背部皮下注射過表達(dá)ZFP580基因轉(zhuǎn)染的EPCs介導(dǎo)裸鼠局部血管生成情況觀察

黃佳雯，張梅，韋淑萍

1 西安市中醫(yī)醫(yī)院心血管病科，西安710021；2 武警特色中心心內(nèi)科；3 武警后勤學(xué)院衛(wèi)勤系人體形態(tài)學(xué)教研室

急性心肌梗死（AMI）是指冠狀動(dòng)脈急性、持續(xù)性缺血缺氧引起心肌壞死的急危病癥，是目前全球范圍內(nèi)的主要死亡原因之一［1］。目前可通過藥物及血運(yùn)重建等治療有效挽救患者生命，但損傷心肌功能的恢復(fù)仍存在局限性。內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）是一類尚未表達(dá)成熟內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）表型的干細(xì)胞，具有促進(jìn)血管生成和修復(fù)內(nèi)皮的功能［2］。研究表明，EPCs可通過促進(jìn)血管生成和血栓再通，減少心肌壞死面積，改善左室功能［3］。因此，提高EPCs 的血管生成能力對(duì)于改善AMI 患者預(yù)后十分重要。ZFP580 基因是由本課題組克隆得到的一種新型C2H2鋅指基因［4］。前期研究［5］發(fā)現(xiàn)，隨著EPCs分化為成熟ECs，ZFP580 基因表達(dá)隨之增強(qiáng)。過表達(dá)ZFP580 基因后可促進(jìn)EPCs 向成熟ECs 分化。利用siRNA 腺病毒載體干擾EPCs 中ZFP580 基因表達(dá)后，EPCs 體外血管生成能力降低，提示ZFP580 基因參與EPCs 介導(dǎo)的體外血管生成［6］?；谝陨涎芯?，本研究觀察了背部皮下注射過表達(dá)ZFP580 基因轉(zhuǎn)染的EPCs 介導(dǎo)的裸鼠局部血管生成情況，為提高EPCs 血管生成能力及改善AMI 患者預(yù)后提供新的策略和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本課題研究所需動(dòng)物均從中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心采購，選用月齡2 個(gè)月、體質(zhì)量約150 g 左右的雄性SD 大鼠，用于提取骨髓源性EPCs。選用周齡6周，體質(zhì)量約30 g左右的雄性BALB/c 裸鼠，進(jìn)行體內(nèi)血管生成實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK-（軍）2012-0004。

1.2 主要試劑 大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞分離液采購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究院；VEGF、FGF 購自美國Peprotech 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京TaKaRa 公司；β-actin 抗體、ZFP580 抗體、vWF 抗體采購于美國Abcam 公司；Matrigel 膠購自于美國Trevigen 公司；其他實(shí)驗(yàn)所需生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純；ZFP580及β-actin引物序列均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 大鼠骨髓源性EPCs 提取、培養(yǎng)、分組及ZFP580 基因轉(zhuǎn)染 將頸椎脫臼法處死的SD 大鼠放入75%乙醇中浸泡15 min，無菌條件下剪取大鼠股骨和脛骨，剝離肌肉后暴露股骨、脛骨兩端，用2 mL注射器抽取0.01 mol/L 的PBS 液沖洗骨髓。采用Ficoll 密度梯度離心20 min（1 800 r/min）分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，得到純度較高的EPCs，調(diào)整細(xì)胞密度，以4×106/mL 接種于包被纖維粘連蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)瓶［7］。用含有20%FBS、10 ng/mL VEGF、10 ng/mL FGF、1%雙抗（青霉素、鏈霉素）及高糖DMEM 培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。以腺病毒為載體，構(gòu)建過表達(dá)ZFP580 基因（Ad-ZFP580）和低表達(dá)ZFP580 基因（Ad-siZFP580），分別以過表達(dá)病毒空載（Ad-NC）、低表達(dá)病毒空載（Ad-si-scrambled）作為對(duì)照。將培養(yǎng)至第3 d 的EPCs 以2×105密度將處于接種于6 孔培養(yǎng)板中，待長(zhǎng)到第7 d 細(xì)胞融合至60%時(shí)，將Ad-ZFP580（MOI=10）、Ad-siZFP580（MOI=50）分別轉(zhuǎn)染EPCs（Ad-ZFP580 組、Ad-siZFP580 組），分別 以Ad-NC、Ad-si-scrambled 轉(zhuǎn) 染EPCs 作 為 對(duì) 照（Ad-NC 組、Ad-si-scrambled 組），轉(zhuǎn)染48 h 后通過觀察綠色熒光表達(dá)評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。待達(dá)到80%左右的轉(zhuǎn)染效率時(shí)，用于以下實(shí)驗(yàn)。采用qRT-PCR 檢測(cè)各組病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后ZFP580 mRNA，Western blotting 法檢測(cè)ZFP580 蛋白。Ad-NC 組、Ad-ZFP580 組、Ad-si-scrambled 組、Ad-siZFP580 組ZFP580 mRNA相 對(duì) 表 達(dá) 量 分 別 為1.03 ± 0.04、1.71 ± 0.10、1.03 ± 0.05、0.41 ± 0.06，ZFP580 蛋白相對(duì)表達(dá)量分 別 為0.99 ± 0.04、2.14 ± 0.20、1.01 ± 0.02、0.54 ± 0.09，Ad-ZFP580 組的ZFP580 mRNA、蛋白相 對(duì) 表 達(dá) 水 平 明 顯 高 于Ad-NC（P＜0.05），Ad-siZFP580 組的ZFP580 mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯低于Ad-si-scrambled（P＜0.05），以上結(jié)果提示從基因和蛋白水平上證明了腺病毒成功轉(zhuǎn)染EPCs，有效增強(qiáng)或降低了其內(nèi)源性ZFP580的表達(dá)。

