63.053042.4±1.794.6±5.53.901.252.07±0.1583.8±11.87.16D-生物素 D-biotin1.022.503.20±0.2087.3±8.06.273.754.22±0.4385.4±11.510.201.251.99±0.1581.2±11.87.40葉酸 Folic acid0.982.503.23±0.2790.2±10.78.293.754.02±0.2281.0±5.85.38

2.6 實際樣品的測定

采用建立的方法對18份寵物配合飼料樣品進行了測定分析，結(jié)果見表6。9個貓糧樣品中VB1、VB2、煙酸、煙酰胺、D-泛酸、VB6、D-生物素和葉酸含量分別為15.0～87.4 mg/kg、6.5～62.3 mg/kg、10.6～106.0 mg/kg、9.0～145.0 mg/kg、12.0～66.4 mg/kg、5.00～32.50 mg/kg、1.51～15.20 mg/kg和1.89～7.98 mg/kg；9個犬糧樣品中VB1、VB2、煙酸、煙酰胺、D-泛酸、VB6、D-生物素和葉酸含量分別為6.6～129.0 mg/kg、5.1～44.6 mg/kg、2.3～49.9 mg/kg、9.0～122.0 mg/kg、15.3～50.3 mg/kg、1.64～27.90 mg/kg、1.57～13.80 mg/kg和0.46～7.96 mg/kg。

表6 實際樣品中水溶性維生素測定結(jié)果

續(xù)表6項目 Items編號No.維生素B1 VB1維生素B2 VB2煙酸 Niacin煙酰胺 NiacinamideD-泛酸 D-pantothenic acid維生素B6 VB6D-生物素 D-biotin葉酸 Folic acid犬糧Dog food1105.018.715.964.836.67.772.572.77269.913.331.724.033.34.543.150.4636.614.46.19.024.41.981.820.86470.444.613.4122.050.327.9013.807.96546.513.37.422.120.33.991.930.576129.011.216.342.324.13.501.681.33722.825.249.922.636.34.532.191.2686.68.911.513.421.24.222.540.57976.65.12.39.815.31.641.571.26

3 討 論

3.1 質(zhì)譜條件的選擇

8種水溶性維生素的分子結(jié)構(gòu)式見圖6。從分子結(jié)構(gòu)上可以看出，VB1、VB2、煙酸、煙酰胺、D-泛酸和VB6均帶有氨基，因此可在正離子模式下結(jié)合氫離子(H+)產(chǎn)生[M+H]+的母離子；而D-生物素和葉酸既有氨基，也有羧基，所以在正負(fù)離子模式下均可電離[16]。本研究采用正離子電離模式，通過一次進樣實現(xiàn)8種水溶性維生素的檢測。質(zhì)譜檢測器通過選擇性離子監(jiān)測模式，可有效排除色譜共流出物的干擾，從而大大提高方法的選擇性和靈敏度。從圖5可以看出，8種水溶性維生素及其同位素內(nèi)標(biāo)的提取離子色譜圖均無干擾峰。

圖6 8種水溶性維生素的分子結(jié)構(gòu)式

3.2 液相色譜條件的選擇

部分水溶性維生素在C18色譜柱上的保留能力較差，且難以與配合飼料中共同提取出的極性化合物分離，在紫外檢測器上表現(xiàn)為出峰早、雜峰多。質(zhì)譜檢測器雖然具有較好的選擇性，但仍存在共流出的干擾問題，良好的色譜分離可以提高液相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)定性和定量分析的準(zhǔn)確性。通過改變流動相組成或采用梯度洗脫的方式可增強水溶性維生素的保留，最常用的流動相為庚烷磺酸鈉-乙二胺四乙酸(EDTA)-三乙胺體系[2-3,6-7]，該體系通過離子對試劑對色譜固定相進行修飾，以提高離子間作用力，延長保留時間；采用磷酸鹽-乙腈體系[5,19]，不僅改變流動相pH，也可實現(xiàn)水溶性維生素的分離，但這2種分離體系均不適合質(zhì)譜系統(tǒng)。除了改變流動相，色譜柱的類型對維生素的分離結(jié)果影響較大[16-17,20]。梁琳等[13]比較了3種不同長度的C18色譜柱，選擇250 mm的長柱進行多組分分離；Chamseddin等[20]比較了傳統(tǒng)C18固定相、極性封端C18、醚鏈接極性封端以及環(huán)烴鍵合固定相的分離效果，發(fā)現(xiàn)極性封端C18色譜柱最適合分離維生素。本研究采用的SB-AQ C18色譜柱，其鍵合相為含極性基團的C18，側(cè)面鍵合異丙基增加烷基長鏈的空間位阻，可耐受高水相，并在不使用離子對試劑的條件下增強水溶性維生素的保留[16]。VB1、煙酰胺、煙酸和VB6這幾種化合物極性大，在傳統(tǒng)C18柱上幾乎無保留，而在SB-AQ C18柱上的保留時間分別為2.33、3.24、3.43和3.24 min，樣品的定性定量離子比與標(biāo)準(zhǔn)品的一致，說明無干擾離子共流出。

