水產(chǎn)膠原的熱穩(wěn)定性能和生物醫(yī)學應用研究進展

張軍濤，汪海波＊，徐麗明

（1. 武漢輕工大學化學與環(huán)境工程學院，湖北 武漢 430023；2. 中國食品藥品檢定研究院，北京 102629）

引言

天然生物大分子因固有的生物相容性和降解性能而備受關(guān)注。膠原作為其中的典型代表已被廣泛應用于醫(yī)療器械和組織工程領(lǐng)域。作為脊椎動物細胞外基質(zhì)的重要組分，膠原廣泛分布于皮膚、骨骼、韌帶、軟骨和跟腱等部位，對組織結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用[1]。到目前為止，已知的膠原種類有29 種，根據(jù)發(fā)現(xiàn)的先后順序，被分別命名為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、IV 型等[2]，天然膠原在生物體內(nèi)的合成路徑、分子結(jié)構(gòu)和纖維重組行為等基礎性科學問題已基本明確（如圖1 所示）[3]。在膠原家族中，I 型膠原（以下稱膠原）因較高的含量和優(yōu)異的生物學性能而尤為引人矚目，并被廣泛的應用于組織工程領(lǐng)域[4]。

圖1 膠原的生物合成途徑示意圖Fig.1 Schematic biosynthetic pathways of collagen

與傳統(tǒng)的哺乳動物膠原相比，水產(chǎn)膠原在來源的廣泛性、生物安全性和產(chǎn)品成本等方面均具有一定的優(yōu)勢，如（1）水產(chǎn)動物的種類及生活環(huán)境多樣性造就了水產(chǎn)膠原多樣化的結(jié)構(gòu)和性能，不同種類、不同組織部位、不同養(yǎng)殖環(huán)境、不同生長周期甚至不同捕撈季節(jié)均會影響所得膠原的結(jié)構(gòu)和性能，從而為膠原基產(chǎn)品的創(chuàng)制和應用提供更大的選擇空間；（2）目前尚未有水產(chǎn)品造成人畜共患疾病的報道，因此，水產(chǎn)膠原制品比哺乳動物膠原制品具有更高的生物安全性，可以避免口蹄疫、瘋牛病等病毒的傳播風險[5]；（3）水產(chǎn)膠原不受宗教壁壘限制，具有更高的國際范圍普適性；（4）水產(chǎn)膠原一般來源于水產(chǎn)品加工廢棄物（魚皮、鱗、骨等），成本相對低廉且符合環(huán)保、低碳的經(jīng)濟發(fā)展需求，可以促進水產(chǎn)加工產(chǎn)業(yè)鏈條延伸，提高技術(shù)附加值。

近年來，國內(nèi)外諸多學者圍繞水產(chǎn)膠原的制取、理化性質(zhì)及其在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應用開展了大量研究并取得一系列成果。三螺旋結(jié)構(gòu)是膠原典型的結(jié)構(gòu)特征，也是其優(yōu)良生物學性能和分子行為的結(jié)構(gòu)基礎。在受熱條件下，膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)會解離成為單肽鏈，從而導致其耐酶降解性能、細胞調(diào)控性能以及凝膠化性能減弱或喪失。因此，熱穩(wěn)定性成為膠原的重要性能指標，也是影響其加工利用的重要因素。本文著重對近年來不同來源的天然活性水產(chǎn)膠原（不包含明膠和肽等變性產(chǎn)物）的熱穩(wěn)定性差異及水產(chǎn)膠原在生物醫(yī)學材料領(lǐng)域的研究進展進行系統(tǒng)性回顧和綜述，以期為該領(lǐng)域的從業(yè)者提供有益的借鑒。

