AQC柱前衍生/UPLC－MS/MS測(cè)定蜂蜜中的內(nèi)源性氨基酸和?；撬岢煞?/h1>
2023-01-05 11:16:28盧蘭香武傳香魏莉莉祝建華劉艷明
分析測(cè)試學(xué)報(bào) 2022年12期
盧蘭香，鄭 紅，武傳香，魏莉莉，丁 一，王 駿，祝建華，劉艷明，薛 霞
（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院 國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（肉及肉制品監(jiān)管技術(shù)），山東省食品藥品安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250101）
蜂蜜是由蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物結(jié)合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)［1－2］。其主要成分有葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖等，還含有蛋白質(zhì)、酚類物質(zhì)、氨基酸、?；撬岬榷喾N微量成分［3］。蜂蜜兼具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥理作用，是不可多得的保健食品［4］。游離氨基酸是蜂蜜中一類重要的營(yíng)養(yǎng)素，占蜂蜜總量的1%左右，包括蛋白質(zhì)氨基酸以及非蛋白質(zhì)氨基酸。牛磺酸結(jié)構(gòu)與氨基酸類似，是天然牛黃的主要成分之一。?；撬岬拇嬖谪S富了蜂蜜的營(yíng)養(yǎng)成分，對(duì)蜂蜜的藥理作用做了合理的解釋［5］。
隨著蜂蜜需求量的不斷擴(kuò)大，蜂蜜產(chǎn)業(yè)的特殊性導(dǎo)致蜂蜜產(chǎn)量供不應(yīng)求，摻假現(xiàn)象嚴(yán)重。摻假的主要手段是向蜂蜜中添加與蜂蜜組分相近的外源性糖類，如玉米糖漿、麥芽糖漿、蔗糖糖漿等［6］。國(guó)內(nèi)外報(bào)道了多種鑒別蜂蜜真?zhèn)蔚姆椒?，但均不能從根本上解決蜂蜜摻假鑒別問(wèn)題，還需要對(duì)蜂蜜中更多的特異性成分進(jìn)行分析，以完善蜂蜜真?zhèn)舞b別技術(shù)。蜂蜜中游離氨基酸的種類和含量因花源、地域和氣候的不同而有差異，可用于鑒別蜂蜜摻假、種類和產(chǎn)地［7］。食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 32946－2016［8］僅規(guī)定了脯氨酸的測(cè)定方法，對(duì)于蜂蜜真?zhèn)舞b別具有很大的局限性。此外，目前關(guān)于蜂蜜中氨基酸的研究多局限于某一種或幾種特定氨基酸的測(cè)定或單花蜜。因此，建立蜂蜜中多種氨基酸和?；撬岬葍?nèi)源性成分的分析方法，對(duì)于蜂蜜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)、品質(zhì)及摻偽鑒別至關(guān)重要。
目前，氨基酸和?；撬岬臋z測(cè)方法主要有氨基酸分析儀［9－10］、高效液相色譜法［11－18］、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［19－26］等。常規(guī)的氨基酸分析儀用途單一、靈活性差、普適性差、分析時(shí)間長(zhǎng)。液相色譜法雖然普適性廣，但存在一定的局限性，必須嚴(yán)格優(yōu)化色譜條件，以確保所有組分完全分離才能準(zhǔn)確定量。液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法可以分離不同質(zhì)荷比的共洗脫化合物，有效減少色譜運(yùn)行時(shí)間，具有靈敏度高、選擇性好、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，更適于性質(zhì)相近的多種目標(biāo)化合物的檢測(cè)。氨基酸和?；撬岬臋z測(cè)技術(shù)主要有直接測(cè)定和間接分析兩種。由于氨基酸與?；撬釤o(wú)發(fā)色基團(tuán)，無(wú)法采用常規(guī)紫外或熒光檢測(cè)器直接測(cè)定；且二者極性強(qiáng)、分子量小，其特征離子受基體干擾嚴(yán)重，亦不適合質(zhì)譜檢測(cè)器檢測(cè)，因此常采用基于化學(xué)衍生化的色譜或質(zhì)譜分析方法進(jìn)行間接測(cè)定。通過(guò)化學(xué)衍生化法改變目標(biāo)物的分子結(jié)構(gòu)以及色譜與質(zhì)譜特性，可提高方法靈敏度。常用的衍生化試劑有異硫氰酸苯酯（PITC）、鄰苯二甲醛（OPA）、6-氨基喹啉基-N-羥基-琥珀酰亞氨基甲酸酯（AQC）、茚三酮，但多數(shù)衍生化操作存在過(guò)程繁瑣、穩(wěn)定性差、副產(chǎn)物有干擾或毒性。AQC能與一級(jí)、二級(jí)氨基酸反應(yīng)，生成穩(wěn)定的衍生物脲，操作簡(jiǎn)單、副反應(yīng)少，不受樣品基質(zhì)干擾，更適用于復(fù)雜基質(zhì)樣本中氨基酸及?；撬岬姆治觥?/p>
本研究基于AQC衍生法，采用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)蜂蜜中的內(nèi)源性氨基酸和?；撬徇M(jìn)行定性和定量分析，可為蜂蜜的質(zhì)量控制提供依據(jù)，為蜂蜜營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和品質(zhì)評(píng)價(jià)以及蜂蜜摻假鑒別提供新途徑。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 儀器與試劑
