溴結(jié)構(gòu)域蛋白4在心血管疾病中的研究進(jìn)展

劉 彬 江立生

溴結(jié)構(gòu)域和額外終端域(bromodomain and extra terminal domain，BET)家族蛋白是一類染色質(zhì)蛋白，其成員包括溴結(jié)構(gòu)域蛋白(bromodomain protein，BRD)2、BRD3、BRD4和BRDT，主要通過(guò)介導(dǎo)蛋白質(zhì)間相互作用來(lái)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性[1]。BRD2在精母細(xì)胞和圓精細(xì)胞等細(xì)胞中均有表達(dá)，具有激酶活性，調(diào)節(jié)機(jī)體能量平衡；BRD3在睪丸、卵巢、子宮、胎盤及大腦中高表達(dá)，與乙?；募t系特異性轉(zhuǎn)錄因子(GATA1)結(jié)合，在造血過(guò)程中起轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用；而B(niǎo)RD4在人體中表達(dá)極為廣泛，在多種癌細(xì)胞及纖維化細(xì)胞中呈高表達(dá)；BRDT則在睪丸中特異性表達(dá)，對(duì)精子基因表達(dá)尤為重要[2]。BET蛋白有兩個(gè)保守的氨基末端溴域和一個(gè)羧基末端“超末端”結(jié)構(gòu)域，其中溴域結(jié)構(gòu)有4個(gè)α螺旋，并由可變環(huán)區(qū)隔開(kāi)，形成識(shí)別乙酰賴氨酸殘基的疏水空腔[3]。除與組蛋白中的乙?；嚢彼嵯嗷プ饔猛?，BET蛋白還與轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合體的成員和其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用。BET蛋白是正常細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞表觀遺傳信息的關(guān)鍵“讀取器”，在癌癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在多種心血管疾病發(fā)展過(guò)程中，調(diào)控BET蛋白則是一種在細(xì)胞分化、識(shí)別和細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變中控制基因表達(dá)的手段，其中以BRD4的調(diào)控最為重要，其有望成為新的治療靶點(diǎn)[4-7]。

1 BRD4在動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)中的作用

脂質(zhì)積聚是AS形成的重要始動(dòng)因素之一。除降低低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)水平外，提高高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)水平也是預(yù)防AS的有效方法。作為HDL顆粒的主要蛋白載體，載脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ)可提高前HDL-β1的水平并促進(jìn)HDL的成熟[8]。Mclure等[9]研究結(jié)果表明，抑制BRD4可提高apoA-Ⅰ和HDL的水平，進(jìn)而促進(jìn)膽固醇動(dòng)員并延緩AS的進(jìn)展。也有研究[10]顯示，部分敲除小鼠脂肪組織BRD4基因可顯著減輕其體重，BRD4特異性抑制劑JQ-1可縮小棕色脂肪的體積，抑制葡萄糖的吸收和后續(xù)產(chǎn)熱。

內(nèi)皮細(xì)胞損傷也是AS進(jìn)展的重要機(jī)制。研究[6]顯示，沉默人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的BRD2、BRD3或BRD4基因可降低TNF-α誘導(dǎo)的炎癥基因的表達(dá)，其中BRD4基因起關(guān)鍵作用。BRD4特異性抑制劑如JQ-1處理的內(nèi)皮細(xì)胞，可阻斷TNF-α誘導(dǎo)的血管細(xì)胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule，VCAM)1等多種促炎和致AS內(nèi)皮基因的表達(dá)，以及白細(xì)胞黏附和跨內(nèi)皮遷移。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，體內(nèi)注射BRD4抑制劑對(duì)LDL受體缺陷小鼠模型的AS進(jìn)展也起到延緩作用[11]。由此可知，抑制BRD4可保護(hù)血管內(nèi)皮功能，對(duì)預(yù)防AS和延緩其進(jìn)展具有一定意義。

血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)從中膜到內(nèi)膜的增殖和遷移是AS進(jìn)展過(guò)程的重要特征之一[12]。任何改變VSMC對(duì)機(jī)械力和損傷因子刺激的反應(yīng)，都可誘導(dǎo)增殖性血管內(nèi)膜增生，BET家族成員中BRD4被認(rèn)為是決定VSMC表型和病理狀態(tài)的關(guān)鍵因素[13]。BET還參與了一種被稱為“內(nèi)皮到間質(zhì)轉(zhuǎn)變(EndMT)”的跨越內(nèi)皮細(xì)胞(EC)和VSMC的血管重構(gòu)機(jī)制[14]，而B(niǎo)RD4對(duì)這一機(jī)制起控制作用[15]。研究[16]顯示，通過(guò)轉(zhuǎn)染Pin1質(zhì)粒載體上調(diào)VSMC的Pin1表達(dá)可促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的BRD4表達(dá)，并刺激細(xì)胞增殖和遷移，而JQ-1可抑制高糖誘導(dǎo)的VSMC的BRD4蛋白表達(dá)，提示抑制Pin1/BRD4通路或可改善糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化，其機(jī)制可能與抑制VSMC的增殖和遷移有關(guān)。