1.4 過表達(dá)ZFP580 基因轉(zhuǎn)染的EPCs 細(xì)胞懸液與Matrigel 膠混合及混合物在裸鼠背部皮下注射方法和皮下膠體取材 將Matrigel 膠液先放置于盛有冰塊的燒杯中，4 ℃冰箱過夜，凍融后用于實(shí)驗(yàn)。選6周齡裸鼠24 只，將其隨機(jī)分為4 組，每組6 只，在裸鼠尾部標(biāo)記序號(hào)用以分組區(qū)別。將Ad-NC 組、Ad-ZFP580組、Ad-si-scrambled 組、Ad-siZFP580組貼壁的EPCs以0.25%胰蛋白酶消化，細(xì)胞懸液離心后得到細(xì)胞沉淀，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后取5×105個(gè)EPCs 與100 μL Matrigel 膠液混合均勻。同時(shí)將水合氯醛按照100 mg/kg 配比腹腔注射麻醉裸鼠，用注射器抽取1 mL 各組細(xì)胞懸液與Matrigel 膠的混合物，注射至裸鼠的背部皮下。7 d后頸椎脫臼處死裸鼠，取其背部皮下的膠體做好標(biāo)記，置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋后切片。

1.5 裸鼠背部皮下膠體血管管腔生成數(shù)目檢測(cè) 采用HE 染色法。取各組石蠟包埋后切片。首先應(yīng)用二甲苯對(duì)體外血管生成實(shí)驗(yàn)收集的各組標(biāo)本切片進(jìn)行脫蠟3 次，每次10 min；按照無水乙醇、95%、90%、80%、70%的酒精梯度進(jìn)行脫苯各5 min，自來水沖洗；切片滴加蘇木素染液浸染10 min，自來水沖洗1 min；置于1%鹽酸酒精1 min 使其分化，自來水再次沖洗；采用1%伊紅染色1 min；進(jìn)行酒精梯度上行脫水，二甲苯透明后，應(yīng)用中性樹膠封片。100倍顯微鏡下觀察血管管腔生成數(shù)目，多個(gè)ECs與基膜圍成的結(jié)構(gòu)即為血管管腔結(jié)構(gòu)。