天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、組氨酸（His）、絲氨酸（Ser）、精氨酸（Arg）、酪氨酸（Tyr）、纈氨酸（Val）、蘇氨酸（Thr）、蛋氨酸（Met）、賴氨酸（Lys）、脯氨酸（Pro）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、谷氨酰胺（Gln）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）購(gòu)于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH；甘氨酸（Gly）購(gòu)于中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；羥脯氨酸（Hyp）、胱氨酸（Cys）、丙氨酸（Ala）、瓜氨酸（Cit）購(gòu)于北京曼哈格生物科技有限公司；鳥氨酸（Orn）購(gòu)于上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；牛磺酸（Tau）購(gòu)于美國(guó)Sigma－Aldrich公司；天冬酰胺（Asn）購(gòu)于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；12種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液內(nèi)標(biāo)（甘氨酸－13C－15N濃度為2 500 μmol/L，其余均為500 μmol/L）購(gòu)于Cambridge Isotope Laboratories Inc.公司。AccQFluorTM氨基酸衍生試劑盒（配有AccQ－Fluor硼酸鹽緩沖液、AccQ－Fluor衍生劑）購(gòu)于美國(guó)Waters公司。
實(shí)驗(yàn)用天然成熟蜂蜜均購(gòu)自當(dāng)?shù)胤滢r(nóng)，其它蜂蜜和糖漿均購(gòu)自當(dāng)?shù)爻谢蚓W(wǎng)絡(luò)途徑購(gòu)買。
1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
分別準(zhǔn)確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，配制成10.0 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，加入適量?jī)?nèi)標(biāo)配制成系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（0.1～200 μmol/L）。
1.3 樣品前處理
提取：稱取1 g（精確至0.000 1 g）蜂蜜樣品置于15 mL離心管中，加入適量超純水，渦旋混勻至溶解，超聲提取10 min。將溶液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用超純水定容至10 mL。充分搖勻，精確量取1 mL至5 mL容量瓶中，加入50 μL 12種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液內(nèi)標(biāo)，用超純水定容至5 mL，經(jīng)0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜過(guò)濾后待用。
衍生：取10 μL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液或上述樣品提取液與70 μL AccQ－Fluor硼酸鹽緩沖液混合，加入20 μL AccQ－Fluor衍生劑渦旋混合后，置于55℃烘箱中加熱10 min，冷卻至室溫后上機(jī)測(cè)定。
空白實(shí)驗(yàn)：除不加試樣外，其余操作步驟與試樣相同。
1.4 分析條件
1.4.1 色譜條件色譜柱：AccQ－Tag Ultra C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：A為10 mmol/L甲酸銨溶液，B為乙腈；進(jìn)樣體積：1 μL；柱溫：40℃；梯度洗脫程序：0～1.0 min，99%A；1.0～11.0 min，99%～92.5%A；11.0～15.0 min，92.5%～85%A；15.0～19.0 min，85%～77%A；19.0～19.01 min，77%～10% A；19.01～21.0 min，10% A；21.0～21.01 min，10%～99% A；21.01～23.0 min，99%A。
跳出禁養(yǎng)區(qū)：如果你的養(yǎng)殖場(chǎng)在禁養(yǎng)區(qū)內(nèi)，且超出地方政府的規(guī)模養(yǎng)殖標(biāo)準(zhǔn)，與其等著受罰，不如主動(dòng)配合進(jìn)行搬遷，趁早離開，尋求新的發(fā)展。
1.4.2 質(zhì)譜條件離子源：噴射流電噴霧離子源；離子化模式：正離子模式（ESI+）；干燥氣溫度：250℃；干燥氣流速：7 L/min；霧化氣壓力：310 275 Pa（45 psi）；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流速：12 L/min；毛細(xì)管電壓：4 000 V；噴嘴電壓：0 V；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。24種目標(biāo)化合物及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)見表1。
表1 24種目標(biāo)化合物及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Optimized parameters of MS/MS for 24 analytes and their internal standards
（續(xù)表1）
1.5 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)
通過(guò)在純?nèi)軇┡c樣品中添加相同濃度的同位素內(nèi)標(biāo)，測(cè)定二者的峰面積響應(yīng)值，評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)（ME）。ME（%）=（A-B）/A×100［27］，其中ME為基質(zhì)效應(yīng)因子，A為純?nèi)軇┲袃?nèi)標(biāo)的峰面積響應(yīng)值，B為樣品提取液中內(nèi)標(biāo)的峰面積響應(yīng)值。ME為0，表示無(wú)基質(zhì)效應(yīng)；其絕對(duì)值越大則基質(zhì)效應(yīng)越強(qiáng)；ME在-15%～15%之間，表示基質(zhì)效應(yīng)影響不明顯。
1.6 數(shù)據(jù)處理
通過(guò)與儀器配套的Agilent MassHunter采集軟件和Agilent MassHunter定量分析軟件完成數(shù)據(jù)采集與處理，Origin 8.0進(jìn)行繪圖。
2 結(jié)果與討論
2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化
