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    黃瓜貼接苗砧木子葉淀粉代謝的動(dòng)態(tài)變化特征

    2023-01-04 13:38:46張靜亞尚慶茂董春娟
    西北植物學(xué)報(bào) 2022年11期
    關(guān)鍵詞:子葉嫁接苗砧木

    濮 丹,張靜亞,雷 蕾,尚慶茂,董春娟

    (中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100081)

    黃瓜(CucumissativusL.)是世界上最主要的蔬菜種類(lèi)之一,也是中國(guó)種植面積最大、產(chǎn)量最高的果菜類(lèi)蔬菜之一。聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)數(shù)據(jù)顯示,2020年中國(guó)黃瓜種植面積126.04萬(wàn)hm2,產(chǎn)量7 283.30萬(wàn)t,分別占全世界的56.61%和79.81%,面積和產(chǎn)量均位居世界第一。嫁接在黃瓜栽培生產(chǎn)中已廣泛應(yīng)用,選擇合適的南瓜砧木進(jìn)行嫁接,可以有效克服土壤連作障礙、增強(qiáng)黃瓜嫁接苗的耐逆性和抗病性、提高果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)[1-2]。國(guó)內(nèi)外常用的黃瓜嫁接方法包括靠接法、插接法和單子葉貼接法等[3-4]。采用單子葉貼接法進(jìn)行嫁接時(shí),用刀片沿一定角度切去砧木一個(gè)子葉和生長(zhǎng)點(diǎn),接穗在子葉下方約1 cm處以相同角度斜切下胚軸,之后將砧木和接穗沿切面緊貼對(duì)齊,用嫁接夾固定[3]。單子葉貼接法因操作工序簡(jiǎn)單,對(duì)幼苗標(biāo)準(zhǔn)化程度要求低,更利于機(jī)械化嫁接操作,且嫁接成活后萌蘗少,在黃瓜嫁接中已廣泛推廣應(yīng)用[5]。

    黃瓜和南瓜均屬于雙子葉植物,子葉對(duì)其生長(zhǎng)具有重要作用。隨著生長(zhǎng)發(fā)育,子葉從單純的貯存器官轉(zhuǎn)變?yōu)橛酌缟L(zhǎng)初期最主要的光合器官,子葉中貯存的以及光合產(chǎn)生的碳水化合物是植物早期生長(zhǎng)所需的主要能量來(lái)源[6]。在黃瓜中,將5 d齡幼苗的1片子葉去除,幼苗干質(zhì)量減少50%以上,而將2片子葉全部去除,幼苗干質(zhì)量將減少約70%[7-9]。在單子葉貼接中往往會(huì)保留一片砧木子葉,從而為嫁接接合部提供激素和能量物質(zhì),促進(jìn)細(xì)胞分裂形成愈傷組織,進(jìn)而促進(jìn)嫁接愈合和嫁接苗生長(zhǎng)[10-11]。然而,近年來(lái)穴盤(pán)育苗已成為黃瓜育苗的主要方式。南瓜砧木子葉較大,而穴盤(pán)育苗空間有限,在育苗時(shí)常會(huì)導(dǎo)致砧木子葉相互遮擋、堆疊,影響葉片光合效率,并易引發(fā)葉部病害,因此生產(chǎn)中多采用將砧木子葉部分剪除以減少不利影響[12],但是砧木子葉的去留如何影響黃瓜嫁接苗生長(zhǎng),目前仍鮮見(jiàn)報(bào)道。

