高良姜素在動物/動物心肌細胞HF 發(fā)生發(fā)展中的抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗纖維化作用研究進展

童曼琳，尚茹茹，劉曉紅

1 山西醫(yī)科大學第五臨床醫(yī)學院，太原030000；2 山西省人民醫(yī)院特需病房

心力衰竭（HF）是一種慢性疾病，是多種心血管疾病的最后階段。心室重塑是HF 發(fā)生發(fā)展中的重要病理性過程，心肌細胞在持續(xù)的壓力超負荷、缺血、缺氧、炎癥等應激條件下，發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能的改變，包括左心室形態(tài)改變、心肌細胞肥大和間質(zhì)纖維化、心肌細胞凋亡［1-2］。高良姜素是一種從高良姜的干燥根莖提取所得的天然類黃酮化合物，其生物活性廣泛，有抗氧化、抗炎、抗凋亡及抗纖維化作用。高良姜素在HF 發(fā)生發(fā)展中的研究處于實驗模型階段（動物、動物細胞），臨床研究較少，多為壓力超負荷、異丙腎上腺素（ISO）或血管緊張素-Ⅱ（Ang-Ⅱ）誘導的小鼠或小鼠H9c2心肌細胞HF模型。近些年大量研究集中于高良姜素減輕動物/動物心肌細胞HF發(fā)生發(fā)展中的炎癥及纖維化作用，機制與清除氧自由基、降低脂質(zhì)過氧化、下調(diào)炎癥因子表達、減輕炎癥反應、抑制信號通路轉(zhuǎn)導、抑制細胞因子表達等相關。現(xiàn)就高良姜素在動物/動物心肌細胞HF 發(fā)生發(fā)展中的抗氧化、抗炎、抗凋亡及抗纖維化作用研究進展綜述如下。

1 高良姜素在動物/動物心肌細胞HF 發(fā)生發(fā)展中的抗氧化作用

氧化應激參與了HF 的發(fā)生和進展，它是指活性氧（ROS）的產(chǎn)生和內(nèi)源性抗氧化防御機制之間的平衡失調(diào)［3］。ROS 可修飾興奮—收縮耦合的中心蛋白質(zhì)，直接損害心肌細胞的電生理活動和收縮機制，具有促纖維化功能，誘導心臟成纖維細胞增殖、膠原合成，被認為是心肌纖維化的關鍵因素［4］。在ISO誘導的小鼠心肌梗死/HF 過程中，小鼠心肌細胞因氧氣和葡萄糖供應不完全而受傷，從而導致血清心臟標志物酶水平升高［5］。ISO 介導的ROS 生成可能是小鼠心臟標志物酶升高、氧化損傷和脂質(zhì)過氧化的原因［6］。THANGAIYAN 等［7］發(fā)現(xiàn)，ISO 處理的小鼠血清標志物酶明顯升高，予以高良姜素處理可顯著降低血清標志酶水平，血漿和心臟組織勻漿中脂質(zhì)過氧化物和脂氫過氧化物的水平均明顯升高，心肌細胞脂質(zhì)過氧化受到抑制［7］。高良姜素中C-2-C-3雙鍵和C-3 羥基具有抗氧化潛力，使其具備抗氧化特性，進而保護心臟。研究［8］顯示，超氧化物和單線態(tài)氧等自由基已經(jīng)被證明可以被高良姜素清除。