2.1.1 提取溶劑的選擇蜂蜜中大量的糖分、氨基酸、礦物質(zhì)等易溶于水，水系溶劑能使樣品均勻分散，有利于目標(biāo)物的提取。文獻(xiàn)多采用水和鹽酸溶液提取食品中的氨基酸［25，28］，為不影響后續(xù)的衍生步驟，實(shí)驗(yàn)比較了水和0.1 mol/L HCl對(duì)蜂蜜中24種目標(biāo)物提取效果的影響。結(jié)果表明，分別用水和0.1 mol/L HCl提取時(shí)，蜂蜜樣品中24種目標(biāo)物的含量、回收率和基質(zhì)效應(yīng)均無(wú)明顯差異?；诓僮骱?jiǎn)單和環(huán)保方面考慮，實(shí)驗(yàn)選擇用水提取。
2.1.2 衍生試劑用量的選擇由于衍生試劑用量直接影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，根據(jù)蜂蜜中氨基酸與?；撬岬暮糠秶?，實(shí)驗(yàn)采用24種目標(biāo)物線性范圍上限濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察了不同體積的衍生試劑（5、10、20、30 μL）對(duì)24種目標(biāo)物衍生物峰面積的影響（圖1）。
圖1 衍生試劑用量的影響Fig.1 The influence of derivation reagent dosage
實(shí)驗(yàn)表明，隨著衍生試劑用量的增加，氨基酸和?；撬嵫苌锏姆迕娣e逐漸增加，衍生試劑用量超過(guò)20 μL后峰面積趨于平穩(wěn)；衍生試劑用量不足時(shí)，不同氨基酸的衍生效率不同。原因可能是不同氨基酸與衍生試劑的反應(yīng)速度不同，衍生試劑不足時(shí)不同氨基酸之間存在競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致衍生效率不同。另一方面，某些氨基酸存在2個(gè)氨基，衍生試劑不足時(shí)，只有1個(gè)氨基能衍生化生成單衍生化物質(zhì)，衍生效率降低。當(dāng)衍生試劑超過(guò)20 μL時(shí)，Asp和Glu的峰形較差。所以實(shí)驗(yàn)選擇衍生試劑的用量為20 μL。
2.2 色譜條件的優(yōu)化
2.2.1 色譜柱的選擇實(shí)驗(yàn)考察了Waters Acquity UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）和AccQ－Tag Ultra C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）兩種色譜柱對(duì)24種目標(biāo)物分離效果和基質(zhì)效應(yīng)的影響。結(jié)果表明，在Ultra C18色譜柱上，Ser與Asn、Tau與Cit、Ile與Lys不能達(dá)到基線分離；而在HSS T3色譜柱上，除上述化合物外，Cit、Tau及Thr，Arg與Ala也不能達(dá)到基線分離，Ultra C18色譜柱的分離效果更好。圖2表明，12種有同位素內(nèi)標(biāo)的目標(biāo)化合物在HSS T3色譜柱的基質(zhì)效應(yīng)明顯高于Ultra C18。因此，實(shí)驗(yàn)選擇Ultra C18色譜柱。
圖2 不同色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物基質(zhì)效應(yīng)的影響Fig.2 Effect of different chromatographic columns on the matrix effects of analytes
2.2.2 流動(dòng)相的選擇以10 mmol/L甲酸銨為水相，比較了乙腈與甲醇分別為有機(jī)相時(shí)對(duì)分離效果的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甲醇作為有機(jī)相時(shí)對(duì)目標(biāo)物的分離效果很差，因此實(shí)驗(yàn)選用乙腈為有機(jī)相。進(jìn)一步比較了10 mmol/L甲酸銨（含0.01%甲酸）、10 mmol/L甲酸銨（含0.02%甲酸）、10 mmol/L甲酸銨（含0.05%甲酸）、10 mmol/L甲酸銨（含0.1%甲酸）、10 mmol/L甲酸銨對(duì)目標(biāo)物分離效果、靈敏度和峰形的影響。結(jié)果表明，上述分離體系的分離效果和目標(biāo)物峰形無(wú)明顯差異，但隨著甲酸比例的增加，氨基酸和牛磺酸衍生物的峰面積響應(yīng)值逐漸降低，在乙腈-10 mmol/L甲酸銨體系中的峰面積響應(yīng)值和靈敏度最高，所以實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-10 mmol/L甲酸銨作為流動(dòng)相。
由于流動(dòng)相濃度也是影響分離效果、靈敏度和峰形的重要因素，因此比較了甲酸銨溶液濃度（5、10、20 mmol/L）對(duì)24種目標(biāo)物分離效果的影響。實(shí)驗(yàn)表明，甲酸銨溶液濃度為5 mmol/L時(shí)目標(biāo)化合物的峰形差，甲酸銨溶液濃度為10 mmol/L和20 mmol/L時(shí)的分離效果、靈敏度和峰形幾乎無(wú)差異。因此，選擇甲酸銨溶液的濃度為10 mmol/L。
2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化
在電噴霧正離子模式下，對(duì)500 μmol/L的各目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生后進(jìn)行全掃描，得到每個(gè)目標(biāo)化合物的分子離子及優(yōu)化的離子源參數(shù)；然后對(duì)其分子離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，確定2個(gè)特征碎片離子，優(yōu)化每對(duì)離子所需的電壓和碰撞能，最后以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行掃描，優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見表1?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液（20 μmol/L）的總離子流圖見圖3。
圖3 氨基酸與?；撬峄旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液（20 μmol/L）的總離子流色譜圖Fig.3 Total ion chromatogram of amino acids and taurine mixed standard solution（20 μmol/L）
