精子領(lǐng)形成及精子領(lǐng)內(nèi)運(yùn)輸相關(guān)蛋白的研究進(jìn)展

王心依，王治琪，王珺，徐琴舟，夏小雨

精子形成是精子發(fā)生的重要階段。在精子形成過程中，圓形的單倍體精子細(xì)胞經(jīng)歷了顯著的核和細(xì)胞骨架修飾，以獲得精子特有的、高度極化的形態(tài)。這一過程涵蓋頂體發(fā)育、核固縮和鞭毛組裝等。其中，精子領(lǐng)（manchette）是精子形成過程中一個(gè)短暫存在的結(jié)構(gòu)，主要由細(xì)胞骨架成分微管和肌動(dòng)蛋白構(gòu)成，以精子領(lǐng)為平臺(tái)，進(jìn)行著活躍的物質(zhì)運(yùn)輸，在精子核固縮及鞭毛組裝過程中發(fā)揮重要作用。由于缺乏男性單倍體生精細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，目前與精子領(lǐng)相關(guān)的分子機(jī)制研究只能依賴于動(dòng)物模型。本文綜述了近年來有關(guān)精子領(lǐng)及精子領(lǐng)內(nèi)運(yùn)輸（intra-manchette transport，IMT）的關(guān)鍵調(diào)控蛋白的研究進(jìn)展及臨床相關(guān)性，可為理解部分男性不育的發(fā)病機(jī)制、開發(fā)可能的治療手段提供理論依據(jù)。

1 精子領(lǐng)的形成及結(jié)構(gòu)

精子領(lǐng)是精子形成過程中短暫存在的結(jié)構(gòu)，首先出現(xiàn)于人類第2步（Step2）精子細(xì)胞[1]和小鼠Step8精子細(xì)胞[2]。頂體生物發(fā)生的啟動(dòng)早于精子領(lǐng)的形成，且是后者正常發(fā)生的重要前提。目前，精子領(lǐng)微管的起源尚不確定，但據(jù)Lehti等[3]的綜述，在小鼠和大鼠中應(yīng)當(dāng)起源于中心粒區(qū)域；在精子領(lǐng)組裝過程中，短微管在細(xì)胞核周圍聚集，通過其正端末端（plus end）連接到含有δ-微管蛋白/角蛋白9的核周環(huán)（perinuclear ring），并迅速形成一個(gè)含有多達(dá)1 000條微管的裙?fàn)睿╯kirt-like）結(jié)構(gòu)[4-5]；另一方面，微管之間彼此連接形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，再通過核骨架與細(xì)胞骨架連接（linker of nucleoskeleton and cytoskeleton，LINC）復(fù)合體的中介，在多個(gè)位點(diǎn)與核膜相結(jié)合[6]。隨著核周環(huán)逐漸收縮，精子領(lǐng)逐漸向形成中的精子尾部遷移。在精子領(lǐng)發(fā)育過程中，鉤蛋白（HOOK）及其相關(guān)復(fù)合體參與精子領(lǐng)微管交聯(lián)、精子領(lǐng)遷移的調(diào)控；精子細(xì)胞特異性的LINC復(fù)合體負(fù)責(zé)精子領(lǐng)與核膜的連接，調(diào)節(jié)精子核成形（nuclear shaping）；精子相關(guān)抗原蛋白家族（sperm associated antigen，SPAG）、中心體蛋白家族（centrosomal protein，CEP）和纖毛及鞭毛相關(guān)蛋白家族（cilia- and flagellaassociated protein，CFAP）也在精子領(lǐng)的組裝及維持中發(fā)揮作用。已有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)，上述蛋白的表達(dá)異常都可能造成精子形成障礙。

1.1 HOOK1HOOK1是鉤蛋白家族成員。小鼠精子細(xì)胞通過可變剪切表達(dá)Hook1蛋白的變異體，該變異體很可能使精子領(lǐng)微管之間發(fā)生交聯(lián)，從而保證其完整性；而全長(zhǎng)Hook1蛋白可能在促進(jìn)精子領(lǐng)本身的延伸及其向尾部遷移中發(fā)揮作用。Hook1基因缺失會(huì)引起精子領(lǐng)畸形，導(dǎo)致精子頭部或尾部形態(tài)異常和斷頭，進(jìn)而導(dǎo)致雄性小鼠不育[7]。在人類中也發(fā)現(xiàn)了由HOOK1基因突變導(dǎo)致斷頭精子癥的家系[8]。