    糖在黃瓜嫁接愈合和嫁接苗生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中十分關(guān)鍵[10-11]。淀粉是葉片中糖的主要貯存形式[13]。淀粉合成是通過(guò)一系列酶促反應(yīng),把淀粉合成的前體物質(zhì)ADP-葡萄糖(ADP-glucose,ADPG)轉(zhuǎn)變?yōu)榈矸鄣倪^(guò)程,ADPG焦磷酸化酶(ADP glucose pyrophosphorylase,AGPase)、顆粒結(jié)合態(tài)淀粉合成酶(granule bound starch synthase,GBSS)、淀粉合成酶(starch synthase,SS)、淀粉分支酶(starch branching enzyme,SBE)和淀粉去分支酶(debranching enzyme,DBE)是淀粉合成過(guò)程的關(guān)鍵酶,其中AGPase負(fù)責(zé)合成前體物質(zhì)ADPG,GBSS參與直鏈淀粉合成,SS、SBE和DBE參與支鏈淀粉的合成[14-17]。淀粉還可在β-淀粉酶(β-Amylase,β-AL)等酶的作用下水解形成麥芽糖,并運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì),為植物生長(zhǎng)提供碳源[18]。在單子葉貼接的嫁接苗中,砧木子葉是重要的貯存性器官,淀粉作為其中糖的主要貯存形式,其代謝如何變化,對(duì)嫁接苗生長(zhǎng)如何影響,目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究測(cè)定了黃瓜單子葉貼接嫁接苗砧木子葉的形態(tài)指標(biāo)和淀粉代謝變化,分析了嫁接后去除砧木子葉對(duì)黃瓜嫁接苗生長(zhǎng)的影響,明確了砧木子葉淀粉代謝在黃瓜嫁接苗生長(zhǎng)中的作用,為黃瓜嫁接苗的壯苗培育提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    供試黃瓜品種‘中農(nóng)18號(hào)’購(gòu)自中蔬種業(yè)(北京)有限公司,南瓜品種‘京欣砧5號(hào)’購(gòu)自京研益農(nóng)(北京)種業(yè)科技有限公司。播種用平盤(pán)規(guī)格為540 mm×270 mm×60 mm(長(zhǎng)×寬×高),購(gòu)自臺(tái)州隆基塑業(yè)有限公司;育苗營(yíng)養(yǎng)缽上口徑70 mm,下口徑50 mm,高55 mm,購(gòu)自北京順莉科技有限公司。蛭石和珍珠巖為園藝級(jí),粒徑3~5 mm,購(gòu)自河北靈壽縣騰達(dá)礦產(chǎn)品加工廠(chǎng);石英砂為20~40目,購(gòu)自青島綠生生物科技有限公司。

    1.2 幼苗培養(yǎng)與嫁接

    試驗(yàn)所需幼苗在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所南區(qū)玻璃溫室中進(jìn)行培養(yǎng)。選取飽滿(mǎn)一致的黃瓜和南瓜種子,5% NaClO消毒10 min,蒸餾水充分沖洗后,置于30 ℃恒溫箱中催芽。待種子露白后,挑選萌發(fā)一致的種子,接穗種子播于裝有蛭石和珍珠巖(1∶1,V/V)混合基質(zhì)的育苗平盤(pán)中,每盤(pán)播種約150粒;砧木種子播于裝有蛭石和石英砂(5∶1,V/V)混合基質(zhì)的育苗營(yíng)養(yǎng)缽中,每缽1粒,播種后覆蓋1.5 cm厚的蛭石,充分澆水至平盤(pán)或營(yíng)養(yǎng)缽底部排水孔有水滴出現(xiàn)。待接穗幼苗長(zhǎng)至子葉平展、砧木幼苗長(zhǎng)至第一片真葉露心時(shí),進(jìn)行嫁接。

    嫁接試驗(yàn)設(shè)置2個(gè)砧穗組合,分別為黃瓜/南瓜(C/P)和南瓜/南瓜(P/P),以不嫁接的南瓜自根苗(P)和去除一片子葉的南瓜苗(-/P)為對(duì)照。采用單子葉貼接法進(jìn)行嫁接。選取長(zhǎng)勢(shì)整齊一致的幼苗,將砧木幼苗軸向30°切去生長(zhǎng)點(diǎn)及一片子葉,接穗在子葉下方1 cm處以相同角度斜切,切面長(zhǎng)約0.5 cm,將兩切面緊貼對(duì)齊,用嫁接夾固定。嫁接后將幼苗立即移入人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng),愈合期環(huán)境設(shè)置參照趙加欣等進(jìn)行分段設(shè)置[11]。嫁接后8 d(the 8 days after grafting,8 dag,下同)將幼苗移入玻璃溫室自然溫光條件下培養(yǎng)至25 dag。幼苗培養(yǎng)過(guò)程用1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行灌溉。每處理3次重復(fù),每重復(fù)至少100株嫁接苗。

    為了分析砧木子葉去留對(duì)嫁接苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響,分別于0、1、3、5、7、10、13、18 dag上午10:00去除C/P和P/P嫁接苗的砧木子葉,嫁接苗繼續(xù)培養(yǎng)至25 dag,培養(yǎng)條件同上,以不去除砧木子葉的C/P和P/P嫁接苗為對(duì)照。