2.4 基質(zhì)效應(yīng)
由于氨基酸和?；撬崾欠涿壑幸活愔匾臓I(yíng)養(yǎng)素，屬于蜂蜜的內(nèi)源性物質(zhì)，無(wú)空白樣品，無(wú)法使用空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法進(jìn)行定量，所以實(shí)驗(yàn)采用同位素內(nèi)標(biāo)消除基質(zhì)干擾，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量。在液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜中，同位素內(nèi)標(biāo)的引入是有效抵消基質(zhì)影響，提高分析方法準(zhǔn)確性及穩(wěn)定性的最有效方法［27］。研究發(fā)現(xiàn)，本方法的ME為-15.0%～15.0%，表明基質(zhì)效應(yīng)影響較小。
2.5 方法學(xué)評(píng)價(jià)
2.5.1 線性范圍、檢出限與定量下限將“1.2”配制的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按“1.3”衍生后，按濃度由低到高的順序依次經(jīng)UPLC－MS/MS進(jìn)行測(cè)定，以各目標(biāo)化合物的濃度（X，μmol/L）為橫坐標(biāo)，各目標(biāo)化合物的峰面積與其內(nèi)標(biāo)峰面積之比（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。24種目標(biāo)物在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）均不小于0.993 0（見表2）。以信噪比S/N≥3得到目標(biāo)化合物的檢出限（LOD），以S/N≥10得到目標(biāo)化合物的定量下限（LOQ）。如表2所示，24種目標(biāo)物的LOD為0.03～0.15 μmol/L，LOQ為0.1～0.5 μmol/L，均遠(yuǎn)低于食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 32946－2016［8］和文獻(xiàn)［28］報(bào)道的方法。本方法可滿足上述氨基酸與?；撬岫糠治龅囊?。
表2 24種目標(biāo)化合物的線性關(guān)系、檢出限、定量下限、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 2 Linear relations，limits of detection，limits of quantitation，recoveries and relative standard deviations of 24 analytes（n=6）
2.5.2 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差選取某洋槐蜂蜜進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)。樣品中低于檢出限的目標(biāo)化合物按LOQ、5倍LOQ、10倍LOQ，已知含量的目標(biāo)化合物按其含量的50%、100%、150%，分別添加低、中、高3個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，各水平平行測(cè)定6次。由表2可知，24種目標(biāo)物在3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率為90.5%～109%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.2%～4.7%。本方法的準(zhǔn)確度和精密度均滿足實(shí)際樣品分析要求。
2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定
利用本方法對(duì)39批次天然成熟的真蜂蜜（棗花蜂蜜、洋槐蜂蜜、荊條蜂蜜各13批次）、39批次摻假蜂蜜（廉價(jià)蜂蜜中經(jīng)檢測(cè)確認(rèn)較大概率為摻假蜂蜜的樣品，棗花蜂蜜、洋槐蜂蜜、荊條蜂蜜各13批次）、果葡糖漿、甜菜糖漿、麥芽糖漿、大米糖漿等10批次糖漿進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：糖漿中24種目標(biāo)物均未檢出。不同種類的真、摻假蜂蜜檢測(cè)結(jié)果見表3。不同蜜源蜂蜜中除Cit、Cys和Met均未檢出外，其余目標(biāo)化合物的組成及含量存在明顯差異，這與蜜源植物花粉本身、地理環(huán)境、氣候有關(guān)。不同種類的真蜂蜜中Pro和Phe的含量最高，且在荊條蜜和棗花蜜中的含量均高于洋槐蜂蜜。摻假蜂蜜中目標(biāo)化合物的組成及含量與真蜂蜜存在明顯差異，原因可能與蜂蜜中摻假糖漿的比例有關(guān)。
表3 不同蜂蜜中24種目標(biāo)化合物的含量比較（n=3）Table 3 Comparison of the contents for 24 analytes in different honey samples（n=3） w/（mg·kg-1）
3 結(jié)論
本文基于AQC柱前衍生和UPLC－MS/MS技術(shù)，建立了蜂蜜中內(nèi)源性氨基酸和?；撬岢煞值姆治龇椒ā悠方?jīng)水提取，AQC衍生，采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，并利用質(zhì)譜的高選擇性，獲得了穩(wěn)定良好的測(cè)定結(jié)果。該方法操作簡(jiǎn)單、選擇性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，靈敏度高，適用于蜂蜜中23種內(nèi)源性氨基酸和?；撬岬亩ㄐ远糠治?。利用該方法對(duì)實(shí)際蜂蜜樣品進(jìn)行檢測(cè)，并將棗花蜂蜜、洋槐蜂蜜、荊條蜂蜜及糖漿的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了比較。本研究為蜂蜜的質(zhì)量控制提供了技術(shù)支持，為蜂蜜營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和品質(zhì)評(píng)價(jià)提供了依據(jù)，對(duì)于蜂蜜摻假鑒別和類別鑒定具有重要意義。