1.2 鉤蛋白相關(guān)復(fù)合體神經(jīng)元突觸膜結(jié)合蛋白3（Rab3 interacting molecule binding protein 3，RIMBP3）在人和小鼠中高度同源，該蛋白在小鼠精子細(xì)胞中特異表達(dá)。富亮氨酸重復(fù)序列和鳥苷酸激酶結(jié)構(gòu)域蛋白（leucine-rich repeats and guanylate kinase domain containing，LRGUK）高表達(dá)于小鼠精子形成階段。在小鼠中，Hook1/2/3可與RIMBP3、LRGUK以及驅(qū)動(dòng)蛋白輕鏈3（kinesin light chain 3，KLC-3）共同形成蛋白復(fù)合體，參與頂體附著、精子領(lǐng)發(fā)育及IMT、精子核成形和精子尾部軸絲延伸等多個(gè)環(huán)節(jié)的調(diào)控。小鼠中Rimbp3基因的缺失[9]或Lrguk基因的突變均可導(dǎo)致雄性小鼠不育[10-11]。

1.3 Sad1/UNC84結(jié)構(gòu)域（Sad1-UNC84 homology domain，SUN）蛋白家族在人和小鼠等哺乳動(dòng)物中，LINC復(fù)合體的組分主要包括定位于核內(nèi)膜SUN蛋白家族及定位于核外膜的Nesprin蛋白家族。在小鼠精子發(fā)生中，精子領(lǐng)通過LINC復(fù)合體與核膜連接，這對(duì)精子領(lǐng)的遷移及精子的最終形態(tài)至關(guān)重要。SUN蛋白家族成員SUN3和SUN4是小鼠睪丸特異性核膜蛋白，二者存在直接結(jié)合；由SUN3/SUN4參與形成的LINC復(fù)合體負(fù)責(zé)將精子領(lǐng)連接到核膜[12]。在Sun4敲除小鼠的精子細(xì)胞中，精子領(lǐng)從核周環(huán)上解離，最終長(zhǎng)形精子無(wú)法形成，雄性小鼠不育，其表型與人類圓頭精子癥（globozoospermia）類似。Sun3敲除雄性小鼠的表型與之相似且更加嚴(yán)重，表現(xiàn)為精子領(lǐng)缺失、核固縮異常、頂體和鞭毛結(jié)構(gòu)紊亂、精子數(shù)量顯著下降[6]。

1.4 SPAG17小鼠的SPAG諸多成員參與單倍體精子細(xì)胞形變過程的調(diào)控。其中，SPAG17蛋白與精子領(lǐng)微管結(jié)構(gòu)共定位；而在成熟精子中，SPAG17蛋白信號(hào)出現(xiàn)在頂體和尾部。敲除小鼠的Spag17基因會(huì)引起精子領(lǐng)結(jié)構(gòu)異常、頭部形態(tài)缺陷和IMT障礙，最終導(dǎo)致雄性小鼠不育[13]。

1.5 CEPCEP70和CEP131參與調(diào)控纖毛的形成、中心粒的復(fù)制及基因組的穩(wěn)定性。在小鼠中敲除這2種基因后均可導(dǎo)致雄鼠不育，但表型存在差異。Cep70基因缺失小鼠精子頂體和鞭毛形成出現(xiàn)異常，但仍有精子形成[14]；而Cep131基因缺失會(huì)導(dǎo)致精子發(fā)生停滯于Step9的單倍體精子細(xì)胞，主要是由于精子領(lǐng)結(jié)構(gòu)不能正確組裝，導(dǎo)致IMT障礙[15]。

