植物乳桿菌對北京鴨脂質代謝和抗氧化功能的影響

安柯穎 高文文 李 蕾 夏兆飛

(中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京100193)

在畜禽養(yǎng)殖生產中，營養(yǎng)水平、飼養(yǎng)密度、病原、品系、免疫等因素均可導致動物出現(xiàn)應激反應，從而產生大量活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，破壞機體氧化平衡狀態(tài)，造成細胞和組織氧化損傷。因此，尋找安全有效的動物飼料添加劑來調控畜禽的健康狀態(tài)一直是研究熱點。乳酸菌(lactose acid bacterium，LAB)具有降低膽固醇、提高抗氧化功能、調節(jié)免疫等作用，而其中的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum，LP)因具有良好的益生效果以及高安全性而廣泛應用于食品、醫(yī)藥、畜牧等領域[1-3]。Li等[4]研究表明，植物乳桿菌NCU116可通過下調肝臟低密度脂蛋白膽固醇受體(low density lipoprotein cholesterol receptor，LDLR)和膽固醇7α-羥化酶(cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1)基因的表達，降低高脂血癥小鼠模型的血清膽固醇含量。另有研究表明植物乳桿菌發(fā)酵大豆提取物可通過調控過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)通路，緩解高脂飲食引起的脂質代謝異常[5]。此外，還有研究表明植物乳桿菌FC225可通過激活核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)信號通路，提高小鼠肝臟超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，降低肝臟丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量[6]。然而，當前植物乳桿菌對北京鴨益生效果的研究甚少，而對其調控脂質代謝和抗氧化功能的研究尚未見報道。因此，本試驗以北京鴨為研究對象，探究飼糧中添加植物乳桿菌對北京鴨脂質代謝和抗氧化功能的影響及其可能的分子機制，為植物乳桿菌在北京鴨生產中的應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物乳桿菌購自某生物科技有限公司，活菌數(shù)≥5×109CFU/g，菌株編號：WYRSJ1000。北京鴨購自天津禽養(yǎng)殖專業(yè)合作社。

1.2 試驗設計與飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗在中國農業(yè)大學家禽試驗基地(河北涿州)進行。將體重[(59.99±0.69) g]相近的180只1日齡北京鴨隨機分為3個組，每組6個重復，每個重復10只鴨。對照組飼喂玉米-豆粕型基礎飼糧，試驗組在基礎飼糧中分別添加400(LP1組)和800 mg/kg植物乳桿菌(LP2組)。試驗期42 d?；A飼糧參照NRC(1994)肉鴨飼養(yǎng)標準配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1，以粉料形式飼喂。試驗鴨采用網上平養(yǎng)模式，試驗第1周鴨舍溫度維持在33～35 ℃，后期逐步降至22 ℃，24 h光照，自由采食及飲水。

1.3 樣品采集與指標測定

1.3.1 腹脂率

試驗第42天，從各組中隨機挑選體重相近的試驗鴨12只，記錄其空腹體重，麻醉屠宰后取腹脂進行稱重，計算腹脂率，計算公式為：

腹脂率(%)=100×腹脂重(g)/活體重(g)。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

續(xù)表1項目Items含量 Content1～2日齡 1 to 21 days of age22～42日齡 22 to 42 days of age有效磷 AP0.290.39總磷 TP0.540.62蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.790.69

1.3.2 血脂指標

試驗第21、42天，從各組中隨機挑選體重相近的試驗鴨12只，頸靜脈采集非抗凝血5 mL，3 000 r/min、4 ℃離心15 min，分離血清，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用德國Prodia Diognostics公司試劑盒測定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量，測定儀器為日立全自動生化儀。使用南京建成生物工程研究所試劑盒(微板法)測定血清游離脂肪酸(NEFA)含量，嚴格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.3.3 肝臟脂質代謝和抗氧化功能相關基因表達

取50 mg肝臟組織加入1 mL Trizol(大連TaKaRa公司)，按照試劑盒說明書進行總RNA提取，使用NanoDrop?ND-2 000C分光光度計(Thermo fisher Scientific公司，美國)對其濃度和純度進行測定。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(大連TaKaRa公司)將RNA反轉錄為cDNA，反轉錄產物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩＿x用TB Green?Premix Ex TaqTM(大連TaKaRa公司)試劑盒并按照說明書進行采用熒光定量PCR操作，反應儀器為7500熒光檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems公司，美國)。肝臟脂質代謝相關基因包括：脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)、乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACC)、肝X受體α(liver X receptor-α，LXR-α)、過氧化物酶體增殖物激活受體-α(peroxisome proliferators-activated receptor-α，PPAR-α)、固醇調節(jié)元件結合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)、固醇調節(jié)元件結合蛋白-2(sterol regulatory element-binding protein-2，SREBP-2)、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(recombinant 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase，HMGCR)和CYP7A1，肝臟抗氧化功能相關基因包括：SOD和Nrf2。PCR擴增完成后用熔解曲線分析法確定產物特異性，所有基因以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內參，基因引物序列表見表2。計算方法參考Fu等[7]。