炎癥反應(yīng)在整個(gè)AS形成和進(jìn)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用。在炎癥因子作用下，炎癥信號(hào)導(dǎo)致NF-κB從細(xì)胞質(zhì)移動(dòng)到細(xì)胞核，后者被p300乙酰化后與BRD4相互作用，并招募BRD4作為促炎基因的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子，形成超級(jí)增強(qiáng)子(superenhancers，SEs)位點(diǎn)[17]。促炎SEs的形成會(huì)因?yàn)槿旧|(zhì)中BRD4基因的缺失而受到抑制，影響SEs相關(guān)基因的表達(dá)，從而阻礙白細(xì)胞在內(nèi)皮中的滾動(dòng)、黏附和遷移[11]。研究[18]發(fā)現(xiàn)，BRD4抑制劑Apabetone(又稱RVX-208)可以抑制炎癥誘導(dǎo)的BRD4在血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥基因的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子上積聚，以及后續(xù)與炎癥、內(nèi)皮功能障礙、單核細(xì)胞募集和斑塊不穩(wěn)定相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄。此外，BRD4過(guò)表達(dá)不僅上調(diào)活性氧(ROS)的生成[19]，還誘導(dǎo)IL-8的轉(zhuǎn)錄[18]，兩者都通過(guò)促進(jìn)基質(zhì)降解導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定。上述研究提示，抑制BRD4可延緩血管炎癥進(jìn)展，對(duì)維護(hù)粥樣斑塊的穩(wěn)定性也具有一定益處。

2 BRD4在心肌梗死中的作用

心肌梗死是心肌發(fā)生缺血壞死的病理過(guò)程，是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的最嚴(yán)重表現(xiàn)形式。有研究發(fā)現(xiàn)，BRD4蛋白在心肌梗死大鼠模型心肌細(xì)胞和缺氧心肌細(xì)胞中的表達(dá)水平均顯著升高，并伴有利鈉肽A (ANP)和利鈉肽B (BNP)表達(dá)水平的升高；而敲除BRD4可顯著下調(diào)體內(nèi)外ANP和BNP的表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡，改善心力衰竭大鼠血流動(dòng)力學(xué)和生物特征參數(shù)。體外研究[20]進(jìn)一步證實(shí)，BRD4與乙?；疪elA結(jié)合可增強(qiáng)NF-κB信號(hào)通路的激活，從而促進(jìn)ANP和BNP轉(zhuǎn)錄。此外，在冠狀動(dòng)脈結(jié)扎大鼠心肌梗死模型中，使用JQ-1預(yù)處理可顯著降低24 h內(nèi)心肌梗死標(biāo)志物的水平[21]，提示抑制BRD4可能對(duì)延緩心肌梗死的進(jìn)展具有積極作用。另一項(xiàng)研究[22]證明，抑制BRD4可通過(guò)PI3K/AKT通路阻止foxo4依賴的ROS生成，從而阻斷了腎細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白的表達(dá)，這為治療心肌缺血再灌注損傷提供了新思路。

3 BRD4在心力衰竭中的作用

心力衰竭是心血管疾病的最嚴(yán)重階段，死亡率高且預(yù)后不良。心室重構(gòu)是心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的基本機(jī)制，通常以病理性肥大、心肌細(xì)胞死亡和細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度纖維化為特征。研究[23]結(jié)果表明，BRD4在心肌肥大過(guò)程中是病理基因反式激活的關(guān)鍵輔助激活因子，其機(jī)制包括招募正轉(zhuǎn)錄延伸因子b(P-TEFb)活性和暫停釋放POL-Ⅱ，在不同小鼠心力衰竭模型的心肌細(xì)胞和藥物誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源的心肌細(xì)胞中控制著纖維化進(jìn)程和炎性轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)。在培養(yǎng)的新生大鼠心室肌細(xì)胞中，小干擾RNA介導(dǎo)的BRD4沉默或應(yīng)用JQ-1可阻斷心肌細(xì)胞病理性肥大；在小鼠壓力超負(fù)荷初始期及早給予JQ-1可遏制心肌肥厚和左心室收縮功能障礙的進(jìn)展[23]。抑制BRD4的表達(dá)可通過(guò)減少ROS的產(chǎn)生、抑制纖維化和炎癥，顯著減輕壓力超負(fù)荷或AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥厚[24]。值得關(guān)注的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)BRD4信號(hào)與運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞生理性肥大無(wú)顯著相關(guān)性[23]。

