eccDNA的高通量基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)方法及其作為生物標(biāo)志物的臨床意義

李夢(mèng)婷，萬(wàn)紹貴

（1. 贛南醫(yī)學(xué)院2019級(jí)碩士研究生；2. 贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子病理中心，江西 贛州 341000）

DNA 分為染色體DNA 和染色體外DNA，染色體外DNA 又分為細(xì)胞器染色體外DNA（如線粒體DNA）和非細(xì)胞器染色體外DNA（如eccDNA）。染色體DNA 和線粒體DNA 早已被大家所熟知，但eccDNA 卻不被大眾所熟知，直至1965 年科學(xué)家首次在野豬精子［1］、兒童胚胎腫瘤樣本和成人支氣管癌癥患者樣本［2］中發(fā)現(xiàn)了eccDNA，才證實(shí)了它的存在。隨著學(xué)者們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，eccDNA 廣泛存在于酵母、健康人體、腫瘤樣本和癌癥細(xì)胞系中［3-7］。目前研究發(fā)現(xiàn)，eccDNA 小到幾十bp 大到幾百M(fèi)b，根據(jù)eccDNA 大小對(duì)其進(jìn)行分類，分子量在0.2～0.4 kb 的稱為microDNA［8］；分子量在10～100 kb 的稱為spcDNA［9］；分子量在100 kb 至幾十Mb 大小的eccDNA 稱為ecDNA，例如雙微體（Double minutes，DMs）；分子量 在100 Mb 以上的eccDNA 稱 為 新 染色體［8，10-12］。

最初研究eccDNA 的方法局限于在電子顯微鏡下觀察有無(wú)環(huán)狀DNA 分子位于染色體外［2］，僅可觀察到如雙微體等較大的eccDNA；核型制備或氯化物密度梯度鑒定eccDNA 的存在［13-14］；熒光原位雜交技術(shù)（簡(jiǎn)稱FISH）觀察有無(wú)環(huán)形擴(kuò)增子且位于染色體外［15］；這些方法均能證明eccDNA 的存在但無(wú)法進(jìn)一步探索eccDNA 的功能。隨著基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，基于基因測(cè)序技術(shù)開發(fā)的針對(duì)eccDNA 測(cè)序數(shù)據(jù)的分析算法有助于學(xué)者們進(jìn)一步挖掘eccDNA潛在的生物學(xué)功能?；谀[瘤組織樣本和細(xì)胞系樣本，WU S H 等［15］發(fā)現(xiàn)位于eccDNA 上的致癌基因呈高表達(dá)，且與位于線性DNA 上的致癌基因相比，具有更高的轉(zhuǎn)錄活性，其自身具有更高的染色質(zhì)開放度；VERHAAK R G W 等［16］和MORTON A R 等［17］發(fā)現(xiàn)eccDNA 的環(huán)狀結(jié)構(gòu)具有遠(yuǎn)距離調(diào)控的功能，環(huán)狀結(jié)構(gòu)有利于將線性DNA上距離較遠(yuǎn)的基因和調(diào)控序列整合在一起，促進(jìn)致癌基因的表達(dá)；HUNG K L等［18］在多種癌癥細(xì)胞系樣本中發(fā)現(xiàn)eccDNA 可以“抱團(tuán)行動(dòng)”，驅(qū)動(dòng)分子間增強(qiáng)子信號(hào)，進(jìn)一步促使癌基因的表達(dá)；WANG Y G等［19］揭示了eccDNA與固有免疫活性的關(guān)系。除此之外，有學(xué)者還揭示了eccDNA 與腫瘤異質(zhì)性、腫瘤藥物治療產(chǎn)生的腫瘤耐藥性、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的衰老息息相關(guān)［10，20-22］。一系列的研究成果都表明了基因測(cè)序技術(shù)在探索eccDNA功能中占據(jù)了重要地位。本文針對(duì)不同高通量基因測(cè)序技術(shù)在探索eccDNA 功能中的應(yīng)用及目前研究者利用外周血樣本或血漿樣本挖掘出的eccDNA相關(guān)研究成果進(jìn)行簡(jiǎn)要闡述。