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盧蘭香，鄭 紅，武傳香，魏莉莉，丁 一，王 駿，祝建華，劉艷明，薛 霞
（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院 國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（肉及肉制品監(jiān)管技術(shù)），山東省食品藥品安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250101）
蜂蜜是由蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物結(jié)合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)［1－2］。其主要成分有葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖等，還含有蛋白質(zhì)、酚類物質(zhì)、氨基酸、?；撬岬榷喾N微量成分［3］。蜂蜜兼具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥理作用，是不可多得的保健食品［4］。游離氨基酸是蜂蜜中一類重要的營(yíng)養(yǎng)素，占蜂蜜總量的1%左右，包括蛋白質(zhì)氨基酸以及非蛋白質(zhì)氨基酸。牛磺酸結(jié)構(gòu)與氨基酸類似，是天然牛黃的主要成分之一。?；撬岬拇嬖谪S富了蜂蜜的營(yíng)養(yǎng)成分，對(duì)蜂蜜的藥理作用做了合理的解釋［5］。
隨著蜂蜜需求量的不斷擴(kuò)大，蜂蜜產(chǎn)業(yè)的特殊性導(dǎo)致蜂蜜產(chǎn)量供不應(yīng)求，摻假現(xiàn)象嚴(yán)重。摻假的主要手段是向蜂蜜中添加與蜂蜜組分相近的外源性糖類，如玉米糖漿、麥芽糖漿、蔗糖糖漿等［6］。國(guó)內(nèi)外報(bào)道了多種鑒別蜂蜜真?zhèn)蔚姆椒?，但均不能從根本上解決蜂蜜摻假鑒別問(wèn)題，還需要對(duì)蜂蜜中更多的特異性成分進(jìn)行分析，以完善蜂蜜真?zhèn)舞b別技術(shù)。蜂蜜中游離氨基酸的種類和含量因花源、地域和氣候的不同而有差異，可用于鑒別蜂蜜摻假、種類和產(chǎn)地［7］。食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 32946－2016［8］僅規(guī)定了脯氨酸的測(cè)定方法，對(duì)于蜂蜜真?zhèn)舞b別具有很大的局限性。此外，目前關(guān)于蜂蜜中氨基酸的研究多局限于某一種或幾種特定氨基酸的測(cè)定或單花蜜。因此，建立蜂蜜中多種氨基酸和?；撬岬葍?nèi)源性成分的分析方法，對(duì)于蜂蜜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)、品質(zhì)及摻偽鑒別至關(guān)重要。
目前，氨基酸和?；撬岬臋z測(cè)方法主要有氨基酸分析儀［9－10］、高效液相色譜法［11－18］、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［19－26］等。常規(guī)的氨基酸分析儀用途單一、靈活性差、普適性差、分析時(shí)間長(zhǎng)。液相色譜法雖然普適性廣，但存在一定的局限性，必須嚴(yán)格優(yōu)化色譜條件，以確保所有組分完全分離才能準(zhǔn)確定量。液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法可以分離不同質(zhì)荷比的共洗脫化合物，有效減少色譜運(yùn)行時(shí)間，具有靈敏度高、選擇性好、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，更適于性質(zhì)相近的多種目標(biāo)化合物的檢測(cè)。氨基酸和?；撬岬臋z測(cè)技術(shù)主要有直接測(cè)定和間接分析兩種。由于氨基酸與?；撬釤o(wú)發(fā)色基團(tuán)，無(wú)法采用常規(guī)紫外或熒光檢測(cè)器直接測(cè)定；且二者極性強(qiáng)、分子量小，其特征離子受基體干擾嚴(yán)重，亦不適合質(zhì)譜檢測(cè)器檢測(cè)，因此常采用基于化學(xué)衍生化的色譜或質(zhì)譜分析方法進(jìn)行間接測(cè)定。通過(guò)化學(xué)衍生化法改變目標(biāo)物的分子結(jié)構(gòu)以及色譜與質(zhì)譜特性，可提高方法靈敏度。常用的衍生化試劑有異硫氰酸苯酯（PITC）、鄰苯二甲醛（OPA）、6-氨基喹啉基-N-羥基-琥珀酰亞氨基甲酸酯（AQC）、茚三酮，但多數(shù)衍生化操作存在過(guò)程繁瑣、穩(wěn)定性差、副產(chǎn)物有干擾或毒性。AQC能與一級(jí)、二級(jí)氨基酸反應(yīng)，生成穩(wěn)定的衍生物脲，操作簡(jiǎn)單、副反應(yīng)少，不受樣品基質(zhì)干擾，更適用于復(fù)雜基質(zhì)樣本中氨基酸及?；撬岬姆治觥?/p>
本研究基于AQC衍生法，采用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)蜂蜜中的內(nèi)源性氨基酸和?；撬徇M(jìn)行定性和定量分析，可為蜂蜜的質(zhì)量控制提供依據(jù)，為蜂蜜營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和品質(zhì)評(píng)價(jià)以及蜂蜜摻假鑒別提供新途徑。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 儀器與試劑