在氧化應激條件下，親電物質(zhì)修飾Kelch 樣環(huán)氧氯丙胺相關蛋白1（Keap1），使E3 連接酶復合物失活，阻止轉(zhuǎn)錄因子核因子E2 相關因子2（Nrf2）被蛋白酶體降解致使其大量積累，Nrf2 進入細胞核后可激活抗氧化反應元件（ARE），促使超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、血紅素氧合酶1（HO-1）等抗氧化酶大量轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮抗氧化功能［9］。HO-1 通過Nrf2/ARE信號通路發(fā)揮抗氧化作用。CHOI等［10］發(fā)現(xiàn)，高良姜素通過上調(diào)Nrf2/ARE 和cAMP 反應元件結(jié)合蛋白（CREB）信號來增加HO-1 的表達，并且過氧化物酶體增殖物激活受體-γ 通過正調(diào)控Nrf2-CREB 和負調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB（NF-κB），來介導高良姜素在小膠質(zhì)細胞相關的神經(jīng)退行性疾病的抗炎、抗氧化作用。在壓力超負荷誘導的小鼠HF 模型中，高良姜素可明顯上調(diào)Nrf2、HO-1、Keap1蛋白水平以及抗氧化蛋白酶（SOD、CAT、HO-1）活性，但其調(diào)控Nrf2、HO-1、Keap1蛋白在HF 過程中發(fā)揮抗氧化作用的具體分子機制尚不清楚［11］。研究［7］發(fā)現(xiàn)，高良姜素明顯上調(diào)ISO 誘導的HF 小鼠中的SOD、CAT 活性。高良姜素通過清除ROS、降低脂質(zhì)過氧化可減少小鼠心肌細胞損傷，阻止心肌纖維化發(fā)生，延緩小鼠HF 進展。高良姜素的抗氧化作用可能還與增加SOD、CAT、HO-1活性相關。

2 高良姜素在動物/動物心肌細胞HF 發(fā)生發(fā)展中的抗炎作用

在心肌損傷發(fā)生HF 過程中，大量炎癥細胞聚集在損傷區(qū)域，產(chǎn)生大量的促炎因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1β、IL-6、IL-18 等，使內(nèi)皮細胞損傷、缺氧、組織壞死，從而導致心肌細胞肥大、纖維化［12］。高良姜素主要通過調(diào)節(jié)促炎因子和抗炎因子的表達，而發(fā)揮抗炎作用。高良姜素可抑制脂多糖刺激的BV2 小膠質(zhì)細胞中的誘導型一氧化氮合酶和促炎細胞因子的表達，增強抗炎因子IL-10 的表達［10］。高良姜素可降低NF-κB 磷酸化、IκBα 磷酸化和核轉(zhuǎn)位，進而抑制順鉑誘導的促炎因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 的分泌，減輕順鉑誘導的腎毒性［13］。NF-κB 作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 及IL-12 的表達，還能調(diào)節(jié)與免疫、細胞生長和凋亡相關的基因轉(zhuǎn)錄［14］。NF-κB p65 在心室重塑過程中被激活，并促進炎癥因子的產(chǎn)生和釋放。因此，抑制NF-κB p65 轉(zhuǎn)錄活性可改善心臟重構(gòu)，并抑制促炎因子的表達。高良姜素可以抑制參與信號轉(zhuǎn)導的蛋白的磷酸化。高良姜素降低IκBα 的活性，抑制IκBα的降解，阻止NF-κB的激活，從而調(diào)節(jié)抑制IL-6和TNF-α的產(chǎn)生。WANG 等［15］發(fā)現(xiàn)，壓力超負荷誘導小鼠HF 過程中，NF-κB p65 和IκBα磷酸化作用增強，蛋白表達水平增加，而高良姜素可以明顯降低小鼠心臟中NFκB p65 和IκBα 的表達，抑制促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8的產(chǎn)生，減弱了炎癥反應。在AngⅡ誘導的H9c2心肌細胞炎癥反應中，高良姜素有抗炎效應。在壓力超負荷誘導小鼠HF和Ang-Ⅱ誘導的H9c2心肌細胞HF模型中，高良姜素均可通過抑制NF-κB 磷酸化、降低炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6等）表達而發(fā)揮抗炎作用。高良姜素使小鼠心肌細胞炎癥介質(zhì)明顯下調(diào)，炎癥反應減輕。