    1.3 嫁接苗生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

    1.3.1 砧木子葉面積和鮮質(zhì)量分別于0、1、3、5、7、10、13、18、25 dag下午14:00取砧木子葉,稱(chēng)量、記錄子葉鮮質(zhì)量,對(duì)子葉進(jìn)行掃描,采用萬(wàn)深LA-S植物圖像分析軟件計(jì)算子葉面積。每處理3次生物學(xué)重復(fù),每重復(fù)12株。

    1.3.2 接穗和砧木生長(zhǎng)指標(biāo)于25 dag選取嫁接苗,分為接穗和砧木兩個(gè)部分,參照褚群等[11]的方法,分別測(cè)定接穗部分鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、葉片面積,以及根系鮮質(zhì)量和干質(zhì)量。每處理3次生物學(xué)重復(fù),每重復(fù)12株。

    1.4 根系活力測(cè)定

    根系活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)還原法測(cè)定[19]。將幼苗根系清洗并吸干水分后放入含有5 mL 0.4% TTC、5 mL磷酸鹽緩沖液(0.06 mol·L-1,pH 7.0)混合溶液中,使根系完全浸沒(méi),37 ℃黑暗孵育1.5 h后,加入2 mL硫酸溶液(1 mol·L-1)終止反應(yīng),將根系清洗后在無(wú)水乙醇中充分浸提3 h,浸提液于波長(zhǎng)490 nm下比色,測(cè)定三苯基甲臜(TTF)含量,以單位時(shí)間內(nèi)還原產(chǎn)生的TTF量表示根系活力(mg·g-1·h-1)。每處理3次生物學(xué)重復(fù),每重復(fù)12株。

    1.5 砧木子葉淀粉和可溶性糖含量測(cè)定

    砧木子葉中淀粉采用酸水解法提取,淀粉含量測(cè)定采用蒽酮-硫酸法[11]。根系中可溶性糖含量采用蒽酮-硫酸法測(cè)定[11]。每處理3次生物學(xué)重復(fù),每重復(fù)12株。

    1.6 砧木子葉淀粉代謝相關(guān)酶的提取和活性測(cè)定

    選取0、3、7、10、25 dag的砧木子葉凍存樣品,用于淀粉合成酶(starch synthase,SS)、淀粉分支酶(starch branching enzyme,SBE)和β-淀粉水解酶(β-amylase,β-AL)的活性測(cè)定。SS的活性采用可溶性淀粉合成酶(SSS)活性檢測(cè)試劑盒(索萊寶)進(jìn)行測(cè)定,以每克樣品在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol NADPH定義為1個(gè)酶活性單位(U·g-1);SBE的活性采用淀粉分支酶檢測(cè)試劑盒(索萊寶)進(jìn)行測(cè)定,以波長(zhǎng)660 nm的吸光度下降百分率表示,每克樣品在反應(yīng)體系中每降低1% 碘藍(lán)值為1個(gè)酶活性單位(U·g-1);β-AL的活性采用β-水解酶活性檢測(cè)試劑盒(索萊寶)進(jìn)行測(cè)定,以每克樣品在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1 mg還原糖為1個(gè)酶活力單位(U·g-1)。每處理3次生物學(xué)重復(fù),每重復(fù)12株。

    1.7 根系RNA提取和基因表達(dá)水平測(cè)定

    根系總RNA采用EasyPure Plant RNA Kit(全式金,北京)試劑盒提取,用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性,用Nano Drop One(Thermo Scientific,USA)測(cè)定RNA濃度。采用TransScript?All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal)試劑盒(全式金,北京)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和cDNA第一鏈合成。所得cDNA用于Real-time PCR定量分析,試劑盒為T(mén)ransstart?Top Green qPCR Kit(全式金,北京),儀器為L(zhǎng)ightCycler?96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche,瑞典)。

    Real-time PCR反應(yīng)體系(15 μL)為:cDNA模板0.8 μL,TransStart?Top Green qPCR SuperMix 7.5 μL,基因上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.3 μL,ddH2O 6.1 μL。反應(yīng)程序設(shè)置為:95 ℃ 180 s;95 ℃ 5 s,54 ℃ 10 s,72 ℃ 10 s,共50個(gè)循環(huán)。以南瓜持家基因CmoActin作為Real-time PCR的內(nèi)參基因[20],基因相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCt法計(jì)算[21],設(shè)定目標(biāo)基因在0 dag的表達(dá)水平為1.0。待測(cè)目的基因及內(nèi)參基因特異性擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表1。每個(gè)樣品3次重復(fù),每次重復(fù)15株幼苗。