1.3.4 血清、肝臟和回腸抗氧化指標

采集固定位置的肝臟組織樣本，刮取回腸黏膜樣本，分別置于無RNA酶管中，并放入液氮速凍，于-80 ℃保存。分別稱取100 mg的肝臟組織樣本和回腸黏膜樣本，各加入900 μL生理鹽水進行渦旋混勻，于3 000 r/min、4 ℃離心15 min取上清備用。測定血清、肝臟和回腸抗氧化指標，使用試劑盒測定總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)(ABTS法)、過氧化氫酶(catalase，CAT)活性(鉬酸銨法)、SOD活性(WST-1法)以及MDA(TBA法)、總蛋白(total protein，TP)含量(考馬斯亮藍法)。所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，所有指標檢測均嚴格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用SPSS 26.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan氏法進行多重比較檢驗。結果以平均值±標準差表示，0.01≤P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，0.05

表2 肝臟脂質代謝和抗氧化功能相關基因引物序列

2 結 果

2.1 植物乳桿菌對北京鴨腹脂率及血脂指標的影響

由表3可知，21日齡時，各組之間血清TG、TC、HDL-C、LDL-C、NEFA含量差異不顯著(P>0.05)。

42日齡時，與對照組相比，LP1和LP2組的腹脂率分別降低了11.40%和5.03%，但差異不顯著(P>0.05)。與對照組相比，LP1和LP2組的血清TC含量極顯著降低(P<0.01)，LP1組的血清LDL-C含量有降低的趨勢(P=0.08)。各組之間血清TG、HDL-C、NEFA含量無顯著差異(P>0.05)。

2.2 植物乳桿菌對北京鴨肝臟脂質代謝相關基因表達的影響

由表4可知，21日齡時，與對照組相比，LP1和LP2組肝臟CYP7A1的mRNA相對表達量均極顯著升高(P<0.01)，LP2組肝臟LXR-α的mRNA相對表達量極顯著降低(P<0.01)，LP2組肝臟HMGCR的mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)。各組之間肝臟FAS、ACC、PPAR-α、SREBP-1c、SREBP-2的mRNA相對表達量無顯著差異(P>0.05)。

42日齡時，與對照組相比，LP1和LP2組肝臟FAS和HMGCR的mRNA相對表達量均極顯著降低(P<0.01)，LP1組肝臟SREBP-1c的mRNA相對表達量極顯著降低(P<0.01)。各組之間肝臟ACC、LXR-α、PPAR-α、SREBP-2、CYP7A1的mRNA相對表達量無顯著差異(P>0.05)。

2.3 植物乳桿菌對北京鴨血清、肝臟及回腸抗氧化指標的影響

由表5可知，21日齡時，各組之間血清T-AOC無顯著差異(P>0.05)；與對照組相比，LP1和LP2組血清CAT活性極顯著升高(P<0.01)，LP1組血清SOD活性顯著升高(P<0.05)，LP1組血清MDA含量顯著降低(P<0.05)。各組之間肝臟CAT、SOD活性和T-AOC及MDA含量均無顯著差異(P>0.05)。各組之間回腸CAT、SOD活性和T-AOC均無顯著差異(P>0.05)；與對照組相比，LP1和LP2組回腸MDA含量極顯著降低(P<0.01)。

表3 植物乳桿菌對北京鴨腹脂率及血脂指標的影響

表4 植物乳桿菌對北京鴨肝臟脂質代謝相關基因表達的影響

42日齡時，各組之間血清CAT活性、T-AOC及MDA含量均無顯著差異(P>0.05)；與對照組相比，LP2組血清SOD活性極顯著升高(P<0.01)。各組之間肝臟SOD活性和T-AOC均無顯著差異(P>0.05)；與對照組相比，LP1組肝臟CAT活性顯著升高(P<0.05)，LP1和LP2組肝臟MDA含量極顯著降低(P<0.01)。各組之間回腸CAT活性和T-AOC均無顯著差異(P>0.05)；與對照組相比，LP1和LP2組回腸SOD活性顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)，LP1組回腸MDA含量極顯著降低(P<0.01)。