3 高良姜素在動物/動物心肌細胞HF 發(fā)生發(fā)展中的抗凋亡作用

心肌細胞的過度凋亡可造成心肌收縮單位持續(xù)性喪失，使心肌發(fā)生結(jié)構(gòu)性病變，進而削弱心肌的灌注能力，在不良循環(huán)中導致HF，限制細胞凋亡可保護心臟。高良姜素在心肌細胞凋亡方面的研究較少，機制尚不明確，其抗心肌細胞凋亡作用可能與負責心肌細胞凋亡信號通路有關。蛋白激酶B（AKT）主要調(diào)控細胞存活和凋亡。最近研究表明，磷酸肌醇3-激酶（PI3K）-AKT 信號通路在HF 中起到重要的作用［16］。激活的AKT 可以直接使糖原合成酶激酶3β（GSK3β）磷酸化和失活，這一機制參與了壓力超負荷誘導小鼠HF 發(fā)生發(fā)展的過程。研究表明，抑制PI3K-AKT-GSK3β 可減輕壓力超負荷誘導的心肌纖維化，并阻斷心肌成纖維細胞的激活和轉(zhuǎn)化［17］。WANG 等［15］發(fā)現(xiàn)，壓力超負荷引起小鼠重塑的心肌組織中PI3K、AKT和GSK3β的磷酸化水平均升高，心肌細胞凋亡增加，而這些作用均可被高良姜素抑制。Ang-Ⅱ刺激增加了小鼠H9C2 心肌細胞的凋亡率，增加了凋亡蛋白Bax 的表達，降低了抗凋亡蛋白Bcl2 的表達，而予以高良姜素處理，可以明顯增加Bcl2 表達，降低Bax 表達，降低H9C2 細胞的凋亡率。由此可知，高良姜素抗心肌細胞凋亡作用不僅通過抑制PI3K-AKT-GSK3β 信號轉(zhuǎn)導而實現(xiàn)，而且還可以影響凋亡基因表達來完成的。WANG等［15］證實了高良姜素在實驗模型中包括體內(nèi)（壓力超負荷誘導小鼠）和體外（Ang-Ⅱ誘導H9c2 心肌細胞）均可發(fā)揮抗凋亡作用，啟發(fā)了將其應用于臨床上HF患者同樣能發(fā)揮抗凋亡作用的可能性，當然尚需進行更多的實驗模型和臨床試驗來驗證這一潛力。

4 高良姜素在動物/動物心肌細胞HF 發(fā)生發(fā)展中的抗纖維化作用

心肌纖維化的特征是膠原周轉(zhuǎn)異常、間質(zhì)和血管周圍膠原過度沉積［18］。膠原蛋白周轉(zhuǎn)失調(diào)主要發(fā)生在成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化中，轉(zhuǎn)化過程中涉及到α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達。α-SMA 賦予細胞收縮行為，分泌大量的細胞外基質(zhì)（ECM）蛋白，在刺激因子轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）的促使下會增加ECM 蛋白的過度沉積，從而促進心肌纖維化的發(fā)生［19］。TGF-β超家族成員是心肌修復、重塑和纖維化的關鍵調(diào)節(jié)因子。Smad3是Smads 蛋白家族中最具特征性的成員，在肌成纖維細胞表型活化、ECM 合成刺激、整合素表達以及蛋白酶和抗蛋白酶分泌中發(fā)揮關鍵作用［20］。研究證實，高良姜素減弱了壓力超負荷誘導的HF 小鼠模型中TGF-β1/Smads 信號表達，阻止了心肌成纖維細胞的增殖及ECM 合成。在THANGAIYAN 的研究中，我們可以得知高良姜素通過下調(diào)TGF-β1、Smad-2/3、α-SMA、纖維連接蛋白的表達來減少膠原積累，防止ISO 誘導的小鼠心肌纖維化，阻止了HF的發(fā)生［7］。

