羅漢松實多糖對小鼠肝癌H22細胞移植瘤生長的影響及其機制

李香穎，林樂珍，藍焱焱，黃增瓊

廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530021

肝癌是全球第4 大致死性惡性腫瘤，居全球癌癥病死率的第3位，惡性程度高，復(fù)發(fā)率高，易轉(zhuǎn)移，嚴重危害著人們的生命健康［1-4］。目前，索拉非尼、雷戈拉非尼和倫瓦替尼等小分子靶向抗腫瘤藥物是臨床治療肝癌的常用藥物，但這些藥物仍存在療效低、不良反應(yīng)大和易耐藥等缺點［5］。因此，尋找安全有效的抗肝癌藥物具有重要的意義。羅漢松實由種子和花托組成［6］，味甘，性微溫，具有行氣止痛，溫中補血之功效。羅漢松實多糖（PSP）是本研究小組從羅漢松果實中提取分離得到的一種植物多糖。多糖大多具有抗腫瘤、提高免疫力、抗氧化和降血糖等作用［7］。但目前有關(guān)PSP 藥理活性研究的報道極少。在抗腫瘤研究方面，也未見有相關(guān)的研究報道。鑒于廣西是肝癌高發(fā)區(qū)，而廣西北海擁有豐富的羅漢松實資源，可提取獲得大量PSP。2019 年8 月—2021 年6 月，本研究小組通過在昆明小鼠右腋皮下接種肝癌H22 細胞，建立移植瘤模型，灌胃給予PSP，觀察PSP 對移植瘤生長的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞株 SPF 級雄性昆明小鼠，體質(zhì)量（22±2）g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK 桂2020-0003，實驗使用許可證編號SYXK 桂2020-0004）；所有動物實驗均得到廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準，并嚴格按照批準的方案進行。H22 小鼠肝癌細胞（批號：CL-0341，武漢普諾賽生命科技有限公司）。

1.2 藥品、試劑及儀器 注射用環(huán)磷酰胺（批號：2019011345，江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司），香菇菌多糖片（批號：H42022727，湖北廣仁藥業(yè)有限公司）。胎牛血清（164210-100，武漢普諾賽生命科技有限公司），MTT、IL-2、IL-6、TNF-α、INF-γ 試劑盒［Andy gene（中國）生物科技有限公司］。KQ-5200DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），UW620H型電子天平（日本島津制作所），5810R 大型高速冷凍離心機（艾本德中國有限公司），MicroCL17R 小型冷凍離心機（賽默飛世爾科技公司），SpecraMax-Plus384型連續(xù)光譜掃描式酶標儀（香港分子儀器公司），3543 恒溫培養(yǎng)箱（美國賽默飛世爾科技公司），CKX-41倒置顯微鏡（日本奧林巴斯株式社會）。

1.3 PSP 制備 按文獻［8］的方法提取多糖并去除蛋白，以DEAE-52纖維素柱層析進行分離，蒸餾水洗脫，濃縮，冷凍干燥，得類白色粉末狀PSP。苯酚—硫酸法檢測樣品中多糖含量，按葡萄糖計，多糖含量為50.64%。取PSP適量，用蒸餾水配制成高、中、低三個藥物濃度（480、240、120 mg/kg），4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 小鼠H22 細胞移植瘤模型制備、分組、PSP 灌胃方法 取生長狀態(tài)良好的肝癌H22細胞，離心，棄去上清液，加入RPMI1640 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）重懸，用培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1.0×107/mL 細胞懸液。于無菌條件下，將該細胞懸液按0.2 mL/只的量接種于小鼠腹腔內(nèi)，腹水傳代3 次。11 d 后，在無菌條件下，將已接種肝癌H22細胞移植瘤，腹部明顯隆起的第三代腹水瘤小鼠頸椎脫臼處死，取腹腔內(nèi)乳白色瘤液，用生理鹽水稀釋，將腫瘤細胞濃度調(diào)整至1.0×107/mL，于小鼠右腋皮下接種0.2 mL/只，建立肝癌H22 細胞移植瘤小鼠模型，小鼠右腋接種部位摸到直徑約5 mm腫瘤硬塊，視為造模成功。造模成功后，將54只細胞移植瘤小鼠隨機分為6組，分別為 PSP 高、中、低劑量組（PSP-H 組、PSP-M 組、PSP-L 組）及環(huán)磷酰胺（CTX）組、香菇多糖（LNT）組、模型組（每組各9只），另取9只正常昆明小鼠作為對照組。PSP-H 組、PSP-M 組、PSP-L 組分別給予 480、240、120 mg/kg 的 PSP，CTX 組 給 予 20 mg/kg 的CTX，LNT 組給予100 mg/kg 的 LNT，對照組、模型組均給予10 mL/kg 的生理鹽水，各組均灌胃給藥，1次/天，連續(xù)給藥14 d。