3.3 前處理條件的選擇

參照飼料中水溶性維生素的提取方法對寵物配合飼料進行前處理，所得提取溶液出現(xiàn)渾濁、乳化等現(xiàn)象，這是由于與禽畜配合飼料比較，寵物配合飼料的組成更為復(fù)雜。禽畜配合飼料組成包括豆粕、玉米等植物源性成分和飼料添加劑，寵物配合飼料除添加燕麥、大麥、糙米、豌豆、植物油等植物源性成分以及各種礦物質(zhì)和維生素添加劑外，還會添加大量雞肉、魚肉等動物源性成分，因此，寵物配合飼料提取液的基質(zhì)更為復(fù)雜。水溶性維生素的前處理方法通常采用酸解、酶解和蛋白質(zhì)沉淀等方法[21-22]，本研究采用1%HCl溶液使水溶性維生素溶出，再用氨水溶液調(diào)節(jié)pH，使蛋白質(zhì)等雜質(zhì)在等電點形成沉淀，所得提取液澄清、雜質(zhì)少，且8種水溶性維生素的回收率均在80%以上，說明該樣品前處理過程既能保證維生素的提取效率，又能達到去除雜質(zhì)的目的。

3.4 實際樣品分析

目前，我國國家標(biāo)準(zhǔn)只對維生素A、維生素D、二甲基嘧啶醇亞硫酸甲萘醌和L-肉堿進行了最高添加量的限制性規(guī)定[23]，對其他維生素的添加量沒有限制性規(guī)定。參考美國飼料管理協(xié)會(AAFCO)對寵物配合飼料中維生素的推薦添加量(成貓貓糧中VB1、VB2、煙酸、D-泛酸、VB6和葉酸的最低添加量分別為5.6、4.0、60、5.75、4.0和0.8 mg/kg，成犬犬糧中VB1、VB2、煙酸、D-泛酸、VB6和葉酸的最低添加量分別為2.25、5.2、13.6、12、1.5和0.216 mg/kg)，對結(jié)果進行分析，發(fā)現(xiàn)存在以下問題：一是不同樣品中維生素的添加量差異很大，樣品之間維生素最高值與最低值的比值相差數(shù)倍到數(shù)十倍不等，有的樣品維生素的添加量遠遠高于推薦值，如犬糧6的VB1含量是推薦值的57倍；二是少量樣品的維生素達不到推薦值，如犬糧9維生素B2和煙酸的含量低于AAFCO推薦值；三是檢測中應(yīng)關(guān)注維生素B3的2種添加形式，即煙酸和煙酰胺，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.89—2016[24]中規(guī)定了以煙酸和煙酰胺之和計算樣品中維生素B3的含量，飼料相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)則將2種化合物分別進行檢測[4,6]。本試驗所測樣品中，若只以煙酸計，有5個貓糧的含量低于60 mg/kg，5個犬糧的含量低于13.6 mg/kg，若以煙酸和煙酰胺之和計，則除犬糧9以外，其余樣品均符合要求。

4 結(jié) 論

① 以1%HCl為提取試劑，在50 ℃水浴40 min，用10%氨水調(diào)節(jié)pH至6.0使蛋白質(zhì)沉淀，可有效提取寵物配合飼料中的8種水溶性維生素。

② 提取液經(jīng)超高效液相色譜分離，正離子模式電離，質(zhì)譜MRM模式下進行檢測，同位素內(nèi)標(biāo)法定量，方法準(zhǔn)確度高，犬糧和貓糧的加標(biāo)回收率分別為80.0%～117.3%和81.0%～112.2%，RSD分別為1.05%～5.28%和1.06%～10.20%。

③ 本試驗建立的寵物配合飼料中8種水溶性維生素含量的同步檢測方法，提高了檢測效率，可為寵物飼料生產(chǎn)企業(yè)合理使用維生素及政府監(jiān)管提供技術(shù)支持。