肌成纖維細胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）和金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP），MMP 可以降解ECM 蛋白，在心肌纖維化中起著關鍵作用，其中最主要的是MMP-2 和MMP-9［21］。正常情況下，MMP、TIMP 保持良好的平衡，維持ECM 的周轉(zhuǎn)和穩(wěn)態(tài)［22］。但在病理情況下，MMP和TIMP功能失衡，使ECM的合成和分解失衡并重新分布，加重心肌細胞纖維化［21］。ROS 可增加對ECM 蛋白的降解，增強MMP-2和MMP-9的表達活性，調(diào)節(jié)成纖維細胞增殖、分化，促進心肌纖維化［23］。在ISO 誘導小鼠HF 實驗模型中，高良姜素通過調(diào)節(jié)ROS 活性及相關酶的生成，下調(diào)MMP-2、MMP-9 活性，降低了心肌細胞周圍膠原、ECM 蛋白的表達，有效阻止了小鼠心肌纖維化［7］。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是一種被應激和炎癥刺激激活的激酶家族，調(diào)節(jié)心臟成纖維細胞功能的多個方面，包括炎癥反應、肌成纖維細胞分化、EMC轉(zhuǎn)換和心肌細胞肥大［24］。MAPK家族由細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、p38MAPK 和c-Jun 氨基末端激酶（JNK）組成。ERK1/2 作為MAPK 信號通路的重要成員，可以直接修飾一系列轉(zhuǎn)錄因子，促進心臟基因表達，最終導致心肌細胞肥厚、心肌纖維化，從而發(fā)生HF［25］。研究［26］表明，GATA 結(jié)合蛋白4（GATA4）可以被磷酸化的ERK1/2 激活，從而增加GATA4 的DNA 結(jié)合能力和肥厚基因程序的激活。從WANG 等的實驗中我們得知，高良姜素不僅可以通過PI3K-AKT-GSK3β 信號通路調(diào)節(jié)小鼠和H9C2心肌細胞凋亡，還可以調(diào)節(jié)MEK1/2-ERK1/2-GATA4信號通路，顯著改善小鼠心功能，抑制心肌肥厚和纖維化。THANGAIYAN 的研究［7］表明，高良姜素可抑制ISO 誘導的大鼠JNK、ERK 和p38 的激活，減輕心肌纖維化，延緩HF。高良姜素明顯下調(diào)了實驗模型中HF 小鼠心肌纖維化標志物水平，減輕心肌纖維化及心室重塑，發(fā)揮抗纖維化作用。臨床HF 患者在長期應激條件刺激下，發(fā)生心肌纖維化和心室重塑，導致心室結(jié)構(gòu)功能障礙，高良姜素在HF 小鼠中表現(xiàn)出來的抗纖維化作用，可能成為逆轉(zhuǎn)HF 患者心室重塑，改善心功能的新的干預途徑。

綜上所述，HF始于心肌損傷，發(fā)生氧化應激、炎癥改變，導致心肌纖維化、心室病理性重塑，從而出現(xiàn)心室擴大或心肌肥大，最終導致泵衰竭。在動物/動物心肌細胞HF 發(fā)生發(fā)展過程中，高良姜素通過清除氧自由基、降低脂質(zhì)過氧化發(fā)揮抗氧化作用，抑制NF-κB磷酸化、降低炎癥因子發(fā)揮抗炎作用，抑制PI3K-AKT-GSK3β 信號通路轉(zhuǎn)導、調(diào)節(jié)凋亡、抗凋亡基因表達發(fā)揮抗凋亡作用，下調(diào)MMP 活性、抑制TGF-β 表達、抑制成纖維細胞轉(zhuǎn)化發(fā)揮抗纖維化作用。目前對高良姜素的研究主要基于動物/動物心肌細胞HF 上，在臨床上研究較少，并且在調(diào)節(jié)PI3K-AKT-GSK3β、MEK1/2-ERK1/2-GATA4 等信號通路的具體分子機制尚未明確。但是高良姜素在減輕炎癥、心肌纖維化的作用已被大量研究證實，其表現(xiàn)出來的治療HF 的潛力十分可觀，因此尚需大量的動物實驗和臨床試驗才能將其應用于臨床HF 患者的治療中。