1.6 CFAPCFAP43和CFAP44均在睪丸中特異性高表達(dá)。2017年以來的多篇文章證實(shí)，人類CFAP43及CFAP44基因的突變與精子鞭毛多種形態(tài)異常（multiple morphological abnormalities of the flagella，MMAF）有關(guān)[16]。Cfap43或Cfap44敲除小鼠均出現(xiàn)MMAF表型。Cfap43敲除小鼠的精子細(xì)胞還可以觀察到形態(tài)異常的精子領(lǐng)，提示CFAP43不僅參與調(diào)控鞭毛組分運(yùn)輸和組裝，還參與正常精子領(lǐng)結(jié)構(gòu)的維持[17]。這一家族的另一成員CFAP65蛋白定位于人類精子頂體區(qū)域和鞭毛中部，人類CFAP65基因突變可導(dǎo)致頂體發(fā)育不全、鞭毛畸形，最終表現(xiàn)為嚴(yán)重的弱精子癥。Cfap65敲除雄鼠同樣表現(xiàn)為嚴(yán)重的弱精子癥，其精子細(xì)胞的部分細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白表達(dá)量下調(diào)，精子領(lǐng)發(fā)育及IMT出現(xiàn)障礙，精子形成過程受阻[18]。

1.7 CAP-Gly結(jié)構(gòu)域連接蛋白1（CAP-Gly domain containing linker protein 1，CLIP1）CLIP1是一種微管正端追蹤（plus-end-tracking）蛋白，參與微管動(dòng)力學(xué)的調(diào)控、動(dòng)力蛋白激活蛋白（dynactin）的定位以及內(nèi)體與微管之間的連接。在小鼠睪丸中，CLIP1蛋白高表達(dá)于精原細(xì)胞與早期精母細(xì)胞，并出現(xiàn)在精子形成階段的中心體和精子領(lǐng)上。Clip1基因敲除雄鼠精子頭部異常、生育力低下[19]。

1.8 前纖維蛋白3（profilin 3，PFN3）PFN是細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白聚合的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，包括PFN1～PFN4。在小鼠精子細(xì)胞中，PFN3特異性定位于高爾基體、頂體前體小泡、頂質(zhì)體-精子領(lǐng)復(fù)合體和線粒體。在Pfn3基因敲除小鼠中，包括絲切蛋白1/2（cofilin1/2）、肌動(dòng)蛋白解聚因子（actin depolymerizing factor）在內(nèi)的重要的細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而出現(xiàn)精子領(lǐng)發(fā)育異常、頂體及鞭毛畸形，最終產(chǎn)生圓頭精子癥表型，雄性生育力下降[20]。

1.9 SEPT14-ACTN4蛋白復(fù)合體隔蛋白（septin）是高度保守的三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）結(jié)合蛋白，聚合的隔蛋白通過與微管、肌動(dòng)蛋白和其他細(xì)胞成分的相互作用，參與細(xì)胞骨架的調(diào)控。在小鼠中，隔蛋白SEPT14與輔肌動(dòng)蛋白ACTN4（alpha-Actinin-4）共同定位在早期延長(zhǎng)型精子細(xì)胞中的精子領(lǐng)及核周區(qū)域，參與精子領(lǐng)結(jié)構(gòu)的維持。攜帶SEPT14突變的男性精子樣本中，ACTN4的定位及分布異常，并伴有精子頭部畸形[21]。

1.10 軸絲動(dòng)力蛋白輕鏈結(jié)構(gòu)域蛋白1（axonemal dynein light chain domain containing 1，AXDND1）AXDND1在人與小鼠中高度同源，僅在睪丸中單倍體精子細(xì)胞中特異性高表達(dá)，并與微管蛋白結(jié)合。測(cè)序結(jié)果證實(shí)，人類AXDND1基因突變與男性非梗阻性無(wú)精子癥有關(guān)。Axdnd1敲除的雄鼠雖然可以形成精子領(lǐng)，但其結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化異常，最終導(dǎo)致晚期精子細(xì)胞大量凋亡、雄鼠不育[22]。

