微小RNA-K1-5p調(diào)控G1/S期相關(guān)基因的表達(dá)影響內(nèi)皮細(xì)胞周期

張靜，彭靖淇

卡波西肉瘤（Kaposi's sarcoma，KS）是由KS相 關(guān)皰疹病毒（KSHV）感染內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生的梭形細(xì)胞腫瘤［1］。多見于人類免疫缺陷病毒相關(guān)的免疫缺陷綜合征（HIV-AIDS）或免疫缺陷病人［2-4］。近年來，miRNA在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引起關(guān)注［5-8］，通過與mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'UTR）結(jié)合，降解或沉默靶基因的表達(dá)［9-12］，并通過復(fù)雜機(jī)制在各種細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用［13-17］。之前的研究顯示KSHV編碼的13個miRNA，在KS中都顯著上調(diào)，其中與細(xì)胞周期密切相關(guān)的miR-K1-5p上調(diào)最為明顯［18-19］。G1∕S關(guān)卡是細(xì)胞周期最重要的檢查點(diǎn)，細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑4（CDKN4）、細(xì)胞周期蛋白A∕細(xì)胞周期素依賴性激酶2（Cyclin A∕CDK2）、細(xì)胞周期蛋白D2∕細(xì)胞周期素依賴性激酶4（Cyclin D2∕CDK4）均是G1∕S期調(diào)控的主要基因。自從KS細(xì)胞株（SLK）被證實(shí)為腎癌細(xì)胞來源后，便缺乏了可信賴的細(xì)胞株［20］，但是對于KSHV致瘤作用的研究，目前公認(rèn)的模型是將KSHV的基因組或miRNA轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）后進(jìn)行基因表型檢測［21-24］。本研究將miR-K1-5p轉(zhuǎn) 染HUVECs，探 討miR-K1-5p對CDKN4、Cyclin A∕CDK2和Cyclin D2∕CDK4的調(diào)控作用及其對內(nèi)皮細(xì)胞周期的影響。本研究進(jìn)行于2020年1—12月。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs，美國ScienCell生物公司）；RIPA裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；293T細(xì)胞（上海玉博生物科技有限公司）；Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）；miR-K1-5p模擬物（mimics）、mimics陰性對照∕NC（武漢艾斯萊德生物科技有限公司）；雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Trizol（美國Ambion公司）；miScriptSYBR Green PCR Kit試劑盒（美國VAZYME公司）；細(xì)胞周期分析試劑盒（南京凱基生物科技有限公司）；CDKN4、Cyclin A∕CDK2和Cyclin D2∕CDK4（美國BOSTER公司）；GAPDH（杭州賢至生物有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染使用密度為80%，對數(shù)生長期的HUVECs（此細(xì)胞株廣泛用于KS的研究［21-24］），以每孔1×105個細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h。設(shè)立兩組：miR-K1-5p mimics組和mimics NC組，使用Lipofectamine 2000將它們分別轉(zhuǎn)染到HUVECs中，轉(zhuǎn)染時間為48 h。

1.3 miR-K1-5p靶基因預(yù)測使用TargetScanHuman Custom 5.2和miRDB的生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-K1-5p的靶基因及靶基因3'UTR中的結(jié)合位點(diǎn)。

1.4 雙螢光素酶試驗(yàn)將野生型（WT）和突變型（MUT）CDKN4 3'UTR構(gòu)建到雙螢光素酶報(bào)告載體（pYr-miRTarget）質(zhì)粒上，將質(zhì)粒（1 μg）和miR-K1-5p mimics、mimics NC（50 nmol∕L）共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞5×104，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染24 h后，使用雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測轉(zhuǎn)染48 h后，使用RIPA裂解液從細(xì)胞中提取總蛋白。根據(jù)蛋白質(zhì)含量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。制備5%層濃縮膠和12%分離凝膠。進(jìn)行電泳，結(jié)束后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，用5%脫脂奶粉封閉膜2 h，一抗CDKN4、Cyclin D2、CDK2、CDK4均稀釋（1∶1 000）、Cyclin A稀釋（1∶500）、GAPDH稀釋（1∶1 000）在4℃下孵育過夜，HRP二抗稀釋（1∶10 000）在37℃下孵育2 h；而后增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光成像；灰度值分析。

