釀酒葡萄‘赤霞珠’VvbHLH93基因的克隆及分析

徐學(xué)蕾，鞠延侖，王婉妮，吳今人，房玉林,2*

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院，陜西楊陵 712100；2 西北農(nóng)林科技大學(xué)，合陽葡萄試驗示范站，陜西合陽 715307)

葡萄(VitisviniferaL.)是世界上具有重要經(jīng)濟價值的果樹，然而，植物生長的自然環(huán)境是由一系列復(fù)雜的生物脅迫和非生物脅迫構(gòu)成，其中干旱、高溫、低溫、高鹽等非生物脅迫輕則影響植物的生長發(fā)育，重則導(dǎo)致植物的死亡，最終影響作物的質(zhì)量和產(chǎn)量[1-2]。為避免和減輕這些逆境脅迫對植物造成的影響，植物可以在分子、細胞和生理水平上進行應(yīng)答[3]。因此，通過分子生物學(xué)技術(shù)改良植物品質(zhì)，對提高葡萄產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要的意義。

bHLH是廣泛存在于動物、植物及真菌中的一大類呈堿性且有螺旋-環(huán)-螺旋(basic-Helix-Loop-Helix，bHLH)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子[4]，總共含有約50～60個氨基酸[5-6]。其中，堿性氨基酸區(qū)域位于bHLH結(jié)構(gòu)域的N端，含有約15個氨基酸，包括約6個堿性殘基，其主要功能是識別并特異性結(jié)合靶基因啟動子中的DNA序列[7-8]。螺旋環(huán)螺旋區(qū)域位于bHLH結(jié)構(gòu)域的C端，包含約40～50個氨基酸，包括兩個由疏水環(huán)連接的疏水殘基組成的兩性α螺旋，其主要功能是進行結(jié)構(gòu)域二聚化以促進蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)相互作用并允許形成同源二聚體或異源二聚體復(fù)合物以調(diào)節(jié)下游靶基因的表達[9]。

目前，bHLH93的研究集中在擬南芥、蘋果和甜菜等作物中。Sharma[10]研究發(fā)現(xiàn)，AtbHLH93在體內(nèi)和體外與開花抑制劑MAF5啟動子元件結(jié)合，從而調(diào)控擬南芥的開花時間，并在控制擬南芥生長形態(tài)方面發(fā)揮著重要的作用；An等[11]研究表明，蘋果中AtbHLH93的同源基因MdbHLH93受MdBT2蛋白的泛素化修飾，加速ABA調(diào)節(jié)的葉片衰老，并直接激活衰老結(jié)構(gòu)基因MdSAG18的轉(zhuǎn)錄而負調(diào)節(jié)葉片的衰老；Wang等[12]在甜菜的研究中發(fā)現(xiàn)，BvbHLH93可以通過提高抗氧化活性和減少活性氧(ROS)的產(chǎn)生調(diào)節(jié)鹽脅迫耐受性。

bHLH家族是與植物抗逆性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族的第二大家族，在有效應(yīng)對植物生物脅迫及非生物脅迫，提升作物產(chǎn)量方面起著重要的作用[13-14]。葡萄作為世界上種植最廣泛的水果作物之一，具有重要的經(jīng)濟價值[15]。盡管bHLH93在植物生長發(fā)育中具有重要作用，但在葡萄中尚未見相關(guān)研究報道。因此，本研究在克隆葡萄VvbHLH93基因的基礎(chǔ)上進行了生物信息學(xué)分析，并結(jié)合該基因在葡萄不同組織及果實不同生長發(fā)育時期的表達模式分析，以期為深入研究bHLH家族基因的功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗材料為釀酒葡萄‘赤霞珠’(VitisviniferaL. cv. Cabernet Sauvignon)，采自西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院釀酒葡萄示范基地。試驗于2021年6～9月采集不同時期果實；于7月份采集根、莖、葉、芽及果皮，用于不同組織及葡萄不同生長發(fā)育時期的熒光定量分析。所收集材料先使用錫箔紙包好，經(jīng)液氮速凍后，于-80 ℃冰箱保存。

1.2 方 法

1.2.1 基因克隆葡萄樣品的RNA提取采用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)，使用核酸蛋白儀和電泳分析進行質(zhì)量檢測，選擇HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司，南京)對檢測合格的RNA進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物(表1)，并進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物，然后利用膠回收試劑盒(北京天漠科技開發(fā)有限公司，北京)回收基因的片段，并利用核酸蛋白儀檢測回收產(chǎn)物的純度和濃度。引物序列見表1。