天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、組氨酸（His）、絲氨酸（Ser）、精氨酸（Arg）、酪氨酸（Tyr）、纈氨酸（Val）、蘇氨酸（Thr）、蛋氨酸（Met）、賴氨酸（Lys）、脯氨酸（Pro）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、谷氨酰胺（Gln）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）購(gòu)于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH；甘氨酸（Gly）購(gòu)于中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；羥脯氨酸（Hyp）、胱氨酸（Cys）、丙氨酸（Ala）、瓜氨酸（Cit）購(gòu)于北京曼哈格生物科技有限公司；鳥氨酸（Orn）購(gòu)于上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；牛磺酸（Tau）購(gòu)于美國(guó)Sigma－Aldrich公司；天冬酰胺（Asn）購(gòu)于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；12種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液內(nèi)標(biāo)（甘氨酸－13C－15N濃度為2 500 μmol/L，其余均為500 μmol/L）購(gòu)于Cambridge Isotope Laboratories Inc.公司。AccQFluorTM氨基酸衍生試劑盒（配有AccQ－Fluor硼酸鹽緩沖液、AccQ－Fluor衍生劑）購(gòu)于美國(guó)Waters公司。
實(shí)驗(yàn)用天然成熟蜂蜜均購(gòu)自當(dāng)?shù)胤滢r(nóng)，其它蜂蜜和糖漿均購(gòu)自當(dāng)?shù)爻谢蚓W(wǎng)絡(luò)途徑購(gòu)買。
1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
分別準(zhǔn)確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，配制成10.0 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，加入適量?jī)?nèi)標(biāo)配制成系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（0.1～200 μmol/L）。
1.3 樣品前處理
提取：稱取1 g（精確至0.000 1 g）蜂蜜樣品置于15 mL離心管中，加入適量超純水，渦旋混勻至溶解，超聲提取10 min。將溶液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用超純水定容至10 mL。充分搖勻，精確量取1 mL至5 mL容量瓶中，加入50 μL 12種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液內(nèi)標(biāo)，用超純水定容至5 mL，經(jīng)0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜過(guò)濾后待用。
衍生：取10 μL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液或上述樣品提取液與70 μL AccQ－Fluor硼酸鹽緩沖液混合，加入20 μL AccQ－Fluor衍生劑渦旋混合后，置于55℃烘箱中加熱10 min，冷卻至室溫后上機(jī)測(cè)定。
空白實(shí)驗(yàn)：除不加試樣外，其余操作步驟與試樣相同。
1.4 分析條件
1.4.1 色譜條件色譜柱：AccQ－Tag Ultra C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：A為10 mmol/L甲酸銨溶液，B為乙腈；進(jìn)樣體積：1 μL；柱溫：40℃；梯度洗脫程序：0～1.0 min，99%A；1.0～11.0 min，99%～92.5%A；11.0～15.0 min，92.5%～85%A；15.0～19.0 min，85%～77%A；19.0～19.01 min，77%～10% A；19.01～21.0 min，10% A；21.0～21.01 min，10%～99% A；21.01～23.0 min，99%A。
跳出禁養(yǎng)區(qū)：如果你的養(yǎng)殖場(chǎng)在禁養(yǎng)區(qū)內(nèi)，且超出地方政府的規(guī)模養(yǎng)殖標(biāo)準(zhǔn)，與其等著受罰，不如主動(dòng)配合進(jìn)行搬遷，趁早離開，尋求新的發(fā)展。
1.4.2 質(zhì)譜條件離子源：噴射流電噴霧離子源；離子化模式：正離子模式（ESI+）；干燥氣溫度：250℃；干燥氣流速：7 L/min；霧化氣壓力：310 275 Pa（45 psi）；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流速：12 L/min；毛細(xì)管電壓：4 000 V；噴嘴電壓：0 V；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。24種目標(biāo)化合物及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)見表1。
表1 24種目標(biāo)化合物及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Optimized parameters of MS/MS for 24 analytes and their internal standards
（續(xù)表1）
1.5 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)
通過(guò)在純?nèi)軇┡c樣品中添加相同濃度的同位素內(nèi)標(biāo)，測(cè)定二者的峰面積響應(yīng)值，評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)（ME）。ME（%）=（A-B）/A×100［27］，其中ME為基質(zhì)效應(yīng)因子，A為純?nèi)軇┲袃?nèi)標(biāo)的峰面積響應(yīng)值，B為樣品提取液中內(nèi)標(biāo)的峰面積響應(yīng)值。ME為0，表示無(wú)基質(zhì)效應(yīng)；其絕對(duì)值越大則基質(zhì)效應(yīng)越強(qiáng)；ME在-15%～15%之間，表示基質(zhì)效應(yīng)影響不明顯。
1.6 數(shù)據(jù)處理
通過(guò)與儀器配套的Agilent MassHunter采集軟件和Agilent MassHunter定量分析軟件完成數(shù)據(jù)采集與處理，Origin 8.0進(jìn)行繪圖。
2 結(jié)果與討論
2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化