    表1 Real-time PCR所用引物序列

    1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

    試驗(yàn)結(jié)果采用3次獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,采用Microsoft Excel 2019 軟件處理數(shù)據(jù)并作圖,采用SPS 26 軟件最小差異法進(jìn)行顯著性差異分析(α= 0.05)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 C/P和P/P嫁接苗砧木子葉生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)

    圖1,A、B顯示,相較于南瓜自根苗P,單子葉貼接的黃瓜/南瓜嫁接苗(C/P)和南瓜/南瓜嫁接苗(P/P)中砧木子葉的面積和鮮質(zhì)量均顯著增加,且C/P嫁接苗的增加量顯著高于P/P;在嫁接后25 d,C/P砧木子葉的鮮質(zhì)量和面積分別是P/P的1.29倍和1.12倍;去除一片子葉的南瓜幼苗(-/P)的子葉面積和鮮質(zhì)量均增加,且增加量顯著高于C/P和P/P嫁接苗。

    同時(shí),圖1,C、D進(jìn)一步比較了砧木子葉在嫁接后不同時(shí)期鮮質(zhì)量和面積的凈增長(zhǎng)量。其中,C/P砧木子葉的鮮質(zhì)量主要在嫁接愈合期1~7 dag顯著增長(zhǎng),占總增長(zhǎng)量的73.70%,此外其在10~18 dag期間也有增長(zhǎng);P/P砧木子葉的鮮質(zhì)量在嫁接愈合期0~1 dag的增長(zhǎng)占總增長(zhǎng)量的49.08%;而-/P幼苗的子葉除在0~3 dag期間顯著增長(zhǎng)外,在生長(zhǎng)后期(10~25 dag)還有一個(gè)更大幅度的增長(zhǎng);P幼苗的子葉則僅在0~1 dag時(shí)快速增長(zhǎng)(圖1,C)。各砧木子葉面積的增長(zhǎng)模式與其鮮質(zhì)量增加模式略有差異,所有處理在0~1 dag時(shí)均有一個(gè)快速增大的過(guò)程(圖1,D);此外,C/P嫁接苗的砧木子葉面積在1~7 dag、10~18 dag有顯著增大,P/P嫁接苗的砧木子葉面積僅在3~7 dag時(shí)顯著增大;-/P幼苗子葉面積有兩個(gè)增大期(1~7 dag、10~25 dag),而P幼苗的子葉面積有一個(gè)增大期(1~3 dag)。

    C/P. 黃瓜/南瓜嫁接苗;P/P. 南瓜/南瓜嫁接苗;-/P. 去除一片子葉和生長(zhǎng)點(diǎn)的南瓜自根苗;P. 南瓜自根苗;dag. 嫁接后天數(shù)。同一處理內(nèi)不同小寫(xiě)字母表示生長(zhǎng)不同時(shí)期間差異顯著(P < 0.05);下同圖1 C/P和P/P嫁接苗砧木子葉的生長(zhǎng)情況C/P. Cucumber/pumpkin grafted seedling;P/P. Pumpkin/pumpkin grafted seedling;-/P. Pumpkin seedling with one cotyledon and apical meristem removed;P. Intact pumpkin seedling. dag. Days after grafting. Different normal letters within each treatment indicate the significant differences among various times at 0.05 level (P < 0.05); The same as belowFig.1 Growth of rootstock cotyledon in C/P and P/P grafted seedlings

    上述結(jié)果表明,在單子葉貼接后,各嫁接苗的砧木子葉均迅速生長(zhǎng),并以C/P嫁接苗砧木子葉的增長(zhǎng)量高于P/P嫁接苗,且兩者增長(zhǎng)時(shí)期分布也存在差異,C/P的砧木子葉在嫁接后的早期和后期均有增加,而P/P的砧木子葉僅在嫁接后早期有顯著增加。