表1 VvbHLH93克隆及表達分析所使用的引物及序列

1.2.2 基因生物信息學(xué)分析使用NCBI中ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)對測序獲得的cDNA基因進行開放閱讀框預(yù)測；利用在線ProtParam軟件(https://web.expasy. org/protparam/)對氨基酸序列的基本理化性質(zhì)進行預(yù)測和分析；蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)利用TMHMM工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進行分析；信號肽利用SignalP 4.1(http://www.cbs. dtu. dk/services/SignalP-4.1/)進行分析；利用在線NetPhos 3.1(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1)進行磷酸化位點的預(yù)測；疏水性區(qū)域預(yù)測利用ProtScale(https://web.expasy.org/ cgi-bin/protscale/protscale.pl)進行；蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)利用SCOPMA工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/ cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)進行預(yù)測；利用SWISS-MODEL在線軟件預(yù)測VvbHLH93蛋白三級結(jié)構(gòu)；利用DNAMAN軟件對其編碼的氨基酸序列進行比對；構(gòu)建系統(tǒng)進化樹利用MEGA 6.06軟件中鄰接法法進行；使用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent. be/webtools/plantcare/html/)分析啟動子上的順式作用元素。

1.2.3 基因表達分析分別提取‘赤霞珠’的根、莖、葉、芽及果皮的RNA，各取1 μg為模板，使用HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，于-20 ℃長期保存。以葡萄actin7為內(nèi)參基因并設(shè)計引物(表1)，用RT-qPCR法分析bHLH93在不同組織和果實不同發(fā)育時期的表達量。將cDNA稀釋10倍，參考SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司，南京)試劑盒的反應(yīng)體系進行加樣。用BIO-RAD Cycler IQ6熒光定量PCR儀檢測基因表達量，重復(fù)測定3次。采用2-ΔΔCT法和相關(guān)軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析利用Excel 2016和Origin 2021軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析，采用DPS 6.55軟件進行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 VvbHLH93基因克隆及編碼蛋白的理化特性

采用PCR擴增基因產(chǎn)物檢測得到一條單一明亮的條帶(圖1)。經(jīng)測序并NCBI blast比對，克隆得到的基因編碼核酸序列全長1 319 bp，最大開放閱讀框939 bp，共編碼312個氨基酸(圖2)。ProtParam在線預(yù)測分析顯示，VvbHLH93分子量為35.18 kD，理論等電點為4.68，表明為酸性蛋白；蛋白質(zhì)不穩(wěn)定性指數(shù)56.22，表現(xiàn)為不穩(wěn)定蛋白；通過親/疏水性預(yù)測發(fā)現(xiàn)，屬于親水性蛋白；未發(fā)現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)，無信號肽，不屬于分泌蛋白。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，在VvbHLH93氨基酸組成中，以無規(guī)則卷曲(random coil)為主，占50.96%，其次為α-螺旋(α-helix)，占38.78%，第三位的是β-螺旋(β-helix)，占2.24%。采用SWISS-MODEL在線軟件預(yù)測VvbHLH93蛋白三級結(jié)構(gòu)顯示，該蛋白主要由無規(guī)則卷曲、α-螺旋和β-螺旋組成，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致。NetPhos-3.1預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，VvbHLH93蛋白具有多個磷酸化位點。其中，絲氨酸磷酸化位點最多，有14個；其次為蘇氨酸磷酸化位點，有10個；而酪氨酸磷酸化位點只有3個。

圖1 VvbHLH93的cDNA擴增Fig.1 Amplification of VvbHLH93 cDNA

圖2 VvbHLH93編碼氨基酸預(yù)測序列Fig.2 Deduced amino acid sequence of VvbHLH93

2.2 VvbHLH93進化樹及氨基酸序列同源分析

為了解VvbHLH93與同源序列之間的進化關(guān)系，基于Clustal W對同源序列進行序列多重比對，在此基礎(chǔ)上利用MEGA 6.06構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果(圖3)表明，VvbHLH93與荷花親緣關(guān)系較近，聚為一個亞類，在進化上與蘋果、擬南芥親緣關(guān)系較遠。