1.6 q-PCR檢測轉(zhuǎn)染48 h后，從細(xì)胞中提取總RNA（需1mL Trizol）。使 用miScriptSYBR Green PCR Kit試劑盒定量mRNA和miRNA表達(dá)水平。PCR反應(yīng)條件為：在95℃下預(yù)變性10 min，在95℃下15 s，在60℃下60 s進(jìn)行40個周期。采用2-ΔΔCt相對定量法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。其中U6為miRNA內(nèi)參引物；GADPH為mRNA內(nèi)參引物，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 細(xì)胞周期分析miR-K1-5p mimics、mimics NC分別轉(zhuǎn)染HUVECs細(xì)胞中，48 h后收獲1×105細(xì)胞，用200 μL細(xì)胞液離心5 min，用PBS洗滌細(xì)胞2次，使用細(xì)胞周期分析試劑盒檢測：向細(xì)胞中添加RNase A溶液（20 μL），使用PI染料溶液（400 μL），最后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法SPSS 20.0軟件用于統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)經(jīng)過正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)。正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示。t檢驗(yàn)用于單變量兩組資料之間的比較。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-K1-5p的表達(dá)水平miR-K1-5p mimics和mimics NC轉(zhuǎn)染HUVECs細(xì)胞。48 h后，q-PCR結(jié)果顯示miR-K1-5p mimics組表達(dá)水平0.91±0.08明顯高于mimics NC組表達(dá)水平0.00±0.00（t=19.54，P＜0.001），40個循環(huán)未檢測出∕低于檢測下限。

2.2 miR-K1-5p靶基因的預(yù)測靶基因的預(yù)測結(jié)果：TargetScan Human Custom顯示有637個靶基因，miRDB顯示有1 102個靶基因，取交集顯示有354個靶基因。miR-K1-5p靶基因的功能主要富集在細(xì)胞周期、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、表達(dá)調(diào)控等。其中靶基因CDKN4與細(xì)胞周期的調(diào)控密切相關(guān)。圖1示CDKN4 3'UTR與miR-K1-5p的結(jié)合位點(diǎn)。

圖1 CDKN4 3'UTR與miR-K1-5p的結(jié)合位點(diǎn)

2.3 miR-K1-5p靶向CDKN4基因?qū)iR-K1-5p mimics+CDKN4-WT、mimics NC+CDKN4-WT、miRK1-5p mimics+CDKN4-MUT和mimics NC+CDKN4-MUT分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。24 h后測定各組螢光素酶活性，miR-K1-5p mimics+CDKN4-WT組明顯低于其余組的螢光素酶活性（P＜0.01）；轉(zhuǎn)染miR-K1-5p mimics后，CDKN4蛋 白∕mRNA表 達(dá) 水 平 均 低 于mimics NC組（P＜0.01）。因此，CDKN4是miR-K1-5p直接作用的靶基因。miR-K1-5p可以負(fù)性調(diào)控CDKN4的表達(dá)。見表2。

表2 相對螢光素酶活性、CDKN4蛋白及mRNA相對表達(dá)比較±s

表2 相對螢光素酶活性、CDKN4蛋白及mRNA相對表達(dá)比較±s

注：miR-K1-5p mimics為miR-K1-5p模擬物，mimics NC為模擬物陰性對照，CDKN4-WT為細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑4野生型螢光素酶載體，CDKN4-MUT為細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑4突變型螢光素酶載體。①與mimics NC組相比，P＜0.01。

組別mimics NC miR-K1-5p mimics t值P值重復(fù)次數(shù)3 3 CDKN4-WT 0.81±0.04 0.42±0.05①17.73＜0.001 CDKN4-MUT 0.80±0.05 0.82±0.03 0.93 0.364 CDKN4蛋白0.28±0.02 0.11±0.01①12.91＜0.001 CDKN4 mRNA 1.00±0.01 0.33±0.02①47.90＜0.001

2.4 轉(zhuǎn)染后Cyclin A/CDK2蛋白及mRNA的相對表達(dá)量轉(zhuǎn)染48 h后結(jié)果顯示：與mimics NC組相比，miR-K1-5p過表達(dá)顯著增加Cyclin A∕CDK2蛋白和mRNA的表達(dá)水平（P＜0.01）。因此，miR-K1-5p可以正性調(diào)控Cyclin A∕CDK2的表達(dá)。見表3。

實(shí)驗(yàn)二的詞匯測試結(jié)束后，要求兩組學(xué)生如實(shí)填寫查閱了哪些單詞，用以確定各組查閱目標(biāo)詞的人次，結(jié)果表明，兩組學(xué)生不同程度地查閱了目標(biāo)詞的用法。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下：

表3 Cyclin A/CDK2蛋白及mRNA相對表達(dá)量比較

表3 Cyclin A/CDK2蛋白及mRNA相對表達(dá)量比較

注：mimics為模擬物，mimics NC為模擬物陰性對照，Cyclin A為細(xì)胞周期蛋白A，CDK2為細(xì)胞周期素依賴性激酶2。①與mimics NC組，P＜0.01。