2 IMT及其調(diào)控

小鼠的精子領(lǐng)存在于Step8～Step14精子細(xì)胞。在此期間，各種貨物蛋白（cargo protein）依賴IMT到達(dá)特定位點(diǎn)，這對(duì)核固縮及精子尾部鞭毛的組裝都十分重要。值得注意的是，精子領(lǐng)內(nèi)微管的正端末端指向頂體，與尾部鞭毛中微管的極性相反[3]。因此，向頂體方向進(jìn)行的IMT需要順向馬達(dá)蛋白，如驅(qū)動(dòng)蛋白（kinesin）；而向遠(yuǎn)離頂體的方向運(yùn)輸需要逆向馬達(dá)蛋白，如動(dòng)力蛋白（dynein）；此外，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白（F-actin）和肌球蛋白（myosin）也在精子領(lǐng)上有定位[23-25]。除上述細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白外，鉤蛋白家族、鞭毛內(nèi)運(yùn)輸?shù)鞍祝╥ntraflagellar transport，IFT）家族等也在IMT中發(fā)揮作用，各蛋白家族成員往往彼此結(jié)合組成特定的蛋白復(fù)合體。

2.1 驅(qū)動(dòng)蛋白家族（kinesin family）驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員KIF3A、KIF3B、KIF17b、KIF27、KIF5CA[1,3,23]等在精子領(lǐng)上均有定位，推測(cè)其參與IMT過程。其中，KIF3B可與HOOK1-RIMBP3形成復(fù)合體[9]。KIF3A可與KIF3B或KIF1結(jié)合蛋白（KIF1-binding protein，KBP）相互結(jié)合，并負(fù)責(zé)減數(shù)分裂特異性核結(jié)構(gòu)蛋白1（meiosis specific nuclear structural 1，MNS1）的IMT[26]。在小鼠生精細(xì)胞中條件性敲除Kif3a會(huì)導(dǎo)致精子領(lǐng)功能異常，進(jìn)而導(dǎo)致精子頭部畸形[27]。

2.2 IFT復(fù)合體-B在精子形成過程中，鞭毛組裝早于精子領(lǐng)的形成，由基粒微管延伸形成軸絲。以軸絲為基礎(chǔ)的鞭毛內(nèi)運(yùn)輸主要由IFT復(fù)合體負(fù)責(zé)[28]。其中，IFT復(fù)合體-A含有6個(gè)亞基，負(fù)責(zé)逆向運(yùn)輸（負(fù)端定向運(yùn)輸）；IFT復(fù)合體-B含有16個(gè)亞基，負(fù)責(zé)順向運(yùn)輸（正端定向運(yùn)輸）。研究發(fā)現(xiàn)，除了定位于發(fā)育中的鞭毛，IFT復(fù)合體-B還定位于精子領(lǐng)。敲除小鼠的編碼IFT-B亞基的基因，包括Ift20、Ift25、Ift27、Ift74和Ift88等，可導(dǎo)致雄鼠不育[28-31]，這也體現(xiàn)出IMT與IFT的共性。

2.3 絲氨酸/蘇氨酸激酶36（serine/threonine kinase 36，STK36）在小鼠睪丸中，STK36蛋白定位于精子領(lǐng)和頂體-頂質(zhì)體復(fù)合體，并與KIF27蛋白以及鞭毛中外周致密纖維蛋白（outer dense fiber 1，ODF1）形成蛋白復(fù)合體。在雄鼠生殖細(xì)胞中條件性敲除Stk36基因會(huì)導(dǎo)致精子數(shù)量減少、頭部畸形、斷頭和精子運(yùn)動(dòng)缺陷，進(jìn)而導(dǎo)致不育[32]。

2.4 Parkin共調(diào)基因（Parkin co-regulated gene，PACRG）-減數(shù)分裂表達(dá)基因1（meiosis-expressed gene 1，MEIG1）蛋白復(fù)合體在小鼠精子形成過程中，PACRG蛋白可以招募MEIG1蛋白到精子領(lǐng)，兩者的結(jié)合可以穩(wěn)定PACRG蛋白使其免于降解。PACRG-MEIG1蛋白復(fù)合體負(fù)責(zé)部分貨物蛋白（如精子鞭毛蛋白SPAG16L）在精子領(lǐng)內(nèi)的運(yùn)輸。當(dāng)小鼠MEIG1 蛋 白Y68 氨 基 酸 突 變 時(shí)，MEIG1 無(wú) 法 與PACRG結(jié)合，IMT功能出現(xiàn)異常[33]。Meig1突變或缺失的雄鼠表現(xiàn)出精子細(xì)胞核固縮及鞭毛發(fā)生障礙，雄性不育。PACRG-MEIG1蛋白復(fù)合體在小鼠與人類之間高度保守，人類PACRG基因啟動(dòng)子的突變是與男性無(wú)精子癥相關(guān)的危險(xiǎn)因素[34]。