    2.2 C/P和P/P嫁接苗砧木子葉的淀粉含量變化

    淀粉是葉片光合作用產(chǎn)物的主要貯存形式[22]。圖2顯示,C/P嫁接苗砧木子葉淀粉含量在1 dag和3 dag時(shí)下降,之后逐漸升高,至愈合期結(jié)束時(shí)(7 dag)是嫁接前(0 dag)的2.36倍,并在10 dag和13 dag時(shí)達(dá)到最高,之后隨著幼苗生長(zhǎng)迅速降低。與C/P嫁接苗表現(xiàn)類(lèi)似,P/P嫁接苗砧木子葉中淀粉含量在嫁接愈合期1~5 dag時(shí)顯著降低,并在7 dag和10 dag時(shí)達(dá)到最高,7 dag時(shí)較0 dag顯著升高約70%,之后隨著幼苗生長(zhǎng)逐漸降低;P/P嫁接苗砧木子葉淀粉含量幾乎始終低于同期C/P嫁接苗。與嫁接苗不同,自根苗P和-/P的子葉淀粉含量隨著幼苗生長(zhǎng)呈先升高后降低的趨勢(shì),P幼苗子葉淀粉在10~13 dag時(shí)達(dá)到最高,而-/P幼苗子葉淀粉含量在18 dag時(shí)達(dá)到最高。

    圖2 C/P和P/P嫁接苗砧木子葉中淀粉含量隨生長(zhǎng)的變化Fig.2 Changes of starch content in cotyledons during growth of C/P and P/P grafted seedlings

    2.3 C/P和P/P嫁接苗砧木子葉中淀粉代謝相關(guān)酶的活性變化

    首先,C/P嫁接苗砧木子葉中可溶性淀粉合成酶(SSS)的活性在0 dag時(shí)最高,之后逐漸降低,至7 dag時(shí)達(dá)到最低,在10 dag時(shí)有所升高,并于25 dag時(shí)再次降低;P/P嫁接苗砧木和-/P自根苗子葉中SSS活性變化規(guī)律與C/P類(lèi)似,但在7 dag時(shí)SSS活性高于C/P;P自根苗子葉中SSS活性呈持續(xù)降低的趨勢(shì),在25 dag時(shí)活性最低,只有0 dag時(shí)的15.13%(圖3,A)。

    其次,C/P嫁接苗砧木子葉中淀粉分支酶(SBE)活性在3 dag時(shí)降低,并在7 dag時(shí)升高,至10 dag時(shí)達(dá)到最高,但在25 dag時(shí)再次明顯降低;P/P嫁接苗砧木子葉中SBE活性在3~7 dag時(shí)維持在較低水平,在10 dag時(shí)有所升高,但仍顯著低于同期C/P嫁接苗;-/P自根苗子葉中SBE活性在3~7 dag時(shí)逐漸降低,而在10~25 dag時(shí)逐漸升高;P自根苗子葉中SBE活性在0~10 dag時(shí)相對(duì)穩(wěn)定,但在25 dag時(shí)顯著降低,只有0 dag時(shí)的44.04%(圖3,B)。

    另外,C/P和P/P嫁接苗砧木子葉的β-淀粉酶(β-AL)活性變化規(guī)律相似,均在3 dag時(shí)升高,并在7 dag時(shí)降低,在25 dag時(shí)活性最低,只有0 dag時(shí)的約53.86%;在10 dag時(shí),C/P砧木子葉中β-AL活性有一個(gè)顯著升高的過(guò)程,且顯著高于同期P/P嫁接苗。-/P自根苗子葉中β-AL活性在3 dag時(shí)迅速降低,之后維持在27.11 U·g-1左右,而自根苗P子葉中β-AL活性在0~7 dag時(shí)比較穩(wěn)定,在10 dag時(shí)顯著降低(圖3,C)。

    圖3 C/P和P/P嫁接苗砧木子葉中淀粉代謝相關(guān)酶活性變化Fig.3 Enzyme activities related to starch metabolism in the rootstock cotyledon of C/P and P/P grafted seedlings