圖3 VvbHLH93與其他物種bHLH93蛋白的系統(tǒng)進化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of VvbHLH93 and bHLH93 in various species

將VvbHLH93氨基酸序列和擬南芥、蘋果、白梨、核桃等17種植物bHLH93氨基酸序列進行同源分析。結(jié)果(圖4)表明，VvbHLH93與這些植物bHLH93氨基酸序列都擁有保守的bHLH域。經(jīng)氨基酸序列比對分析，VvbHLH93和其他植物相似性由高到低排列分別為：荷花69.43%，哥倫比亞錦葵62.30%，栓皮櫧62.30%，核桃62.21%，白梨61.93%，蘋果61.76%，可可61.64%，梅花60.98%，櫻桃60.67%，桃60.67%，草莓60.37%，月季59.76%，黃麻59.12%，毛果楊58.39%，胡楊58.07%，異色山黃麻56.80%，擬南芥55%。

紅色方框標記bHLH結(jié)合保守基序圖4 VvbHLH93與其他物種bHLH93蛋白序列比對分析Red box marks bHLH binding conserved motifFig.4 Protein sequence alignment analysis of VvbHLH93 and bHLH93 in various species

2.3 VvbHLH93啟動子順式元件的預(yù)測與分析

啟動子順式元件預(yù)測表明，VvbHLH93基因的啟動子含有激素信號和脅迫響應(yīng)的相關(guān)元件，包括光響應(yīng)元件(AE-box、GT1-motif、TCT-motif等)和低溫、干旱等應(yīng)答元件(表2)。表明該基因可能參與植物生理調(diào)控及對逆境的響應(yīng)過程。

表2 VvbHLH93啟動子順式元件預(yù)測

不同小寫字母表示不同組織基因的表達差異顯著(P<0.05)，下同圖5 VvbHLH93在赤霞珠不同組織中的相對表達量Different normal letters indicate differences between different tissues for the same gene at 0.05 level. The same as belowFig.5 The relative expression levels of VvbHLH93 in different tissues

2.4 VvbHLH93的表達分析

2.4.1 在葡萄不同組織中的表達如圖5所示，VvbHLH93在‘赤霞珠’不同組織中表達水平存在顯著差異，在根、莖、葉、芽、果皮不同組織中均有表達。從相對表達量來看，VvbHLH93在莖中的表達量最高，顯著高于VvbHLH93在其他組織中的表達水平；其次是芽和果皮，但VvbHLH93在芽和果皮中的表達量無顯著差異；VvbHLH93在根中的表達量較低，在葉片中的表達量顯著低于其他組織。說明VvbHLH93在‘赤霞珠’不同組織中的表達具有組織特異性。

2.4.2 在葡萄果實不同發(fā)育時期的表達如圖6所示，隨著赤霞珠葡萄果實的發(fā)育成熟，VvbHLH93相對表達量不斷降低，第5周后相對表達量基本為0，總體呈現(xiàn)出降低的變化趨勢。

0.幼果期(直徑> 2 mm)；1～11依次為幼果期后1～11周采樣圖6 VvbHLH93在不同發(fā)育時期中的相對表達量0. Young fruit stage (diameter > 2 mm); 1—11 samples were collected at 1—11 weeks after young fruit stage Fig.6 The relative expression levels of VvbHLH93 in different stages

2.4.3 在不同脅迫處理下的表達通過順式作用元件分析，在VvbHLH93啟動子序列中預(yù)測到了多個與植物激素和逆境脅迫相關(guān)的響應(yīng)元件，表明該基因可能在響應(yīng)非生物脅迫的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制發(fā)揮作用。進一步通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，VvbHLH93基因在高溫脅迫、鹽脅迫、低溫脅迫和充分灌溉脅迫下具有表達特異性(圖7)。脅迫試驗數(shù)據(jù)表明，低溫、鹽、高溫和充分灌溉處理‘赤霞珠’盆栽苗6 h后，VvbHLH93的表達量顯著下調(diào)(P<0.05)，分別為對照的52%、10%、13%和7%。

CK. 對照；LW. 4 ℃低溫；NaCl. 鹽；HW. 40 ℃高溫；FI. 充分灌溉圖7 VvbHLH93在不同脅迫下的相對表達量CK. 28 ℃ control group； LW. 4 ℃ low temperature； NaCl. Salt；HW. 40 ℃ high temperature； FI. Full irrigation Fig.7 The relative expression levels of VvbHLH93 under different stresses