1 不同種類水產(chǎn)膠原的熱穩(wěn)定性

一般采用膠原溶液的熱變性溫度或固態(tài)膠原的熱收縮溫度來表征其熱穩(wěn)定性，常用表征方法有烏氏粘度法、圓二色譜法和差示掃描量熱法等。研究表明，亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）含量越高，膠原的熱變性溫度也越高[6]。盡管水產(chǎn)膠原的氨基酸組成特征與哺乳動物類似，但水產(chǎn)動物種類繁多，習性和棲息環(huán)境差異較大，導致水產(chǎn)膠原的個體化氨基酸組成、比例，特別是羥脯氨酸和脯氨酸的含量差異較大[7]。不同水產(chǎn)膠原的亞氨基酸含量和熱變性溫度如表1 所示，水產(chǎn)膠原的熱變性溫度與物種、棲息環(huán)境等有重要關(guān)系，且與脯氨酸和羥脯氨酸含量呈一定的正相關(guān)性。暖水性魚類的熱變性溫度高于冷水性魚類，如巴丁魚皮中的ASC 和PSC 熱變性溫度分別為39.3 ℃和39.6 ℃[8]，高于豬皮膠原的熱變性溫度（37 ℃）[9]，與牛皮膠原的熱變性溫度類似（40.8 ℃）[6]；而冷水性太平洋鱈魚皮 ASC 和 PSC 的熱變性溫度分別為 14.5 ℃和16.0 ℃，與之相對應的是其亞氨基酸含量分別為15.7%和15.9%，遠低于巴丁魚皮ASC 和PSC 的20.6%和21.1%[10]。同一魚種不同部位的膠原熱變性溫度和亞氨基酸含量也存在差異，如草魚皮、鱗、骨中 ASC 的熱變性溫度分別為 35.6、34.8、36.0 ℃，亞氨基酸含量分別為14.8%、9.8%、16.0%；PSC 的熱變性溫度分別為 35.8 ℃、35.2 ℃、36.4 ℃，亞氨基酸含量分別為 15.5%、15.5%、14.7%[11]。

表1 不同水產(chǎn)膠原的亞氨基酸含量、熱變性溫度比較Tab.1 Comparison of imino acid content and thermal denaturation temperature of various aquatic collagen

續(xù)表1

研究表明，端肽結(jié)構(gòu)會影響膠原的熱變性溫度。無端肽結(jié)構(gòu)的PSC 中亞氨基酸含量比有端肽結(jié)構(gòu)的ASC 要低，其熱變性溫度也相應較低。以羅非魚皮為原料分別提取得到ASC 和PSC，其熱變性溫度分別為34.5 ℃和30.0 ℃，亞氨基酸含量分別為20.03%和 19.15%[12]。

2 水產(chǎn)膠原在生物醫(yī)學材料領(lǐng)域的應用

近年來，大量學者致力于水產(chǎn)膠原在生物醫(yī)學材料領(lǐng)域的應用研究，但是，該領(lǐng)域尚處于起步階段，臨床應用的案例較少，而且多以明膠和多肽的形式加以利用。本文主要針對具有完整三螺旋結(jié)構(gòu)的天然水產(chǎn)膠原在生物醫(yī)學材料領(lǐng)域的基礎研究和應用基礎研究進行綜述，涉及敷料、細胞支架材料等各類形式的臨床醫(yī)學和組織工程材料產(chǎn)品（圖2），產(chǎn)品類型包括海綿、凝膠和泡沫等。值得注意的是，水產(chǎn)膠原的熱變性溫度較低且不同來源的水產(chǎn)膠原熱變性溫度差異明顯。因此，水產(chǎn)膠原基材料的制備過程更需要關(guān)注溫度條件。一般情況下，水產(chǎn)膠原基材料的制備宜在低溫條件下（一般低于15 ℃）進行，以免因膠原變性而影響材料性能。

圖2 水產(chǎn)膠原在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應用Fig.2 Biomedical applications of aquatic collagen