組別mimics NC mimics t值P值重復(fù)次數(shù)3 3 Cyclin A蛋白0.05±0.01 0.13±0.01①10.61＜0.001 CDK2蛋白0.21±0.02 0.65±0.04①16.50＜0.001 Cyclin A mRNA 0.99±0.08 2.94±0.13①22.66＜0.001 CDK2 mRNA 1.02±0.09 1.96±0.3①5.02 0.007

2.5 轉(zhuǎn)染后Cyclin D2/CKD4蛋白及mRNA的相對表達(dá)量轉(zhuǎn)染48 h后，行蛋白質(zhì)印跡法和q-PCR檢測Cyclin D2∕CDK4蛋白和mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與mimics NC相比，miR-K1-5p mimics顯著增加了Cyclin D2∕CDK4蛋白和mRNA表達(dá)水平（P＜0.05）。因此，miR-K1-5p可以正性調(diào)控Cyclin D2∕CDK4的表達(dá)。見表4。

表4 Cyclin D2/CDK4蛋白及mRNA相對表達(dá)量比較

表4 Cyclin D2/CDK4蛋白及mRNA相對表達(dá)量比較

注：mimics為模擬物，mimics NC為模擬物陰性對照，Cyclin D2為細(xì)胞周期蛋白D2，CDK4為細(xì)胞周期素依賴性激酶4。①與mimics NC組，P＜0.01。

組別mimics NC mimics t值P值重復(fù)次數(shù)3 3 Cyclin D2蛋白0.28±0.03 0.56±0.03①10.68＜0.001 CDK4蛋白0.19±0.04 0.43±0.05①7.03 0.002 Cyclin D2 mRNA 1.03±0.06 1.67±0.30①3.92 0.017 CDK4 mRNA 1.00±0.07 1.64±0.24①4.39 0.012

2.6 CDKN4、Cyclin A、Cyclin D2、CDK、CDK4的western blotting電泳圖蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果示：mimics組CDKN4的蛋白表達(dá)水平低于mimics NC組；mimics組Cyclin A、Cyclin D2、CDK、CDK4的蛋白表達(dá)水平高于mimics NC組。見圖2。

圖2 CDKN4∕Cyclin A∕CDK2∕Cyclin D2∕CDK4蛋白質(zhì)印跡電泳圖

2.7 miR-K1-5p對細(xì)胞周期的影響轉(zhuǎn)染后顯示mimics組的PI值（PI=S+G2期∕G1+S+G2期；PI為增殖活性指數(shù)，PI值越大，細(xì)胞周期變短、增殖變快）及S期、G2期比值均高于mimics NC組（P＜0.05）；mimics組的G1期比值低于mimics NC組（P＜0.01），見表5；細(xì)胞周期流式圖見圖3，因此，miR-K1-5p可以使細(xì)胞周期進(jìn)展加速，促進(jìn)細(xì)胞增殖和G1∕S期轉(zhuǎn)換。

表5 轉(zhuǎn)染后對HUVECs細(xì)胞周期影響比較/（%

表5 轉(zhuǎn)染后對HUVECs細(xì)胞周期影響比較/（%

注：HUVECs為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，mimics為模擬物，mimics NC為模擬物陰性對照。

組別mimics mimics NC 3 t值p值重復(fù)次數(shù)3 S+G2期∕G1+S+G2期23.37±0.29 15.00±0.75 18.03＜0.001 G1期76.63±0.28 85.00±0.76 17.96＜0.001 S期15.34±0.36 8.45±0.20 28.86＜0.001 G2期8.02±0.17 6.55±0.80 3.11 0.04

圖3 轉(zhuǎn)染后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）細(xì)胞周期流式圖：A為mimics NC組；B為mimics組

3 討論

KS是一種起源于內(nèi)皮細(xì)胞的血管肉瘤［25］。KSHV是7種可導(dǎo)致人類惡性腫瘤的病毒之一，是KS的重要致病因子［2-3］。KSHV主要通過編碼miRNA對KS產(chǎn)生影響，KSHV miRNAs可以調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的分化，影響其細(xì)胞周期，最終誘導(dǎo)癌變發(fā)生［26-28］。研究miRNAs在KS和癌旁組織中的差異表達(dá)，結(jié)果顯示69個miRNAs的表達(dá)上調(diào)；101個miRNA表達(dá)下調(diào)，特別是KSHV編碼的miR-K1-5p表達(dá)上調(diào)最為顯著［18］。因此高表達(dá)的miR-K1-5p可能在KS中發(fā)揮重要作用。GO和KEGG信號通路分析表明：miR-K1-5p主要參與細(xì)胞周期信號通路，通過它的靶基因介導(dǎo)信號通路發(fā)揮作用。CDKN4（miRK1-5p的靶基因）、Cyclin A∕CDK2、Cyclin D2∕CDK4是該通路中G1∕S期的關(guān)鍵基因，G1∕S關(guān)卡是細(xì)胞周期中最主要的調(diào)控點(diǎn)，因此研究miR-K1-5p對CDKN4、Cyclin A∕CDK2、Cyclin D2∕CDK4的調(diào)控作用具有重要意義。