2.1.1 提取溶劑的選擇蜂蜜中大量的糖分、氨基酸、礦物質(zhì)等易溶于水，水系溶劑能使樣品均勻分散，有利于目標(biāo)物的提取。文獻(xiàn)多采用水和鹽酸溶液提取食品中的氨基酸［25，28］，為不影響后續(xù)的衍生步驟，實(shí)驗(yàn)比較了水和0.1 mol/L HCl對(duì)蜂蜜中24種目標(biāo)物提取效果的影響。結(jié)果表明，分別用水和0.1 mol/L HCl提取時(shí)，蜂蜜樣品中24種目標(biāo)物的含量、回收率和基質(zhì)效應(yīng)均無(wú)明顯差異?；诓僮骱?jiǎn)單和環(huán)保方面考慮，實(shí)驗(yàn)選擇用水提取。
2.1.2 衍生試劑用量的選擇由于衍生試劑用量直接影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，根據(jù)蜂蜜中氨基酸與?；撬岬暮糠秶?，實(shí)驗(yàn)采用24種目標(biāo)物線性范圍上限濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察了不同體積的衍生試劑（5、10、20、30 μL）對(duì)24種目標(biāo)物衍生物峰面積的影響（圖1）。
圖1 衍生試劑用量的影響Fig.1 The influence of derivation reagent dosage
實(shí)驗(yàn)表明，隨著衍生試劑用量的增加，氨基酸和?；撬嵫苌锏姆迕娣e逐漸增加，衍生試劑用量超過(guò)20 μL后峰面積趨于平穩(wěn)；衍生試劑用量不足時(shí)，不同氨基酸的衍生效率不同。原因可能是不同氨基酸與衍生試劑的反應(yīng)速度不同，衍生試劑不足時(shí)不同氨基酸之間存在競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致衍生效率不同。另一方面，某些氨基酸存在2個(gè)氨基，衍生試劑不足時(shí)，只有1個(gè)氨基能衍生化生成單衍生化物質(zhì)，衍生效率降低。當(dāng)衍生試劑超過(guò)20 μL時(shí)，Asp和Glu的峰形較差。所以實(shí)驗(yàn)選擇衍生試劑的用量為20 μL。
2.2 色譜條件的優(yōu)化
2.2.1 色譜柱的選擇實(shí)驗(yàn)考察了Waters Acquity UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）和AccQ－Tag Ultra C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）兩種色譜柱對(duì)24種目標(biāo)物分離效果和基質(zhì)效應(yīng)的影響。結(jié)果表明，在Ultra C18色譜柱上，Ser與Asn、Tau與Cit、Ile與Lys不能達(dá)到基線分離；而在HSS T3色譜柱上，除上述化合物外，Cit、Tau及Thr，Arg與Ala也不能達(dá)到基線分離，Ultra C18色譜柱的分離效果更好。圖2表明，12種有同位素內(nèi)標(biāo)的目標(biāo)化合物在HSS T3色譜柱的基質(zhì)效應(yīng)明顯高于Ultra C18。因此，實(shí)驗(yàn)選擇Ultra C18色譜柱。
圖2 不同色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物基質(zhì)效應(yīng)的影響Fig.2 Effect of different chromatographic columns on the matrix effects of analytes
2.2.2 流動(dòng)相的選擇以10 mmol/L甲酸銨為水相，比較了乙腈與甲醇分別為有機(jī)相時(shí)對(duì)分離效果的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甲醇作為有機(jī)相時(shí)對(duì)目標(biāo)物的分離效果很差，因此實(shí)驗(yàn)選用乙腈為有機(jī)相。進(jìn)一步比較了10 mmol/L甲酸銨（含0.01%甲酸）、10 mmol/L甲酸銨（含0.02%甲酸）、10 mmol/L甲酸銨（含0.05%甲酸）、10 mmol/L甲酸銨（含0.1%甲酸）、10 mmol/L甲酸銨對(duì)目標(biāo)物分離效果、靈敏度和峰形的影響。結(jié)果表明，上述分離體系的分離效果和目標(biāo)物峰形無(wú)明顯差異，但隨著甲酸比例的增加，氨基酸和牛磺酸衍生物的峰面積響應(yīng)值逐漸降低，在乙腈-10 mmol/L甲酸銨體系中的峰面積響應(yīng)值和靈敏度最高，所以實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-10 mmol/L甲酸銨作為流動(dòng)相。
由于流動(dòng)相濃度也是影響分離效果、靈敏度和峰形的重要因素，因此比較了甲酸銨溶液濃度（5、10、20 mmol/L）對(duì)24種目標(biāo)物分離效果的影響。實(shí)驗(yàn)表明，甲酸銨溶液濃度為5 mmol/L時(shí)目標(biāo)化合物的峰形差，甲酸銨溶液濃度為10 mmol/L和20 mmol/L時(shí)的分離效果、靈敏度和峰形幾乎無(wú)差異。因此，選擇甲酸銨溶液的濃度為10 mmol/L。
2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化
在電噴霧正離子模式下，對(duì)500 μmol/L的各目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生后進(jìn)行全掃描，得到每個(gè)目標(biāo)化合物的分子離子及優(yōu)化的離子源參數(shù)；然后對(duì)其分子離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，確定2個(gè)特征碎片離子，優(yōu)化每對(duì)離子所需的電壓和碰撞能，最后以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行掃描，優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見表1?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液（20 μmol/L）的總離子流圖見圖3。
圖3 氨基酸與?；撬峄旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液（20 μmol/L）的總離子流色譜圖Fig.3 Total ion chromatogram of amino acids and taurine mixed standard solution（20 μmol/L）