    2.4 去除砧木子葉對(duì)C/P和P/P嫁接苗生長(zhǎng)以及根系活力和相關(guān)基因表達(dá)的影響

    2.4.1 生長(zhǎng)指標(biāo)通過(guò)單子葉貼接的C/P和P/P嫁接苗,分別在嫁接后不同時(shí)間去除砧木子葉,進(jìn)一步觀(guān)測(cè)砧木子葉去留對(duì)嫁接苗(25 dag)生長(zhǎng)發(fā)育的影響。結(jié)果(表2)顯示,P/P嫁接苗接穗和根系的生長(zhǎng)(生物量、總?cè)~面積)受到砧木子葉去留的影響較小,而C/P嫁接苗生長(zhǎng)受到嫁接后砧木子葉去留的影響較大,尤其是嫁接后早期去除砧木子葉顯著抑制嫁接苗接穗和根系生長(zhǎng),并以0 dag去除砧木子葉的抑制作用最強(qiáng)。其中,與對(duì)照(保留砧木子葉)相比,C/P嫁接苗接穗部分的鮮質(zhì)量在0~3dag、干質(zhì)量在0~5 dag、葉片總面積在0~13 dag均顯著降低,降幅分別為17.99%~21.08%、18.44%~23.15%、12.46%~36.57%,而其砧木部分的鮮質(zhì)量在0~13 dag、干質(zhì)量在0~5 dag均顯著降低,降幅分別為32.0%~42.0%、28.80%~39.16%。

    2.4.2 根系活力及其可溶性糖含量嫁接后去除砧木子葉對(duì)各嫁接苗(25 dag)根系活力有不同的影響(圖4)。其中,各個(gè)時(shí)期去除砧木子葉對(duì)P/P嫁接苗的根系活力均無(wú)顯著影響,而對(duì)于C/P嫁接苗根系活力產(chǎn)生不同影響,且去除時(shí)間越早受到影響越嚴(yán)重。C/P嫁接苗根系活力以對(duì)照最高,在0~10 dag去除砧木子葉均會(huì)導(dǎo)致嫁接苗根系活力顯著降低,并以0 dag時(shí)去除子葉的影響最大(根系活力只有對(duì)照的30.64%);在1~10 dag時(shí)去除砧木子葉根系活力降低了約45%;在13~18 dag時(shí)去除砧木子葉對(duì)根系活力的影響較小,根系活力降低不到10%。

    不同小寫(xiě)字母表示處理時(shí)間之間在0.05 水平差異顯著(P < 0.05);下同圖4 嫁接后去除砧木子葉對(duì)C/P和P/P嫁接苗根系活力的影響Different normal letters indicate the significant differences in different treatment times at 0.05 level (P < 0.05);The same as belowFig.4 Effects of removing rootstock cotyledon on root vigor of C/P and P/P grafted seedlings

    表2 嫁接后不同時(shí)間去除砧木子葉對(duì)C/P和P/P嫁接苗生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

    同時(shí),嫁接后去除砧木子葉對(duì)嫁接苗根系可溶性糖含量也有相似的影響(圖5)。其中,各時(shí)期去除砧木子葉對(duì)P/P嫁接苗根系中可溶性糖含量均無(wú)顯著影響,而對(duì)于C/P嫁接苗根系可溶性糖含量產(chǎn)生不同影響,并在0~10 dag時(shí)去除砧木子葉均引起顯著降低,此時(shí)根系可溶性糖含量約為對(duì)照的66%左右,而在18 dag時(shí)去除砧木子葉根系可溶性糖含量與對(duì)照無(wú)顯著差異。

    圖5 嫁接后去除砧木子葉對(duì)C/P和P/P嫁接苗根系可溶性糖含量的影響Fig.5 Effects of removing rootstock cotyledon on the soluble sugar content in roots of C/P and P/P grafted seedlings

    2.4.3 根系CWIN和HXK基因表達(dá)水平比較去除砧木子葉嫁接苗根系CWIN和HXK基因表達(dá)水平(圖6)發(fā)現(xiàn),P/P嫁接苗根中CmoCWIN1、CmoCWIN6和CmoHXK2基因表達(dá)水平在去除砧木子葉后均未受到顯著影響,僅嫁接苗根系CmoHXK1的表達(dá)水平在3 dag去除砧木子葉處理中略有降低;而C/P嫁接苗根中CmoCWIN1、CmoCWIN6、CmoHXK1和CmoHXK2基因的表達(dá)水平在嫁接后各時(shí)期去除砧木子葉后均不同程度降低,并均以0 dag時(shí)去除砧木子葉處理的表達(dá)水平最低,分別比對(duì)照顯著降低52.35%、46.51%、23.76%和46.50%。以上結(jié)果說(shuō)明在C/P中和去除砧木子葉引起嫁接苗根系中糖代謝水平降低,導(dǎo)致根系活力降低。