1.5 腫瘤抑制率和臟器指數(shù)計算 各組小鼠末次給藥16 h 后，眼球取血，備用。頸椎脫臼處死動物，迅速剝離腫瘤、胸腺和脾臟，生理鹽水洗凈，吸干表面水分后稱重（腫瘤質(zhì)量），并計算腫瘤抑制率和臟器指數(shù)（胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)），腫瘤抑制率=（模型組平均瘤重-給藥組平均瘤重）/模型組平均瘤重×100%，臟器指數(shù)=臟器重量（mg）/小鼠體質(zhì)量（g）。

1.6 腫瘤組織病理學(xué)變化觀察 采用HE 染色法。取各組小鼠腫瘤組織，用4%的多聚甲醛固定，腫瘤組織固定48 h 后，常規(guī)石蠟包埋、切片，切片烘干后進行HE 染色，光學(xué)顯微鏡觀察腫瘤組織的病理學(xué)變化。

1.7 脾組織T、B 淋巴細胞增殖能力檢測 采用MTT 法［9-10］。無菌條件下取各組小鼠脾臟，加入PBS磨碎，離心，棄上清液，加入2 mL細胞裂解液和4 mL的PBS，混勻離心，得到脾細胞沉淀。用RPMI1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）將脾細胞濃度調(diào)整至1.0×107/mL。將該細胞懸浮液加入到96 孔板，100 μL/孔。其中，一板加入濃度為5 μg/mL的刀豆蛋白A（ConA）溶液，檢測T細胞增殖能力；另一板加入濃度為10 μg/mL 的細菌脂多糖（LPS）溶液，檢測B 淋巴細胞增殖能力。每組設(shè)置3 個復(fù)孔。培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3 d，每孔加入 20 μL 5 mg/mL 的 MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，最后加入MTT 溶解液終止反應(yīng)，于酶標儀570 nm處檢測光密度值（OD）。

1.8 眼球血清IL-2、IL-6、TNF-α、INF-γ檢測 采用ELISA 法。將各組小鼠眼球血在4 ℃環(huán)境下以3 000 r/min的速度離心10 min，取上清，按試劑盒說明書操作，檢測各組血清IL-2、IL-6、TNF-α、INF-γ。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩組間比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組腫瘤質(zhì)量、抑制率比較 PSP-L組、PSP-M組、PSP-H組、CTX組、LNT組、模型組、腫瘤質(zhì)量分別為（1.03 ± 0.17）、（0.94 ± 0.26）、（0.78 ± 0.72）、（0.67 ± 0.13）、（0.98 ± 0.33）、（1.67 ± 0.23）g，PSP-L組、PSP-M 組、PSP-H 組、CTX 組、LNT 組分別與模型組比較，PSP-M 組、PSP-H 組分別與 LNT 組比較，P均＜0.05；PSP-L組、PSP-M組、PSP-H組、CTX組、LNT組腫瘤抑制率分別為34.85%、40.95%、52.04%、59.44%、38.13%，PSP-H組與LNT組比較，P＜0.05。

2.2 各組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)比較 脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)比較見表1。

表1 各組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)比較（mg/g，）

表1 各組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)比較（mg/g，）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與LNT 組比較，▲P＜0.05；與CTX組比較，△P＜0.05。

胸腺指數(shù)2.43±0.26*#△2.42±0.23*#△2.51±0.14*#△1.36±0.33▲2.35±0.32*#△1.82±0.23*1.70±0.18組別PSP-L組PSP-M組PSP-H組CTX組LNT組模型組對照組n 9 9 9 9 9 9 9脾臟指數(shù)4.87±0.69#△5.09±0.43#△5.56±0.68*#△3.89±0.35*#5.25±0.78#△4.47±0.39*5.24±0.01

2.3 各組腫瘤組織病理學(xué)變化 腫瘤組織病理學(xué)變化見圖1，由圖1 可知，模型組腫瘤細胞生長狀態(tài)良好，清晰可見，數(shù)量多，排列緊密，細胞核深染，壞死細胞較少（圖2A）；CTX 組腫瘤細胞數(shù)量減少，排列松散，出現(xiàn)不同程度的壞死區(qū)域（圖2B，箭頭所示）；LNT 組和PSP 各組（圖2C～F），腫瘤組織疏松，腫瘤細胞減少，細胞不同程度壞死，其中PSP-H組細胞壞死更明顯（圖2F，箭頭所示）。

圖1 各組腫瘤組織病理學(xué)變化（HE，×400）

2.4 各組T、B 淋巴細胞增殖能力比較 T、B 淋巴細胞增殖能力比較見表2。

表2 各組T、B淋巴細胞增殖能力比較（OD值，）

表2 各組T、B淋巴細胞增殖能力比較（OD值，）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與CTX 組比較，△P＜0.05。