細(xì)胞周期依賴于精準(zhǔn)調(diào)控。調(diào)控體系中細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子CKI、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK、細(xì)胞周期蛋白Cyclin均發(fā)揮重要作用；CDK結(jié)合Cyclin使細(xì)胞不斷增殖、分裂；而CKI與Cyclin競爭結(jié)合CDK或優(yōu)先結(jié)合Cyclin∕CDK復(fù)合物，發(fā)揮抑制作用。它們共同參與細(xì)胞周期的正常循環(huán)。當(dāng)CKI丟失、Cyclin∕CDK表達(dá)異常、檢測點(diǎn)發(fā)生變化，可能導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，細(xì)胞增殖失控，腫瘤形成。CDKN4作為一種CKI因子，抑制G1期進(jìn)程，負(fù)性調(diào)控Cyclin∕CDK，避免DNA錯誤復(fù)制。其表達(dá)減少促進(jìn)瘤細(xì)胞G1∕S期轉(zhuǎn)化，使大量瘤細(xì)胞進(jìn)入S期，加速瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。Cyclin A在G1晚期表達(dá)，近年來，在許多人類腫瘤中發(fā)現(xiàn)Cyclin A過表達(dá)，抑制其表達(dá)，可使腫瘤細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)受阻，引起腫瘤細(xì)胞死亡，具有靶向治療的良好前景。Cyclin D2既往研究較少，它由CCND2基因編碼，由5個外顯子及4個內(nèi)含子構(gòu)成，G1早期表達(dá)，能促進(jìn)細(xì)胞增殖，在結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌等腫瘤中可見Cyclin D2的異常表達(dá)［29］。CDK自身不與底物反應(yīng)，形成CDK∕Cyclin復(fù)合物時才能表現(xiàn)出活性，參與細(xì)胞周期的調(diào)控，不同細(xì)胞周期時相產(chǎn)生不同的Cyclin∕CDK復(fù)合物，促進(jìn)時相之間的轉(zhuǎn)換，CDK2和CDK4是G1-S轉(zhuǎn)換的主要限速因子，形成CyclinA∕CDK2和Cyclin D2∕CDK4復(fù)合物促進(jìn)G1-S轉(zhuǎn)換。

本研究通過雙螢光素酶試驗(yàn)證實(shí)CDKN4是miR-K1-5p的靶基因；miR-K1-5p對CDKN4、Cyclin A∕CDK2、Cyclin D2∕CDK4具 有 明 顯 的 調(diào) 控 作 用。miR-K1-5p mimics轉(zhuǎn)染HUVECs細(xì)胞后，CDKN4蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著下調(diào)；Cyclin A∕CDK2、Cyclin D2∕CDK4蛋 白 及其mRNA表 達(dá) 水 平顯 著 上調(diào)。推測miR-K1-5p作為一種KSHV miRNA，在轉(zhuǎn)錄后通過抑制靶基因CDKN4的表達(dá)。發(fā)揮其調(diào)控細(xì)胞周期的功能。CDKN4作為G1∕S期重要監(jiān)控因子，扮演交通紅燈的作用，miR-K1-5p減少CDKN4表達(dá)，使其原始功能喪失，解除或減弱了對Cyclin A∕CDK2和Cyclin D2∕CDK4的抑制，細(xì)胞增殖失控，細(xì)胞周期信號通路異常激活，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。此外，本研究采用PI法研究miR-K1-5p對HUVECs細(xì)胞周期的影響。如數(shù)據(jù)所示，miR-K1-5p過表達(dá)后，G1期時長減短，S期和G2期細(xì)胞數(shù)量顯著增加。因此，miR-K1-5p促進(jìn)了G1∕S期轉(zhuǎn)變，抑制HUVECs細(xì)胞凋亡，促進(jìn)HUVECs細(xì)胞增殖。

綜上，研究證實(shí)了上調(diào)miR-K1-5p的表達(dá)，減少了CDKN4表達(dá)，增加了Cyclin A和Cyclin D2的表達(dá)，提高了CDK2和CDK4的活性，使腫瘤細(xì)胞無限增殖；反之即可抑制腫瘤性的增殖。鑒于miR-K1-5p作為促癌基因?qū)?xì)胞周期具有顯著的調(diào)控作用，它很可能成為KS的一個新的治療靶點(diǎn)。