    圖6 嫁接后去除砧木子葉對(duì)C/P和P/P嫁接苗根系CWIN和HXK基因表達(dá)水平的影響Fig.6 Effects of removing rootstock cotyledon on CWIN and HXK genes expression in roots of C/P and P/P grafted seedlings

    3 討 論

    黃瓜是重要的蔬菜作物,嫁接可以有效克服土壤連作障礙、增強(qiáng)抗逆性和抗病性,提高產(chǎn)量和品質(zhì)[23-26]。單子葉貼接因其嫁接成活率高、便于機(jī)械化操作等優(yōu)點(diǎn),是黃瓜嫁接的主要方法之一[4]。嫁接砧穗間互作是當(dāng)前的研究熱點(diǎn),包括砧木對(duì)地上部接穗的影響以及接穗對(duì)砧木的反饋調(diào)控[11, 27-28]。砧木子葉作為嫁接苗早期生長(zhǎng)最主要的源器官,目前對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育動(dòng)態(tài)及其對(duì)接穗和根系生長(zhǎng)的影響仍缺乏了解。

    本研究發(fā)現(xiàn),-/P自根苗以及C/P和P/P嫁接苗中,砧木子葉的面積和鮮質(zhì)量迅速增大,且子葉增加量表現(xiàn)為-/P > C/P > P/P > P。黃瓜和南瓜均為雙子葉植物,子葉是早期幼苗進(jìn)行光合作用的主要場(chǎng)所,較大的葉表面積可以最大限度地接受光照、增加光合效率[29],去除其中一片子葉,植物為提高源器官的強(qiáng)度,勢(shì)必會(huì)引起另一片子葉顯著增大,這與Mayoral等[30]的報(bào)道一致。在本研究中,對(duì)于不同砧穗組合的幼苗砧木子葉增大的時(shí)期不同。對(duì)于南瓜自根苗P,子葉在0~1 dag時(shí)期明顯增大,表明南瓜幼苗子葉在此時(shí)(即出苗后5~6 d)生長(zhǎng)基本完成;對(duì)于自根苗-/P,子葉在早期(0~7 dag)和后期(10~25 dag)都有顯著增大;嫁接苗P/P砧木子葉隨時(shí)間的增長(zhǎng)模式與P自根苗相似,而C/P嫁接苗砧木子葉的增長(zhǎng)模式則介于P/P和-/P之間,這可能與異源嫁接苗的愈合速率慢于自體嫁接苗有關(guān)[31]。這些結(jié)果表明,單子葉貼接后,嫁接苗砧木子葉顯著增長(zhǎng),且增長(zhǎng)幅度與時(shí)期因接穗不同而異。

    淀粉作為植物中碳水化合物的一種主要貯存形式,在調(diào)節(jié)植物源-庫(kù)關(guān)系中起重要作用[13]。本研究中C/P和P/P嫁接苗砧木子葉中淀粉含量在嫁接愈合期(1~7 dag)顯著降低。在嫁接愈合初期,砧穗間尚未連通,砧木子葉是嫁接苗最主要的源器官,子葉中淀粉水解可為嫁接愈合提供所需的能量[10]。砧木子葉中淀粉的減少與淀粉合成酶SSS和SBE活性降低、淀粉水解酶β-AL活性升高一致。SSS和SBE協(xié)同負(fù)責(zé)淀粉的合成[32]。嫁接愈合期弱光、高濕的環(huán)境引起SSS和SBE活性顯著降低,這與已有研究報(bào)道一致。在木薯、大豆等植物中,遮蔭和弱光處理可顯著抑制葉片中SS、SBE等淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)和酶活性[33-35]。β-AL負(fù)責(zé)從淀粉分子的非還原性末端依次切割α-1,4-糖苷鍵,產(chǎn)生β-麥芽糖,是植物葉片中淀粉水解的關(guān)鍵酶[36]。水分脅迫可促進(jìn)黃瓜子葉中β-AL活性升高,增加子葉中蔗糖含量,蔗糖作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),保護(hù)子葉細(xì)胞免受脅迫傷害[37]。β-AL的基因表達(dá)和酶活性也受糖信號(hào)誘導(dǎo)。對(duì)擬南芥蓮葉片施加蔗糖、葡萄糖或果糖后,β-AL基因表達(dá)和活性都有顯著升高[38]。在嫁接愈合期,切削引起砧木子葉失水導(dǎo)致β-AL活性升高,而嫁接愈合的高能量需求引起蔗糖、葡萄糖等升高,進(jìn)一步促進(jìn)了β-AL基因表達(dá)和活性升高。