2.1 創(chuàng)傷敷料

水產(chǎn)膠原具備與哺乳動物膠原類似的細胞相容性和促進傷口愈合功能，且具有更優(yōu)異的吸水和保水性能[39]。水產(chǎn)膠原基材料的微觀形貌對細胞行為具有重要的調(diào)控作用。Suzuki 等[40]以羅非魚鱗膠原為原料，通過光刻、軟刻蝕等技術(shù)制備具有表面不同微觀結(jié)構(gòu)的仿生口腔粘膜替代物，細胞在其表面可以形成完全分化的上皮層。此外，靜電紡絲法也被用于調(diào)控膠原產(chǎn)品的形貌[41]。與哺乳動物膠原制品類似，化學交聯(lián)、天然大分子/聚合物摻雜等方法也被用于提高水產(chǎn)膠原基敷料的機械性能。Raghavankutty 等[42]采用戊二醛交聯(lián)膠原/殼聚糖復合膜材料的研究表明，該材料不僅具有良好的滲透性和細胞相容性，而且具有良好的止血性能。Terada等[43]制備的負載口腔粘膜角質(zhì)細胞的膠原/殼聚糖復合膜可用于口腔粘膜修復。此外，有機聚合物和無機材料被廣泛用于提升膠原基敷料的性能。Zhou等[44]采用羅非魚膠原和聚乙烯醇共混制備了可誘導牙周組織再生的膜材料，通過控制聚乙烯醇和膠原的比例可以調(diào)節(jié)細胞的粘附和增殖行為。Choi 等[45]制備的魚皮膠原和聚己酸內(nèi)酯復合納米纖維支架材料不僅可以促進細胞的粘附和增殖，而且能促進細胞的基因和蛋白質(zhì)表達。Zhou 等[46]制備的魚皮膠原/ 生物玻璃復合納米纖維材料不僅具有抗菌活性，而且能夠促進細胞的粘附、增殖和遷移以及膠原的沉積和血管內(nèi)皮生長因子的分泌，進而促進皮膚創(chuàng)面愈合。Senthil 等[47]制備的魚膠原/聚乙烯醇/氧化石墨烯復合納米纖維支架材料具有良好的機械性能、細胞粘附和促細胞增殖性能以及抗菌、促傷口愈合功能。這些天然高分子、人工合成聚合物以及無機材料的添加，可以在保持水產(chǎn)膠原優(yōu)良生物相容性的基礎上賦予材料良好的機械性能和抗菌性能等特性。

2.2 仿生骨材料

水產(chǎn)膠原不僅可以粘附人源間充質(zhì)干細胞并促進其分化[48]，而且在促進成骨細胞分化性能方面優(yōu)于哺乳動物膠原[46]。Hassanbhai 等[49]的研究表明，水產(chǎn)膠原的性能可以達到商品化哺乳動物源膠原基骨修復材料的要求，且具有更好的熱穩(wěn)定性和促細胞增殖效果。Diogo 等[50]通過冷沉淀凝膠化和EDC 交聯(lián)方法制備的魚膠原/ 玻尿酸復合支架無需外源誘導性成分即可促使人源脂肪干細胞分化為軟骨。

為了獲得性能良好的仿生骨材料，可采用在膠原支架材料中進行生物礦化或者直接將膠原與無機材料共混的方法實現(xiàn)。采用3D 打印[51]、靜電紡絲[52]等技術(shù)以單一膠原或摻雜海藻酸鈉、硫酸軟骨素、聚合物等材料制備支架材料，進而通過生物礦化可獲得具有良好機械性能的仿生骨材料。Camara 等[53]以羅非魚皮膠原與納米磷酸鈣共混制備了與天然骨成分類似的骨替代材料（水/ 膠原/ 磷酸鈣=6.5/53.9/39.6）。與哺乳動物膠原相比，水產(chǎn)膠原基仿生骨材料更有優(yōu)勢，如Chang 等[54]采用磷酸鈣礦化獲得的水產(chǎn)膠原/羥基磷灰石懸濁液經(jīng)真空抽濾制備了復合材料，其抗壓強度高于豬膠原制備的復合材料。此外，單壁碳納米管[55]、生物活性玻璃[56]等也被用于提高水產(chǎn)膠原基仿生骨材料的機械性能。

2.3 藥物負載和緩釋

膠原海綿和水凝膠材料具有優(yōu)良的貫穿孔隙結(jié)構(gòu)和生物降解性能，通過負載不同的藥物或天然活性組分，不僅可以實現(xiàn)負載物的緩釋，而且能夠賦予膠原海綿額外的性能。在膠原基材料中負載抗生素、銀納米粒子以及植物抗菌組分可以使其具有更優(yōu)異的促傷口愈合性能、抗菌性能[57]。膠原/殼聚糖復合材料也被用于制備負載藥物的納米微球，如Tran 等[58]制備的負載洛伐他丁的膠原/殼聚糖復合納米微球具有可控緩釋性能，從而提高藥物的生物利用度。Nguyen 等[59]制備了具有pH 響應性的水產(chǎn)膠原/卡拉膠復合凝膠微球，可用于別嘌呤醇的負載和可控緩釋。膠原/無機物和膠原/聚合物復合材料同樣可以用于藥物負載和緩釋，如Li 等[60]制備牛蛙皮膠原/碳納米管復合凝膠并用于硫酸慶大霉素緩釋，碳納米管的加入可以提高復合凝膠的穩(wěn)定性和藥物的緩釋效果。Liang 等[61]通過在魚鱗膠原/聚乙烯醇復合膜材料中負載山梨酸鉀提高材料的抗菌性能。