表5 植物乳桿菌對北京鴨血清、肝臟及回腸抗氧化指標的影響

2.4 植物乳桿菌對北京鴨肝臟抗氧化功能相關基因表達的影響

由表6可知，21日齡時，與對照組相比，LP1和LP2組肝臟SOD的mRNA相對表達量均極顯著升高(P<0.01)，Nrf2的mRNA相對表達量無顯著差異(P>0.05)。42日齡時，各組之間肝臟SOD和Nrf2的mRNA相對表達量均無顯著差異(P>0.05)。

表6 植物乳桿菌對北京鴨肝臟抗氧化功能相關基因表達的影響

3 討 論

3.1 植物乳桿菌對北京鴨脂質代謝的影響

隨著消費者對飲食健康的需求增加，畜禽產品中的脂肪和膽固醇含量愈發(fā)受到關注。同時，腹脂的過度沉積也會降低禽類胴體的經濟價值。本實驗室前期研究表明，與對照組相比，飼糧中添加400、800 mg/kg植物乳桿菌可分別使42日齡北京鴨的平均體重提高1.33%和0.52%[8]。本試驗研究了植物乳桿菌對北京鴨脂質代謝的影響，結果顯示，飼糧中添加400、800 mg/kg植物乳桿菌可分別使北京鴨的腹脂率降低11.40%和5.03%。這表明輕微下降的腹脂率并未導致北京鴨平均體重的下降，提示植物乳桿菌可一定程度上改善北京鴨的腹脂沉積情況，但并未引起顯著差異，這與前人在大鼠和人上取得的研究結果[9-11]相似。血清脂質和脂蛋白含量可反映機體脂質代謝和脂肪沉積的情況。飼糧中添加400、800 mg/kg植物乳桿菌均可顯著降低北京鴨的血清TC含量，飼糧中添加400 mg/kg植物乳桿菌有降低血清LDL-C含量的趨勢。LDL-C由富含膽固醇、TG的極低密度脂蛋白(VLDL)失去TG后形成，負責將膽固醇運送到各組織，用于合成細胞膜和產生類固醇激素，最終與肝細胞表面的LDLR結合，從而被清除[12]。這提示植物乳桿菌可以改善北京鴨的血脂狀況。Trabelsi等[13]報道，飼糧中添加植物乳桿菌TN8可降低肉雞血清TC含量；Li等[14]和Salaj等[9]研究均表明，飼糧中添加植物乳桿菌能夠降低高脂飲食小鼠血清TC和LDL-C含量，與本試驗結果相似。

肝臟是脂質代謝的核心器官。本試驗進一步研究了肝臟中脂質代謝相關基因的表達情況，探究植物乳桿菌調控北京鴨脂質代謝的潛在機制，結果表明，與對照組相比，飼糧中添加400、800 mg/kg植物乳桿菌均可顯著降低肝臟FAS的mRNA相對表達量，此外，飼糧中添加400 mg/kg植物乳桿菌還可顯著降低肝臟SREBP-1c的mRNA相對表達量。SREBP-1c可以和多種脂肪合成酶基因的啟動子結合并誘導其表達，還可以作為核轉錄調節(jié)因子直接調控FAS和ACC的表達[15]。FAS是脂肪從頭合成過程的限速酶[16]。本試驗結果表明，與對照組相比，飼糧中添加400、800 mg/kg植物乳桿菌可顯著降低肝臟SREBP-1c和它的靶基因FAS的mRNA相對表達量，而對肝臟ACC的mRNA相對表達量沒有顯著影響，這與Wang等[17]在研究約氏乳酸桿菌(LactobacillusJohnsonii)BS15對肉雞影響中的結果一致。此外，Dawood等[18]也報道了植物乳桿菌L-137可以下調吉富品系尼羅羅非魚肝臟FAS的mRNA相對表達量。提示植物乳桿菌等乳酸桿菌可下調肝臟脂肪酸的從頭合成過程，這可能是其緩解腹部脂肪沉積的途徑之一。與本試驗結果不同的是，Wang等[17]的結果還發(fā)現(xiàn)LactobacillusjohnsoniiBS15可以通過提高肝臟中PPAR-α的mRNA相對表達量，促進脂肪的β-氧化分解，從合成和分解2方面調控脂質代謝。這種差異可能與菌株和模式動物的不同有關[19-20]。