2.5 精子鞭毛蛋白2（sperm flagellar 2，SPEF2）在小鼠睪丸中，SPEF2可作為動(dòng)力蛋白1的接頭蛋白（linker protein），將IFT20連接到精子領(lǐng)結(jié)構(gòu)上，而IFT20蛋白又與HOOK及其他IMT功能蛋白相互結(jié)合。在雄性小鼠生殖細(xì)胞中條件性敲除Spef2基因會(huì)導(dǎo)致IMT障礙，致使小鼠精子頭部和尾部畸形、精子數(shù)量下降[35]。

2.6 末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶5C（terminal nucleotidyltransferase 5C，TENT5C）TENT5C屬于高度保守的非經(jīng)典RNA多腺苷聚合酶（non-canonical RNApolyadenylation polymerase）家族，在人和小鼠的睪丸中大量表達(dá)，并精確定位于精子領(lǐng)。TENT5C基因敲除雄性小鼠不育，雖然其精子形成過程中精子領(lǐng)結(jié)構(gòu)是正常的，但產(chǎn)生大量無(wú)頭精子；也可產(chǎn)生少量形態(tài)無(wú)異常的精子，但卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)精子注射實(shí)驗(yàn)顯示，它們的受精能力受到了嚴(yán)重?fù)p害[36]。

3 精子領(lǐng)的消除

小鼠精子領(lǐng)的消除發(fā)生在精子形成的Step13～Step14，精子領(lǐng)以類似拉鏈狀的運(yùn)動(dòng)方式向精子尾部移動(dòng)，與此同時(shí)，核周環(huán)收縮，幫助精子頭部延伸及固縮[3]。隨后，由微管切割蛋白Katanin主導(dǎo)了精子領(lǐng)的消除。Katanin定位于精子領(lǐng)微管的負(fù)端（minus end），也就是伸向尾部的一端。Katanin由催化亞基p60和調(diào)節(jié)亞基p80構(gòu)成，突變的p80蛋白將導(dǎo)致精子領(lǐng)消除的延遲及精子尾部結(jié)構(gòu)的畸形[37]。在此過程中，WD40 重 復(fù) 蛋 白62 （WD40 repeat protein 62，WDR62）參與招募Katanin到精子領(lǐng)，因此，Wdr62基因突變小鼠的精子領(lǐng)消除出現(xiàn)障礙，進(jìn)而導(dǎo)致少弱畸形精子癥表型[38]。KATNAL2（Katanin-like 2）蛋白也是微管切割蛋白Katanin家族的成員，Katnal2突變或條件性敲除的雄性小鼠精子領(lǐng)結(jié)構(gòu)異常，并最終導(dǎo)致不育[39]。

4 結(jié)語(yǔ)

精子變形過程機(jī)制復(fù)雜，精子領(lǐng)及IMT在其中發(fā)揮重要作用。干擾精子領(lǐng)的組裝、維持、消除以及IMT的正常調(diào)控，都可能導(dǎo)致不同程度的生精障礙。除正文中所列因子外，還有一些蛋白也被發(fā)現(xiàn)定位于小鼠或人類精子領(lǐng)上[40-47]，若功能缺失則會(huì)導(dǎo)致生精障礙，但具體機(jī)制仍有待研究。隨著基因敲除等生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，將有越來越多的精子領(lǐng)功能相關(guān)蛋白被驗(yàn)證。這也將為臨床上因精子形成障礙所引起的男性不育的診治以及未來男性新避孕靶點(diǎn)的研發(fā)提供重要的理論參考。