3 討 論

bHLH轉(zhuǎn)錄因子是植物細胞生長發(fā)育、應(yīng)對各種脅迫的關(guān)鍵調(diào)控因子，具有促進植物開花[16]、調(diào)節(jié)植物抗旱性[17-18]和耐鹽性[19-20]等重要作用。目前葡萄bHLH轉(zhuǎn)錄因子的功能研究相對較少，還有大量成員的功能未知。

本研究以釀酒葡萄‘赤霞珠’為研究對象，克隆獲得VvbHLH93的全長cDNA序列，并對其進行了初步的生物信息學(xué)分析和表達特性分析。該基因編碼312個氨基酸，具有高度保守的bHLH結(jié)構(gòu)域，屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員。氨基酸序列進行同源性分析和系統(tǒng)進化樹分析表明VvbHLH93與荷花bHLH93同源關(guān)系最近。

qRT-PCR分析結(jié)果表明VvbHLH93在‘赤霞珠’不同組織中表達水平存在顯著差異，從相對表達量來看，VvbHLH93在莖中的表達量最高，在葉片中的表達量最低。表明VvbHLH93在‘赤霞珠’不同組織中的表達具有組織特異性。與煙草的研究存在不同，NtbHLH93在根中表達量最高[21]。VvbHLH93在葡萄果實不同發(fā)育時期中的表達量差異比較顯著，發(fā)育后期基本不表達，總體呈現(xiàn)降低的變化趨勢。

AtbHLH93已被證實是參與調(diào)節(jié)擬南芥生長發(fā)育和開花時間的重要因子之一[10,22]，NtbHLH93基因在煙草甾醇代謝中發(fā)揮著重要作用[23]，在蘋果中，MdbHLH93和MdBT2蛋白相互作用，并激活下游結(jié)構(gòu)基因MdSAG18的轉(zhuǎn)錄而負調(diào)節(jié)葉片的衰老[11]。然而，關(guān)于VvbHLH93功能的相關(guān)研究報道較少，Muoz-Espinoza等[15]通過qPCR實驗研究發(fā)現(xiàn)VvbHLH93在大小不同的漿果中存在差異表達，可能參與調(diào)控漿果重量，改善漿果品質(zhì)；Song等[24]研究發(fā)現(xiàn)VvbHLH93與MYB激活劑和抑制劑相關(guān)，并且受低溫脅迫的誘導(dǎo)。此外，轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，外源碳處理和光照處理后VvbHLH93的表達量發(fā)生變化，說明其可能參與調(diào)節(jié)葡萄的生長發(fā)育及品質(zhì)形成[25-26]。在VvbHLH93啟動子順式元件預(yù)測中，VvbHLH93基因的啟動子含有多種激素信號和脅迫響應(yīng)的相關(guān)元件，包括光響應(yīng)元件和低溫、干旱等應(yīng)答元件。在煙草的研究發(fā)現(xiàn)，bHLH93的表達會受光的影響而上調(diào)[27]。以上研究為進一步明確VvbHLH93的功能提供了思路。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)VvbHLH93響應(yīng)高溫、鹽、低溫和充分灌溉脅迫，與對照相比，脅迫處理下VvbHLH93基因表達量顯著下調(diào)，尤其是充分灌溉脅迫下VvbHLH93基因表達量下降最多，僅為對照的7%，這與已有的研究一致[28]。

綜上所述，本研究以釀酒葡萄‘赤霞珠’為試驗材料，克隆獲得了轉(zhuǎn)錄因子bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一VvbHLH93，并發(fā)現(xiàn)其在不同組織和果實不同發(fā)育階段具有表達特異性。通過對VvbHLH93在多種非生物脅迫下的表達模式分析發(fā)現(xiàn)，VvbHLH93不同程度地響應(yīng)高溫、鹽、低溫和充分灌溉脅迫，尤其是在鹽、低溫和充分灌溉脅迫下，該基因的表達量顯著下調(diào)。因此推測VvbHLH93是負調(diào)控葡萄抗逆脅迫的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。本研究為了解VvbHLH93基因在葡萄生長發(fā)育和抗逆境機制提供了一定的理論參考，以便為葡萄的育種和抗逆性增強工作奠定基礎(chǔ)。