1 eccDNA 的二代基因測(cè)序（Next-generation sequencing，NGS）檢測(cè)技術(shù)

二代基因測(cè)序（Next-generation sequencing，NGS）檢測(cè)技術(shù)又稱高通量測(cè)序技術(shù)，是基于PCR的基因測(cè)序技術(shù)，目前的NGS 測(cè)序平臺(tái)主要包括羅氏的454 FLX 和Illumina 的Miseq/Hiseq。有學(xué)者利用Illunima 測(cè)序平臺(tái)對(duì)DNA 樣本進(jìn)行測(cè)序，開發(fā)出一系列數(shù)據(jù)分析算法，挖掘樣本中檢測(cè)到的eccDNA包含的遺傳信息。目前基于NGS 測(cè)序的eccDNA 檢測(cè)方法主要分為兩大類。第一類不進(jìn)行eccDNA 富集，提取DNA 樣本，直接進(jìn)行全基因組測(cè)序（Whole genome sequencing，WGS），運(yùn)用Amplicon Architect算法進(jìn)行數(shù)據(jù)進(jìn)行分析［23］；第二類進(jìn)行eccDNA 富集，利用恒溫?cái)U(kuò)增酶phi29 的生物學(xué)特性，即進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增（Rolling circle amplification，RCA），根據(jù)Illunima 測(cè)序平臺(tái)文庫(kù)制備要求處理富集后的樣本并測(cè)序，運(yùn)用Circle-seq/Circle-map 分析流程進(jìn)行數(shù)據(jù)分析［24-25］。WGS能夠檢測(cè)出較大的eccDNA分子，如ecDNA，但樣本中含有大量線性DNA，eccDNA 分子也未富集，故背景干擾過(guò)大，測(cè)序數(shù)據(jù)中eccDNA豐度較低，大量測(cè)序數(shù)據(jù)為無(wú)效數(shù)據(jù)；樣本去除線粒體DNA 和線性DNA 后，進(jìn)行RCA，富集eccDNA，提高了eccDNA 豐度，降低了背景噪音的干擾，有利于提高eccDNA 分子的檢出率，小分子量的eccDNA較大分子量的ecDNA 更容易富集，故RCA 后的樣本ecDNA檢出率較低。

基于Amplicon Architect 分析算法，有學(xué)者通過(guò)分析3 212例癌癥患者樣本的WGS數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，ecDNA的擴(kuò)增與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，與不含ecDNA 患者相比，含有ecDNA 患者的五年生存率更差，且位于ecDNA 上的原癌基因具有更高的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)一步加劇了癌癥的發(fā)生發(fā)展［26-27］。HUNG K L等［18］對(duì)多種癌癥細(xì)胞系進(jìn)行WGS測(cè)序，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)ecDNA分子不僅可促進(jìn)致癌基因表達(dá)，且細(xì)胞內(nèi)的ecDNA分子之間能進(jìn)行相互調(diào)控，一個(gè)ecDNA 分子上的增強(qiáng)子能夠促進(jìn)另一ecDNA 分子上致癌基因的表達(dá)，致癌基因表達(dá)產(chǎn)物又可反作用于增強(qiáng)子所在的ecDNA分子攜帶基因的表達(dá)。KOCHE R P等［25］通過(guò)DNA和RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，eccDNA是體細(xì)胞重排造成的意外產(chǎn)物，具有重要的功能和臨床免疫缺陷，且進(jìn)一步證明了樣本經(jīng)RCA 富集后檢測(cè)到的eccDNA 分子數(shù)高于樣本直接進(jìn)行WGS檢測(cè)到的eccDNA分子數(shù)。