血液中的膽固醇受3條途徑調節(jié)：吸收、合成和排泄[21]。SREBP-2負責調控膽固醇的合成和攝取，可直接激活內源膽固醇合成限速酶HMGCR基因和負責外源膽固醇攝取的LDLR基因[22]。CYP7A1負責將膽固醇轉化為膽汁酸，進而通過糞便排泄，可有效降低血液TC和LDL-C含量[23]。本試驗結果表明，與對照組相比，飼糧中添加400、800 mg/kg植物乳桿菌均可顯著降低肝臟HMGCR的mRNA相對表達量，顯著提高肝臟CYP7A1的mRNA相對表達量，與血清TC含量降低的結果相吻合，提示植物乳桿菌可通過增強排泄、減少內源合成來降低血清TC含量。值得注意的是，肝臟脂質代謝相關基因從21日齡組間就開始出現(xiàn)差異，而血清TC含量在42日齡組間才出現(xiàn)差異，這與Wang等[17]的研究結果類似，其推測為持續(xù)變化的脂質代謝基因最終導致血脂表型的出現(xiàn)。

3.2 植物乳桿菌對北京鴨抗氧化功能的影響

肝臟作為機體脂質代謝的核心及應對氧化應激的重要效應器官，發(fā)生脂質代謝紊亂可產生大量ROS，攻擊核酸、蛋白質等生物分子，從而破壞細胞正常功能[24-25]。同樣，當肝臟受到氧化應激損傷時勢必也會引起脂質代謝功能紊亂[26]。腸道作為除肝臟外的另一大消化器官，物質能量代謝旺盛，極易受到氧化損傷，從而影響腸道屏障功能。因此，當氧化應激發(fā)生時，家禽可出現(xiàn)生產性能下降、肉品質降低、免疫抑制等現(xiàn)象[27-28]。因此，本試驗還評估了植物乳桿菌對北京鴨血清、肝臟和回腸抗氧化指標的影響，結果顯示，與對照組相比，飼糧中添加400、800 mg/kg植物乳桿菌均可顯著降低北京鴨肝臟和回腸MDA含量，提高血清SOD和CAT活性；此外，飼糧中添加400 mg/kg植物乳桿菌還可顯著降低血清MDA含量。MDA是ROS攻擊細胞膜上的多不飽和脂肪酸形成脂質過氧化物，可作為氧化損傷的生物標志物，細胞中的抗氧化酶如CAT、SOD可清除體內過量的ROS[29]。以上結果表明，植物乳桿菌有助于提高北京鴨的抗氧化功能，抑制脂質過氧化，減少氧化應激。這與前人在肉雞和斷奶羔羊中的研究結果[30-31]基本一致。

為了進一步探究其潛在機制，本試驗檢測了肝臟抗氧化功能相關基因的表達情況，結果顯示，與對照組相比，飼糧中添加400、800 mg/kg植物乳桿菌可顯著提高21日齡肝臟SOD的mRNA相對表達量，對肝臟Nrf2的mRNA相對表達量無顯著影響，與前人在肉雞中使用植物乳桿菌得出的結果[30]不一致。Wang等[32]的研究結果從蛋白質層面揭示了植物乳桿菌ZLP001通過促進胞質中的Nrf2向細胞核轉移，從而調節(jié)細胞氧化還原狀態(tài)，而非促進Nrf2的轉錄。對植物乳桿菌MA2的體外研究發(fā)現(xiàn)，其發(fā)酵液具有很強的還原能力、二價鐵離子(Fe2+)螯合能力以及清除各種自由基的能力，此外，發(fā)酵的上清液和細胞勻漿中均可檢測到抗氧化酶GSH-Px和SOD[33]。還有大量研究表明，植物乳桿菌分泌的胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)可提高細胞中SOD、CAT等抗氧化酶活性[34-36]。因此，除了通過促進Nrf2表達外，植物乳桿菌還可能通過促進Nrf2在細胞中的轉移、釋放小分子抗氧化物質、螯合過渡金屬氧化物等多種途徑，改善動物抗氧化功能[37-38]，或是通過作用于沉默信息調節(jié)因子1(silent information regulator 1，Sirt1)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)和蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)等其他信號通路激活機體的抗氧化系統(tǒng)[39-41]。本研究中使用的植物乳桿菌對北京鴨抗氧化功能的調節(jié)機制還需要進一步研究。

4 結 論

飼糧中添加植物乳桿菌可通過減少合成、增強排泄機制改善北京鴨的脂質代謝，同時提高其抗氧化功能?；诒驹囼灲Y果及經濟成本，推薦北京鴨飼糧中植物乳桿菌添加劑量為400 mg/kg。