BRD4可能通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β和絲裂原活化蛋白激酶的表達(dá)，誘導(dǎo)靜止的心臟成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)成分的細(xì)胞，從而控制心臟纖維化和心力衰竭[25]。BRD4介導(dǎo)的EndMT調(diào)節(jié)過(guò)程也參與心臟纖維化的發(fā)生、發(fā)展，抑制BRD4可阻止主動(dòng)脈縮窄或TGF-β誘導(dǎo)的心肌纖維化，其部分機(jī)制為JQ-1通過(guò)靶向TGF-β受體1來(lái)減弱TGF-β誘導(dǎo)的EndMT；其中由TGF-β激活的Smad通路也參與了EndMT，而抑制BRD4功能可使該信號(hào)通路失活[15]。心肌細(xì)胞中許多富含BRD4的超級(jí)增強(qiáng)子與促纖維化基因表達(dá)有關(guān)，包括結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、纖溶酶原激活物抑制物-1和TGF-β[26]。這些研究結(jié)果表明，BRD4可能對(duì)心臟纖維化具有促進(jìn)作用，抑制BRD4可能是延緩心臟纖維化的有效策略。

最近的研究發(fā)現(xiàn)，BRD4蛋白在維持心肌收縮功能和線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面也發(fā)揮著不可或缺的作用。通過(guò)心肌細(xì)胞特異性BRD4缺失模型，發(fā)現(xiàn)BRD4調(diào)節(jié)心肌線粒體基因的表達(dá)。BRD4蛋白的缺失導(dǎo)致核編碼的關(guān)鍵線粒體基因，以及參與線粒體質(zhì)子梯度(ETC)偶聯(lián)的基因表達(dá)顯著下調(diào)。這些變化導(dǎo)致心肌細(xì)胞耗盡與ETC和代謝物循環(huán)(三羧酸循環(huán)和脂質(zhì)氧化)有關(guān)的關(guān)鍵酶，造成心室收縮能力進(jìn)行性下降、心室擴(kuò)張和心肌病，證明了BRD4在維持正常心肌細(xì)胞生物學(xué)方面的生理作用[27]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，成年小鼠心肌細(xì)胞特異性BRD4基因的缺失導(dǎo)致心肌收縮功能的急性惡化，突變動(dòng)物表現(xiàn)出豐富的轉(zhuǎn)錄特征，線粒體能量產(chǎn)生的關(guān)鍵基因的表達(dá)顯著降低。BRD4優(yōu)先與GATA4共定位，GATA4是一個(gè)決定心臟轉(zhuǎn)錄因子的譜系，BRD4和轉(zhuǎn)錄因子GATA4共同占據(jù)了參與成年心肌細(xì)胞線粒體能量產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本的啟動(dòng)子區(qū)域。BRD4和GATA4在心肌細(xì)胞中形成內(nèi)源性復(fù)合物，并以溴域非依賴的方式相互作用。BRD4-GATA4模塊控制線粒體代謝的上游轉(zhuǎn)錄輔助激活因子及其下游基因靶標(biāo)的表達(dá)。這提示BRD4-GATA4模塊是成人心臟中線粒體生物能量學(xué)的重要協(xié)調(diào)者[28]。上述研究結(jié)果表明，BRD4的功能可能對(duì)維持正常的心功能是不可或缺的。