1.6 裸鼠背部皮下膠體vWF 陽性結(jié)構(gòu)數(shù)目檢測(cè) 采用免疫組化vWF 染色法。收集各組石蠟標(biāo)本切片，做好標(biāo)記，第一步用二甲苯對(duì)石蠟標(biāo)本切片脫蠟，然后按照酒精梯度進(jìn)行水化；3%過氧化氫室溫孵育5～10 min，使內(nèi)源性過氧化物酶失活；PBS沖洗5 min；第二步采用微波抗原修復(fù)，標(biāo)本切片放置于溫度在92～98 ℃的微波爐內(nèi)20 min；第三步血清封閉，10%山羊血清室溫封閉切片標(biāo)本10 min；第四步抗體孵育，丟棄血清后，切記請(qǐng)勿用水清洗切片，按照比例滴加vWF 抗體，放置37℃孵育2 h；PBS沖洗3 次，每次5 min，按1∶500 滴加二抗，37 ℃孵育30 min，再次用PBS 沖洗；第五步DAB 顯色10 min，注意需用顯微鏡觀察顯色情況。水沖洗后滴加蘇木素染液再次浸染，酒精濃度梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。100 倍顯微鏡下觀察血管管腔vWF陽性結(jié)構(gòu)數(shù)目，vWF 染色定位于血管管腔ECs 細(xì)胞質(zhì)，棕褐色染色即為vWF陽性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組膠體中血管管腔生成數(shù)目比較 Ad-ZFP580 組、Ad-NC 組膠體中血管管腔生成數(shù)目分別為（4.83 ± 0.75）、（2.00 ± 0.63）個(gè)，Ad-siZFP580組、Ad-si-scrambled 組膠體中血管管腔生成數(shù)目分別為（0.50 ± 0.55）、（2.17 ± 0.41）個(gè)，Ad-ZFP580組、Ad-NC 組比較，Ad-siZFP580 組、Ad-si-scrambled組比較，P均＜0.05。

2.2 各組膠體中血管管腔的vWF 陽性結(jié)構(gòu)數(shù)目比較 Ad-ZFP580 組、Ad-NC 組膠體中膠體中血管管腔的vWF 陽性結(jié)構(gòu)數(shù)目分別為（4.67 ± 0.82）、（1.83 ± 0.41）個(gè)，Ad-siZFP580 組、Ad-si-scrambled組膠體中膠體中血管管腔的vWF 陽性結(jié)構(gòu)數(shù)目分別為（0.67 ± 0.52）、（1.83 ± 0.75）個(gè)，Ad-ZFP580組、Ad-NC 組比較，Ad-siZFP580 組、Ad-si-scrambled組比較，P均＜0.05。

3 討論

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、人口老齡化嚴(yán)重及生活水平提高，AMI發(fā)病率逐年遞增。據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國約有2.9億人患有心血管疾病，其中約超過250萬人患有AMI［8］，而且AMI 發(fā)病年齡逐漸年輕化。內(nèi)科藥物溶栓、冠脈介術(shù)入、外科血管搭橋等治療手段可有效恢復(fù)部分心肌梗死區(qū)域的血供，拯救患者生命，一定程度改善AMI患者生活質(zhì)量及預(yù)后［9］。但是仍有許多患者未能及時(shí)開通病變血管，進(jìn)行血運(yùn)重建，導(dǎo)致心肌細(xì)胞出現(xiàn)不可逆性損傷和壞死，引起心室重塑和心功能不全。因此，需尋求新的治療方法保護(hù)缺血的心肌，延緩甚至可逆轉(zhuǎn)AMI 后心室重塑，預(yù)防患者心功能不全的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，刺激缺血區(qū)域血管生成，提高心肌細(xì)胞存活率，可減少對(duì)心臟收縮功能的影響［10］。EPCs 是一類能動(dòng)員、循環(huán)、增殖并分化為血管ECs，但尚未表達(dá)成熟血管ECs 表型，也未形成血管的前體細(xì)胞［2］，其參與了缺血組織的血管生成，能夠減少缺血面積，增加缺血心肌的血供，改善左心室功能［3，11］。EPCs 最早在1997 年由ASAHARA 等［12］首次發(fā)現(xiàn)并提出，該團(tuán)隊(duì)從成人外周血中分離出來EPCs，且能分化成為血管ECs。其后EPCs被研究者在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其具有形成管腔樣結(jié)構(gòu)的能力，不僅參與胚胎時(shí)期血管新生，同時(shí)也在成人血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用［13］。近年研究顯示，EPCs 在缺血性疾病如AMI、外周血管疾病等研究治療方面有十分廣闊的應(yīng)用前景［14-15］，但目前仍處于起步階段，存在很多問題需要深入研究，如EPCs 如何優(yōu)化培養(yǎng)、基因調(diào)控分化機(jī)制、如何提高EPCs 血管生成能力、下一步臨床應(yīng)用研究等。因此，EPCs 的生物學(xué)效應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制、其血管生成能力提高及潛在治療作用是目前熱點(diǎn)研究項(xiàng)目。