B淋巴細胞增殖能力0.58±0.12*△0.71±0.07*#△0.78±0.13*#△0.41±0.13#0.76±0.09*#△0.55±0.07*0.39±0.05組別PSP-L組PSP-M組PSP-H組CTX組LNT組模型組對照組n 9 9 9 9 9 9 9 T淋巴細胞增殖能力0.73±0.06*△0.73±0.08*△0.98±0.05*#△0.53±0.15#0.83±0.03*#△0.76±0.07*0.43±0.03

2.5 各組血清 IL-2、IL-6、TNF-α、INF-γ 水平比較 血清IL-2、IL-6、TNF-α、INF-γ水平比較見表3。

表3 各組血清IL-2、IL-6、TNF-α、INF-γ水平比較（ng/L，）

表3 各組血清IL-2、IL-6、TNF-α、INF-γ水平比較（ng/L，）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與LNT組比較，▲P＜0.05；與CTX組比較，△P＜0.05。

組別PSP-L組PSP-M組PSP-H組CTX組LNT組模型組空白組INF-γ 60.89±2.18#△81.87±1.58#△88.19±1.01#△46.63±1.69 78.65±2.58#45.35±1.42*56.59±0.37 n 9 9 9 9 9 9 9 IL-2 38.01±0.17#38.49±0.41#42.93 ± 0.24#△▲30.43±0.20#37.44±0.25#28.74±0.11*36.92±0.89 IL-6 36.48±0.72 33.23±0.67 30.83±0.60 33.81±0.53 33.75±0.53 33.28±0.60*27.48±0.89 TNF-α 149.92 ± 4.80#△159.75 ± 8.15#△182.41 ± 5.80#△128.03±12.70#155.12± 7.18#131.62±12.88*172.96± 3.46

3 討論

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，其病死率在惡性腫瘤中居第2 位。全世界每年約有25 萬人死于肝癌［11］。目前，肝癌的治療方法以外科手術(shù)、化療聯(lián)合放療、基因靶向治療為主。這些治療手段雖然有一定效果，但肝癌患者的生存期并沒有得到顯著的延長［12］?？梢?，肝癌的防治工作仍任重道遠。從中藥和天然藥物中尋找新的抗癌藥物是當前及未來研究的重點方向之一。肝癌H22細胞來源于小鼠肝細胞瘤，并經(jīng)皮下傳代得到［13］。肝癌H22 細胞小鼠皮下移植瘤模型，因其接種成功率高、穩(wěn)定、周期短、腫瘤位置和大小易于控制等優(yōu)點，成為抗腫瘤作用研究的常用模型［14-15］。因此，本實驗采用肝癌H22 細胞移植瘤模型，評價PSP的體內(nèi)抗肝癌作用。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，羅漢松提取物具有心臟保護、抑制胃癌細胞、降血脂、抗氧化及保肝作用［16-17］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，羅漢松實中含有多糖，并從中提取分離獲得PSP。目前，有關(guān)PSP 結(jié)構(gòu)及活性的研究報道極少。文獻［18-19］報道，植物多糖能通過促進淋巴細胞增殖、提高自然殺傷細胞（NK 細胞）殺傷活性，調(diào)節(jié)機體免疫功能等，而具有抗腫瘤作用。PSP 作為一種植物多糖，可能具有良好的抗腫瘤作用。本研究顯示，與模型組比較，PSP-L 組、PSP-M 組、PSP-H 組、CTX 組、LNT 組腫瘤質(zhì)量降低；與 LNT 組比較 PSP-M 組、PSP-H 組腫瘤質(zhì)量降低；與LNT 組比較，PSP-H 組腫瘤抑制率升高。表明PSP 對腫瘤生長的抑制作用與LNT 相似，并可能存在劑量依賴性。文獻［20］報道，當腫瘤抑制率大于30%，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義時，可認為此藥有一定療效。故可評定，PSP 能抑制肝癌H22 細胞移植瘤在小鼠體內(nèi)的生長。本文結(jié)果結(jié)果顯示，PSP各劑量組的腫瘤細胞不同程度壞死，其中PSP-H 組細胞壞死更明顯，表明PSP 可能有促進腫瘤細胞凋亡的作用。