基于NGS數(shù)據(jù)，研究者還開發(fā)出ATAC-seq方法來(lái)鑒定eccDNA 分子，并發(fā)布了Circle_finder 的分析方法。ATAC-seq盡管無(wú)對(duì)線性DNA或eccDNA進(jìn)行富集，但該方法能有效識(shí)別eccDNA分子中串聯(lián)片段的重復(fù)位點(diǎn)，進(jìn)一步挖掘eccDNA與腫瘤的關(guān)系［28］。

2 eccDNA 的三代基因測(cè)序（Third-generation sequencing，TGS）檢測(cè)技術(shù)

三代基因測(cè)序（Third-generation sequencing，TGS）檢測(cè)技術(shù)又稱長(zhǎng)讀長(zhǎng)基因測(cè)序技術(shù)，相較于NGS 短讀長(zhǎng)的不足，TGS 很好地彌補(bǔ)了由于短讀長(zhǎng)特點(diǎn)導(dǎo)致的數(shù)據(jù)拼接困難、對(duì)拷貝數(shù)變異的識(shí)別困難；TGS 無(wú)需進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，彌補(bǔ)了NGS 由于PCR擴(kuò)增導(dǎo)致對(duì)串聯(lián)重復(fù)區(qū)域和GC 含量較高區(qū)域的測(cè)序困難。eccDNA 多來(lái)源于染色體串聯(lián)重復(fù)序列［29-30］，這對(duì)來(lái)源于染色體串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的eccDNA的NGS 測(cè)序數(shù)據(jù)組裝和挖掘是一個(gè)巨大挑戰(zhàn)，故研究學(xué)者利用TGS 測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)eccDNA。目前TGS測(cè)序平臺(tái)主要有PacBio 公司的SMRT 和Oxford 公司的Nanopore。

MEHTA D 等［31］基 于SMRT 測(cè) 序 技 術(shù) 開 發(fā) 出CIDER-Seq 實(shí)驗(yàn)和分析流程，用于檢測(cè)樣本中已知或未知的環(huán)狀DNA。除了鑒定eccDNA 的存在，基于PacBio 公司的測(cè)序平臺(tái)，F(xiàn)AN X Y 等［32］開發(fā)了SMOOTH-Seq 的方法，通過(guò)檢測(cè)人類癌癥細(xì)胞系和直腸癌樣本區(qū)分了eccDNA 和染色體本身結(jié)構(gòu)變異（Structure variations，SVs），而依靠NGS 平臺(tái)很難檢測(cè) 此 類SVs 事 件。HUNG K L 等［18］和WANG Y G等［19］同年在Nature 上發(fā)表了基于Nanopore 測(cè)序技術(shù)，揭示了eccDNA 未知的生物學(xué)功能，WANG Y G等［19］還開發(fā)了ecc_RCA_nanopore 的數(shù)據(jù)分析流程，用于檢測(cè)測(cè)序數(shù)據(jù)中含有的eccDNA豐富度。

由于TGS 的準(zhǔn)確率低于NGS，故研究者利用NGS 測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)TGS 測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行校正，以獲得更精確的長(zhǎng)片段，用于eccDNA生物學(xué)功能的挖掘［25］。