4 BRD4在心肌病中的作用

糖尿病性心肌病是導(dǎo)致糖尿病患者最終心力衰竭的復(fù)雜事件。在高糖刺激的心肌成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞中，BRD4表達(dá)增加，伴有明顯的肌成纖維細(xì)胞分化和心肌細(xì)胞凋亡。JQ-1治療可抑制STZ(鏈唑霉素)誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型的心臟纖維化和改善心功能，其減輕心肌纖維化的機(jī)制與調(diào)控Caveolin-1/TGF-β1/Smad3信號(hào)通路有關(guān)；此外，JQ-1不僅顯著抑制高血糖誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞增殖和遷移、肌成纖維細(xì)胞分化和膠原生成，還可抑制心肌細(xì)胞凋亡[29]。在高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病性心肌病中，心臟組織BRD4表達(dá)上調(diào)，后者對(duì)PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬起抑制作用，并進(jìn)一步損害線粒體和心臟的結(jié)構(gòu)與功能，而使用JQ-1則對(duì)這一過(guò)程起修復(fù)作用[30]。核纖層蛋白基因LMNA突變是原發(fā)性擴(kuò)張型心肌病的主要致病機(jī)制，心肌細(xì)胞LMNA基因的缺失與BRD4的激活有關(guān)；而JQ-1可部分恢復(fù)失調(diào)基因的表達(dá)，提高LMNA基因敲除小鼠模型的存活率，改善心功能，抑制心肌纖維化和細(xì)胞凋亡[31]。綜上，調(diào)控BRD4或可成為心肌病治療的潛在靶點(diǎn)。

5 BRD4在肺動(dòng)脈高壓(pulmonary artery hypertension, PAH)中的作用

PAH是一種以肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMC)增殖和凋亡抑制為特征的血管病變。BRD4在PAH中表達(dá)增加[32]，而RVX-208可通過(guò)阻斷BRD4-FOXM1-PLK1信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)不同PAH模型大鼠的血管重構(gòu)，改善右心室功能和肺血流動(dòng)力學(xué)[33]。此前，JQ-1也被報(bào)道可以顯著改善PAH大鼠模型的肺血流動(dòng)力學(xué)，降低肺動(dòng)脈壁厚度，逆轉(zhuǎn)PAH[34]。作為PAH血管重塑的重要組成部分，血管生成是一個(gè)多步驟的過(guò)程，依賴于內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移到周圍組織并分化為新的毛細(xì)血管。體外研究[35]結(jié)果表明，BRD4通過(guò)調(diào)節(jié)p21激活激酶1和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體介導(dǎo)的內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的增殖、遷移和重組，促進(jìn)血管生成。正在進(jìn)行的一項(xiàng)針對(duì)RVX-208治療PAH的臨床試驗(yàn)(NCT03655704)已經(jīng)顯示出良好的安全性，預(yù)期結(jié)果值得期待。

6 BRD4在高血壓中的作用

Yang等[36]的研究結(jié)果顯示，BRD4在原發(fā)性高血壓患者中表達(dá)增加，并與患者的血壓呈正相關(guān)。抑制BRD4可顯著降低高血壓大鼠血漿AngⅡ和內(nèi)皮素-1(ET-1)水平，顯著升高一氧化氮合酶(NOS)和NO水平；經(jīng)BRD4抑制劑治療后，自發(fā)性高血壓大鼠血漿中超氧化物歧化酶活性顯著增強(qiáng)，而丙二醛、IL-6和TNF-α水平顯著降低，提示BRD4可能也參與高血壓病的調(diào)節(jié)過(guò)程[36]。

7 展 望

作為表觀遺傳信息的“讀取器”，BRD4通過(guò)識(shí)別乙?；M蛋白、向染色質(zhì)招募轉(zhuǎn)錄因子和共激活因子來(lái)控制基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的起始和延伸。BRD4有助于協(xié)調(diào)涉及內(nèi)皮、血管平滑肌細(xì)胞、炎癥和心肌的轉(zhuǎn)錄程序，指導(dǎo)分化、細(xì)胞特性和細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變，以應(yīng)對(duì)心血管系統(tǒng)中常見(jiàn)的病理變化。然而，表觀遺傳調(diào)控因子無(wú)處不在的特點(diǎn)給心血管疾病的靶向表觀遺傳療法的開(kāi)發(fā)帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。盡管抑制BRD4對(duì)AS、心力衰竭、高血壓、心肌病和PAH等心血管疾病表現(xiàn)出潛在治療價(jià)值，但抑制或激活這些調(diào)節(jié)因子不具有心血管特異性，可能還具有多效性和靶外毒副作用。因此，針對(duì)BRD4進(jìn)行心血管藥物研究時(shí)，有必要對(duì)不同類型的心血管疾病和組織細(xì)胞開(kāi)展特異性研究，確定心血管疾病特異性基因及其相應(yīng)的表觀遺傳調(diào)節(jié)因子，并在表觀遺傳改變和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)之間建立網(wǎng)絡(luò)，為開(kāi)發(fā)更具組織特異性和無(wú)明顯毒副作用的BET抑制劑提供基礎(chǔ)。