脾臟是體內(nèi)最大的免疫器官，是T、B 淋巴細胞發(fā)揮免疫功能的重要場所。本研究顯示，與對照組比較，PSP-H 組脾臟指數(shù)及 PSP-L 組、PSP-M 組、PSP-H 組、LNT 組、模型組胸腺指數(shù)升高，CTX 組、模型組脾臟指數(shù)低降低；與模型組比較，PSP-L 組、PSP-M 組、PSP-H 組、LNT 組脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)升高，CTX 組脾臟指數(shù)降低；與 LNT 組比較，CTX 組胸腺指數(shù)降低；與 CTX 組比較，PSP-L 組、PSP-M 組、PSP-H 組、LNT 組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)升高，提示PSP 的抑瘤作用可能與其對免疫功能的作用有關(guān)，PSP-H 和LNT 均能顯著提高移植瘤小鼠免疫功能，增強機體抗腫瘤免疫反應(yīng)。

T、B 淋巴細胞增殖能力是評價藥物免疫功能的重要指標。為進一步了解PSP 對免疫功能的影響，測定了其對脾組織中T、B淋巴細胞的增殖能力。本研究顯示，與空白對照組比較，模型組、LNT 組和PSP 各劑量組T、B 淋巴細胞 OD 值均顯著升高，表明模型組、LNT 組和 PSP 各劑量組 T、B 淋巴細胞增殖能力均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與模型組相比，PSP-H 組 T、B 淋巴細胞 OD 值升高，表明 PSP-H 組能提高T、B 淋巴細胞增殖能力，但PSP-M 和PSP-L組T淋巴細胞OD值區(qū)別不大，表明對T細胞增殖能力無明顯影響。與CTX 組比較，LNT 組和PSP 各劑量組T、B 淋巴細胞 OD 值升高，表明 LNT 組和 PSP 各劑量組T、B 淋巴細胞增殖能力均升高。與LNT 組比較，PSP 各劑量組 T、B 淋巴細胞 OD 值差異不大，表明PSP 各劑量組對淋巴細胞增殖能力的影響。結(jié)果表明，除CTX組外，其余各給藥組脾組織中T、B淋巴細胞的增殖能力較空白對照組有所上升，且PSP-H和LNT對T、B淋巴細胞增殖的作用強于空白對照組和模型組，表明兩者均能顯著提高荷瘤小鼠免疫功能，增強機體抗腫瘤免疫反應(yīng)。

IL-2 在機體免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用，其可刺激T細胞、B細胞和NK細胞的增殖與分化，誘導(dǎo)T細胞分泌細胞因子，增強抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用，還可直接殺傷腫瘤細胞、介導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡，抑制腫瘤血管的形成。IL-6 是一種高能細胞因子，是腫瘤浸潤淋巴細胞中起免疫抑制作用的白細胞介素家族成員之一。IL-6可啟動腫瘤細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進NK 細胞活性，刺激T 細胞增殖分泌，從而殺死腫瘤細胞。TNF-α 是抑瘤作用最強的細胞因子，對正常細胞無明顯毒性，卻能直接殺傷腫瘤細胞和抗腫瘤細胞增殖。INF-γ 是固有免疫系統(tǒng)的γδT細胞與NK細胞在識別腫瘤細胞抗原后，活化并產(chǎn)生的細胞因子，能直接抑制腫瘤的生長；抑制腫瘤內(nèi)血管生成；上調(diào)TNF 受體的表達，增強TNF的抑瘤作用；抑制Th2細胞亞群的增殖［18］。因此，檢測血清細胞因子 IL-2、IL6、TNF-α 和 INF-γ 的水平，可以反映機體的免疫功能。本研究顯示，與對照組比較，模型組血清IL-6水平升高，IL-2、TNF-α、INF-γ水平降低；與模型組比較，PSP-L 組、PSP-M 組、PSPH 組、LNT 組血清 IL-2、TNF-α、INF-γ 水平和 CTX 組血清 IL-2 水平升高，CTX 組血清 TNF-α 水平降低；與 LNT 組比較，PSP-H 組血清 IL-2 水平升高；與 CTX組比較，PSP-L 組及 PSP-M 組 TNF-α、INF-γ 水平和PSP-H 組 IL-2、TNF-α、INF-γ 水平升高。表明 PSP和LNT 不是通過升高IL-6 的水平發(fā)揮作用，這與白花蛇舌草多糖抑制腎癌［21］及白術(shù)多糖抑制結(jié)腸癌腫瘤生長的作用相似［22］。我們推測，PSP 的抗腫瘤作用可能與促進 IL-2、TNF-α 及 INF-γ 的分泌，調(diào)節(jié)機體免疫功能，殺傷腫瘤細胞或促進腫瘤細胞凋亡有關(guān)。這將為進一步探索PSP在肝癌治療中的應(yīng)用提供科學(xué)基礎(chǔ)。

總之，PSP 對小鼠肝癌H22 細胞移植瘤生長有抑制作用，高劑量作用尤為明顯，其機制可能是提高機體T、B 淋巴細胞的增殖能力，升高血清IL-2、TNF-α、INF-γ水平，改善機體免疫功能。