2.4 其他類型膠原基材料

Krishnan 等[62]以尖吻鱸魚鱗膠原制備的人工角膜材料具有比人源羊膜更好的溶脹比、耐酶降解性能和抗菌性能，且其透光性和機械性能均達到臨床需求。將羅非魚鱗通過脫細胞和脫鈣質(zhì)得到的人工角膜材料，不僅具有良好的縫合性能、生物相容性、透光性能和光散射性，而且具有一定的球面曲率，適用于眼科手術(shù)移植[63]。Li 等[64]將鱸魚膠原與殼聚糖共混并經(jīng)1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺交聯(lián)后得到的海綿材料可以防止腦組織粘附并抑制炎癥，從而促進組織再生和創(chuàng)面愈合。

定向排列的膠原纖維結(jié)構(gòu)不僅可以提供優(yōu)異的抗拉伸性能，而且能夠引導細胞粘附和增殖，是肌腱、跟腱修復和替代的理想材料。磁場、滲透擴散、物理擠壓、離心等方法已被用于水產(chǎn)膠原基各向異性材料的制備。Chen 等[65]采用磁場結(jié)合EDC交聯(lián)的策略處理羅非魚鱗膠原獲得各向異性材料，其纖維排列方向垂直于磁場方向，且各向異性程度取決于磁場強度。Mredha 等[66]以鱘魚鰾膠原為原料，在室溫條件下通過控制中性緩沖溶劑擴散誘導膠原纖維重組的方法制備了穩(wěn)定的同心軸定向纖維排列水凝膠材料，而哺乳動物膠原不能實現(xiàn)該材料的制備。Mredha 等[67]以鱘魚鰾膠原為原料，通過物理擠壓結(jié)合纖維重組的方式獲得各向異性纖維產(chǎn)物，并進一步將其置于含有N,N’-二甲基丙烯酰胺的溶液中進行聚合反應獲得雙網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)水凝膠，其結(jié)構(gòu)、溶脹性能和機械性能均具有各向異性，引入羥基磷灰石后還可以用于骨缺損修復。Zhang 等[68]以鮰魚皮膠原為原料，通過離心處理促使膠原纖維核結(jié)構(gòu)形成定向排列，進而靜置組裝獲得具有各向異性結(jié)構(gòu)的膠原材料，該材料具有良好的拉伸性能和定向誘導細胞增殖的性能。

3 總結(jié)和展望

水產(chǎn)膠原與傳統(tǒng)的哺乳動物膠原具有同源性，不僅具有類似的結(jié)構(gòu)和性能，而且具有來源多樣、生物風險和宗教壁壘低、成本低廉等優(yōu)勢。因此，圍繞水產(chǎn)膠原的性能研究及其在生物醫(yī)學材料領(lǐng)域中的潛在應用備受矚目。然而，作為一種新興的膠原資源，水產(chǎn)膠原的相關(guān)研究仍需進一步加強：（1）針對水產(chǎn)膠原種類繁多、性能差異比較明顯的特點，需要進一步加強對不同來源膠原性能的差異性研究，以便為膠原基材料的制備和應用提供參考；（2）水產(chǎn)膠原結(jié)構(gòu)和性能的多樣性和差異性為開展膠原構(gòu)效關(guān)聯(lián)機制分析提供了良好切入點，系統(tǒng)、深入的開展水產(chǎn)膠原結(jié)構(gòu)與性能之間的關(guān)聯(lián)性研究可以進一步拓展膠原領(lǐng)域研究范疇；（3）針對水產(chǎn)膠原的特殊性能，需要建立一系列標準化檢測和表征方法，以便客觀地評價水產(chǎn)膠原的性能和質(zhì)量。結(jié)合哺乳動物膠原的性能表征方法，需要進一步確認既有膠原表征方法對水產(chǎn)膠原的適用性，如針對水產(chǎn)膠原熱變溫度低的特點，在進行與熱變性處理相關(guān)的檢測時需要考慮降低熱變性處理的溫度，優(yōu)化針對水產(chǎn)膠原的樣品前處理方法；（4）充分利用或改善水產(chǎn)膠原性能的應用研究需進一步加強，如針對水產(chǎn)膠原的熱變性溫度和體內(nèi)降解性能與哺乳動物膠原的差異，研發(fā)具有降解過程可控的生物醫(yī)用材料；（5）利用現(xiàn)代技術(shù)手段改善膠原的熱穩(wěn)定性、耐酶降解性和生物力學性能，以滿足應用需要。