    隨著嫁接傷口逐漸愈合,能量需求降低,且維管束逐漸連通,接穗葉片補(bǔ)充成為新的源器官,砧木子葉中的光合產(chǎn)物以淀粉形式逐漸積累,淀粉含量迅速升高,且C/P砧木子葉淀粉含量顯著高于P/P。嫁接愈合期結(jié)束后,接穗葉片逐漸成為主要的源器官,接穗新葉和根系是嫁接苗的主要庫(kù)器官,由于C/P嫁接苗接穗和根系的生長(zhǎng)(即庫(kù)的強(qiáng)度)均弱于P/P嫁接苗,C/P砧木子葉中更多的光合產(chǎn)物用于合成淀粉,并貯存在子葉中。與此相一致,砧木子葉中SSS和SBE活性升高,且C/P砧木子葉中SBE活性顯著高于P/P。之后嫁接苗快速生長(zhǎng),砧木子葉中貯存的淀粉逐漸水解,供接穗和根系生長(zhǎng)所需。綜合上述結(jié)果,在黃瓜單子葉貼接苗中,砧木子葉可作為一個(gè)貯存器官,在嫁接愈合期子葉淀粉水解為接口愈合提供能量,在愈合期結(jié)束后及幼苗生長(zhǎng)早期,子葉中多余的光合產(chǎn)物以淀粉形式儲(chǔ)存起來(lái),并在幼苗生長(zhǎng)后期水解,為嫁接苗接穗和根系的快速生長(zhǎng)提供碳源。

    為驗(yàn)證上述結(jié)論,進(jìn)一步分析了嫁接后不同時(shí)期去除砧木子葉對(duì)嫁接苗生長(zhǎng)的影響。研究發(fā)現(xiàn),嫁接后去除砧木子葉對(duì)P/P嫁接苗的生長(zhǎng)和根系活力無(wú)顯著影響,而對(duì)于C/P嫁接苗在13 dag之前去除砧木子葉均可顯著抑制嫁接苗生長(zhǎng)和根系活力,并以0 dag時(shí)去除砧木子葉的抑制作用最強(qiáng)。分析其原因,去除砧木子葉后導(dǎo)致子葉中貯存的淀粉無(wú)法為C/P嫁接苗接穗和根系生長(zhǎng)提供碳源,生長(zhǎng)受到顯著抑制,而在生長(zhǎng)后期砧木子葉的淀粉已經(jīng)基本被水解利用,因此去除子葉對(duì)生長(zhǎng)的抑制作用消失。與此結(jié)果一致,去除砧木子葉引起C/P嫁接苗根系可溶性糖含量以及CmoCWIN1、CmoCWIN6、CmoHXK1和CmoHXK2等基因的表達(dá)水平降低。在嫁接后早期去除砧木子葉對(duì)生長(zhǎng)的抑制效果更加顯著,這是由于在早期嫁接苗需要消耗大量能量用于嫁接愈合[10, 39],而去除砧木子葉需要消耗下胚軸等其他部位的碳源,進(jìn)一步導(dǎo)致供應(yīng)接穗和根系生長(zhǎng)的碳源減少,抑制生長(zhǎng)的效果加劇。對(duì)于P/P嫁接苗,砧木子葉大小和淀粉積累量均顯著低于C/P嫁接苗,砧木子葉中淀粉作為貯存性碳源的作用不顯著,且同源嫁接砧穗愈合更快,南瓜作為接穗,其葉片光合面積大,去除砧木子葉對(duì)嫁接苗生長(zhǎng)的影響不顯著。

    綜上所述,C/P單子葉貼接苗的砧木子葉可作為重要的緩沖器官,在嫁接后早期將光合作用產(chǎn)物以淀粉形式貯存起來(lái),并在后期逐漸水解成葡萄糖等單糖,為嫁接苗接穗和根系的快速生長(zhǎng)提供碳源,在嫁接后早期去除砧木子葉在一定程度上會(huì)抑制嫁接苗的生長(zhǎng)。但是C/P嫁接苗的砧木子葉中為何會(huì)積累更多的淀粉?受哪些信號(hào)調(diào)控?這些信號(hào)在接穗和砧木間如何傳遞?這些問(wèn)題將是下一步研究的重點(diǎn)。

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