3 eccDNA作為生物標(biāo)志物的臨床意義

研究者不僅在癌癥樣本和癌癥細(xì)胞系中檢測(cè)到eccDNA，也在血漿樣本中發(fā)現(xiàn)了eccDNA 的存在，且與組織樣本和細(xì)胞系樣本檢測(cè)的eccDNA 具有相同的特性：主要來(lái)源于染色體外顯子、5'UTR、3'UTR等區(qū)域［32-33］。KUMAR P等［34］通過(guò)收集同一肺癌和卵巢癌患者術(shù)前術(shù)后的血漿或血清樣本進(jìn)行測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，肺癌和卵巢癌患者術(shù)前eccDNA 水平更高且更長(zhǎng)，這一發(fā)現(xiàn)為肺癌和卵巢癌患者液體活檢提供了新的研究方向，eccDNA可作為一種肺癌和卵巢癌篩查新的生物標(biāo)志物。SIN S T K 等［35］在孕婦血漿中發(fā)現(xiàn)來(lái)源于母體和胎兒的eccDNA，并對(duì)2 種不同來(lái)源的eccDNA 進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)胎兒來(lái)源的eccDNA比母體來(lái)源的eccDNA短；由于eccDNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，與具有黏性末端的線性DNA相比，eccDNA更穩(wěn)定，且外周游離的eccDNA 與游離線性DNA 之間存在10 bp 大小周期間隔。通過(guò)對(duì)孕婦血漿樣本中鑒定的母體和胎兒eccDNA 甲基化分析發(fā)現(xiàn)，母體來(lái)源的eccDNA 較胎兒來(lái)源的eccDNA 甲基化密度高，且孕婦分娩后，胎兒來(lái)源的eccDNA 和線性DNA 在孕婦血漿檢測(cè)DNA 占比迅速降低，胎兒來(lái)源的eccDNA 和線性DNA 半衰期相似［36］，這兩個(gè)發(fā)現(xiàn)為產(chǎn)前無(wú)創(chuàng)檢測(cè)提供了一種新型的生物標(biāo)志物?；赟IN S T K 等［35］發(fā)現(xiàn)母體中存在胎兒來(lái)源的eccDNA 分子，YANG H 等［37］通過(guò)分析胎兒生長(zhǎng)受限（Fetal growth restriction，F(xiàn)GR）母體血漿中胎兒來(lái)源eccDNA分子特征發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GR較正常新生兒eccDNA數(shù)量增多，F(xiàn)GR 中eccDNA 所在宿主基因主要富集在免疫相關(guān)信號(hào)通路，為篩選新型的FGR 生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)提供了新的方向。

4 小結(jié)與展望

從1965 年發(fā)現(xiàn)eccDNA 至今，eccDNA 的研究取得了突破性的進(jìn)展。不僅基于癌癥細(xì)胞系和癌癥樣本對(duì)eccDNA 的潛在生物學(xué)功能進(jìn)行了研究，還對(duì)eccDNA 在液體活檢中的作用進(jìn)行了探索，并進(jìn)一步挖掘了eccDNA 作為一種新型的生物標(biāo)志物的可能性。目前研究已證實(shí)，eccDNA 與癌癥的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，不僅可促進(jìn)致癌基因表達(dá)，且位于eccDNA 上的致癌基因具有更高的轉(zhuǎn)錄活性，此外，在腫瘤藥物治療過(guò)程中，eccDNA 與腫瘤耐藥有關(guān)，這些研究進(jìn)一步揭示了腫瘤發(fā)生與發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制，并為腫瘤的研究與治療提供了新思路和新靶點(diǎn)。目前已知外周血eccDNA 分子特征，可作為肺癌和卵巢癌患者檢測(cè)與術(shù)后監(jiān)測(cè)、無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷、無(wú)創(chuàng)FGR 診斷的生物標(biāo)志物。然而，目前對(duì)于eccDNA 的了解并不充分，還有許多問(wèn)題有待進(jìn)一步研究：eccDNA 形成的確切機(jī)制有哪些？eccDNA是否能轉(zhuǎn)錄并翻譯出調(diào)控因子用于促進(jìn)癌基因的表達(dá)？eccDNA 分子能否作為信號(hào)分子介導(dǎo)細(xì)胞間信息傳遞？eccDNA 作為生物標(biāo)志物未知的臨床意義有哪些？

高通量基因測(cè)序技術(shù)是研究eccDNA 極為重要的方法，其發(fā)展為eccDNA 研究提供了良好的平臺(tái)，通過(guò)結(jié)合NGS 高精確度測(cè)序優(yōu)勢(shì)和TGS 長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序優(yōu)勢(shì)，可精確鑒定eccDNA 所攜帶的遺傳信息，為探索eccDNA 未知的生物學(xué)意義提供了有效技術(shù)手段。