2.4 基質(zhì)效應(yīng)
由于氨基酸和?；撬崾欠涿壑幸活愔匾臓I(yíng)養(yǎng)素，屬于蜂蜜的內(nèi)源性物質(zhì)，無(wú)空白樣品，無(wú)法使用空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法進(jìn)行定量，所以實(shí)驗(yàn)采用同位素內(nèi)標(biāo)消除基質(zhì)干擾，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量。在液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜中，同位素內(nèi)標(biāo)的引入是有效抵消基質(zhì)影響，提高分析方法準(zhǔn)確性及穩(wěn)定性的最有效方法［27］。研究發(fā)現(xiàn)，本方法的ME為-15.0%～15.0%，表明基質(zhì)效應(yīng)影響較小。
2.5 方法學(xué)評(píng)價(jià)
2.5.1 線性范圍、檢出限與定量下限將“1.2”配制的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按“1.3”衍生后，按濃度由低到高的順序依次經(jīng)UPLC－MS/MS進(jìn)行測(cè)定，以各目標(biāo)化合物的濃度（X，μmol/L）為橫坐標(biāo)，各目標(biāo)化合物的峰面積與其內(nèi)標(biāo)峰面積之比（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。24種目標(biāo)物在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）均不小于0.993 0（見表2）。以信噪比S/N≥3得到目標(biāo)化合物的檢出限（LOD），以S/N≥10得到目標(biāo)化合物的定量下限（LOQ）。如表2所示，24種目標(biāo)物的LOD為0.03～0.15 μmol/L，LOQ為0.1～0.5 μmol/L，均遠(yuǎn)低于食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 32946－2016［8］和文獻(xiàn)［28］報(bào)道的方法。本方法可滿足上述氨基酸與?；撬岫糠治龅囊?。
表2 24種目標(biāo)化合物的線性關(guān)系、檢出限、定量下限、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 2 Linear relations，limits of detection，limits of quantitation，recoveries and relative standard deviations of 24 analytes（n=6）
2.5.2 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差選取某洋槐蜂蜜進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)。樣品中低于檢出限的目標(biāo)化合物按LOQ、5倍LOQ、10倍LOQ，已知含量的目標(biāo)化合物按其含量的50%、100%、150%，分別添加低、中、高3個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，各水平平行測(cè)定6次。由表2可知，24種目標(biāo)物在3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率為90.5%～109%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.2%～4.7%。本方法的準(zhǔn)確度和精密度均滿足實(shí)際樣品分析要求。
2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定
利用本方法對(duì)39批次天然成熟的真蜂蜜（棗花蜂蜜、洋槐蜂蜜、荊條蜂蜜各13批次）、39批次摻假蜂蜜（廉價(jià)蜂蜜中經(jīng)檢測(cè)確認(rèn)較大概率為摻假蜂蜜的樣品，棗花蜂蜜、洋槐蜂蜜、荊條蜂蜜各13批次）、果葡糖漿、甜菜糖漿、麥芽糖漿、大米糖漿等10批次糖漿進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：糖漿中24種目標(biāo)物均未檢出。不同種類的真、摻假蜂蜜檢測(cè)結(jié)果見表3。不同蜜源蜂蜜中除Cit、Cys和Met均未檢出外，其余目標(biāo)化合物的組成及含量存在明顯差異，這與蜜源植物花粉本身、地理環(huán)境、氣候有關(guān)。不同種類的真蜂蜜中Pro和Phe的含量最高，且在荊條蜜和棗花蜜中的含量均高于洋槐蜂蜜。摻假蜂蜜中目標(biāo)化合物的組成及含量與真蜂蜜存在明顯差異，原因可能與蜂蜜中摻假糖漿的比例有關(guān)。
表3 不同蜂蜜中24種目標(biāo)化合物的含量比較（n=3）Table 3 Comparison of the contents for 24 analytes in different honey samples（n=3） w/（mg·kg-1）
3 結(jié)論
本文基于AQC柱前衍生和UPLC－MS/MS技術(shù)，建立了蜂蜜中內(nèi)源性氨基酸和?；撬岢煞值姆治龇椒ā悠方?jīng)水提取，AQC衍生，采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，并利用質(zhì)譜的高選擇性，獲得了穩(wěn)定良好的測(cè)定結(jié)果。該方法操作簡(jiǎn)單、選擇性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，靈敏度高，適用于蜂蜜中23種內(nèi)源性氨基酸和?；撬岬亩ㄐ远糠治?。利用該方法對(duì)實(shí)際蜂蜜樣品進(jìn)行檢測(cè)，并將棗花蜂蜜、洋槐蜂蜜、荊條蜂蜜及糖漿的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了比較。本研究為蜂蜜的質(zhì)量控制提供了技術(shù)支持，為蜂蜜營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和品質(zhì)評(píng)價(jià)提供了依據(jù)，對(duì)于蜂蜜摻假鑒別和類別鑒定具有重要意義。
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