本課題組前期通過人主動(dòng)脈cDNA 文庫篩選得到cDNA 全長(zhǎng)為1726 bp 的人ZNF580 基因（Genbank注冊(cè)號(hào)：AF184939），隨后克隆了與ZNF580 基因功能一致的大鼠同源ZFP580 cDNA 序列，兩者氨基酸序列相似度達(dá)97%［16］。ZFP580 基因作為新型的鋅指家族基因，它的蛋白結(jié)構(gòu)與家族成員中轉(zhuǎn)錄因子krüppel-like-factor（KLF）相似［4］。KLF 家族成員具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、生長(zhǎng)和凋亡的作用［17］。作為KLF 家族中重要的轉(zhuǎn)錄因子，KLF2 和KLF4 可通過參與多條分子信號(hào)通路促進(jìn)EPCs 向成熟ECs 的分化過程［18-19］。作為與KLF 蛋白結(jié)構(gòu)高度相似的ZFP580基因，前期實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí)其可促進(jìn)血管ECs 增殖、遷移等，參與血管再內(nèi)皮化過程［20］。但是，ZFP580基因在血管生成方面的生物學(xué)特點(diǎn)及具體調(diào)控機(jī)制并不十分清楚。因此本課題組主要研究ZFP580 基因?qū)PCs 分化作用的影響，在此基礎(chǔ)上探討對(duì)其血管生成能力的影響及相關(guān)調(diào)控信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。前期工作中已觀察到在EPCs 向成熟ECs 分化的過程，ZFP580基因表達(dá)逐漸增強(qiáng)。隨后我們應(yīng)用腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，過表達(dá)ZFP580 基因后，可加快EPCs 其向成熟ECs 表型的分化［5］，可能通過激活eNOS/NO 途徑參與調(diào)控EPCs 分化過程［21］。進(jìn)一步研究ZFP580基因在血管生成方面的生物學(xué)作用，當(dāng)干擾EPCs 內(nèi)源性的ZFP580 基因表達(dá)后，EPCs 體外血管生成能力降低，這也揭示了ZFP580 基因參與EPCs 介導(dǎo)的體外血管生成［6］。在此前期研究基礎(chǔ)上，我們?cè)O(shè)計(jì)此實(shí)驗(yàn)研究，目的在于驗(yàn)證過表達(dá)ZFP580 基因?qū)PCs 介導(dǎo)的動(dòng)物體內(nèi)血管生成能力的影響，更進(jìn)一步探討ZFP580 基因?qū)PCs 血管生成的生物學(xué)效應(yīng)。以期ZFP580 有望成為促進(jìn)血管生成、修復(fù)內(nèi)皮功能的關(guān)鍵候選基因，同時(shí)為提高EPCs 血管生成能力提供新的思路。本研究顯示，Ad-ZFP580組生成血管管腔數(shù)目及管腔vWF陽性結(jié)構(gòu)數(shù)目比Ad-NC組明顯增多，Ad-siZFP580組生成血管管腔數(shù)目及管腔vWF 陽性結(jié)構(gòu)數(shù)目比Ad-siscrambled 組明顯減少，說明過表達(dá)ZFP580 基因可增強(qiáng)EPCs介導(dǎo)的裸鼠體內(nèi)血管生成能力。

總之，過表達(dá)ZFP580 基因后可增加EPCs 介導(dǎo)的裸鼠體內(nèi)血管管腔生成能力，而低表達(dá)ZFP580基因后則抑制EPCs 介導(dǎo)的裸鼠體內(nèi)血管生成，說明ZFP580 基因參與EPCs 介導(dǎo)的體內(nèi)血管生成過程。但ZFP580基因介導(dǎo)EPCs 的血管生成作用能否進(jìn)一步應(yīng)用于AMI 等疾病的治療領(lǐng)域，尚未進(jìn)行相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。以及其詳細(xì)的調(diào)控機(jī)制網(wǎng)絡(luò)也未完全闡明，仍需我們進(jìn)行更多深入、廣泛的研究，從分子水平、體內(nèi)外水平、臨床應(yīng)用價(jià)值等全面深入認(rèn)識(shí)ZFP580基因的生物學(xué)功能。