熱休克蛋白在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中的研究進展*

王士萌，韓昕宇，亓丁，馮曉玲

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱150040 ；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion,RSA）是生育期婦女的常見疾病，是指與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生≥2 次孕齡＜20 周的自然流產(chǎn)，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，且風險會隨著流產(chǎn)次數(shù)的上升而增加[1]。RSA 臨床常見的致病因素常分為遺傳因素（染色體異常、孕婦高齡等）、內(nèi)分泌因素（甲狀腺激素異常、肥胖等）、子宮解剖因素（先天或后天子宮畸形）、男性因素（精子異常、精索靜脈曲張等）、感染因素（全身或女性生殖道感染）及免疫紊亂因素等，除此之外仍有40%～60%的患者尚未明確病因，被稱為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA）[2]。隨著研究的不斷深入，炎癥反應(yīng)[3]、氧化應(yīng)激、自噬誘導(dǎo)的細胞凋亡[4]、母胎界面免疫失衡[5]等因素也會導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局，造成URSA 的發(fā)生。近年來關(guān)于熱休克蛋白（heat shock proteins,HSPs）在女性生殖疾病母胎中的作用已得到廣泛認可[6]。本文就HSPs 在妊娠中的作用機制以及其與URSA 的研究進展進行綜述，以期為URSA 疾病提供新的治療靶點。

1 HSPs概述

HSPs 是一類高度保守的分子家族，是生物細胞在應(yīng)激狀態(tài)下啟動合成的蛋白質(zhì)，最早是TISSIèRES等[7]通過放射自顯影技術(shù)在果蠅熱休克反應(yīng)狀態(tài)下的唾液中分離出來?；谙到y(tǒng)基因符號可將HSPs 進一步分為以下家族，即HSPB（SmallHSP）、DNAJ（HSP40）、HSPD/E（HSP60/HSP10）和CCT（TRiC）、HSPA（HSP70）、HSPC（HSP90）和HSPH（HSP110）。目前大分子質(zhì)量HSP 以腺苷三磷酸依賴方式促進跨膜共翻譯，而小分子質(zhì)量HSP 不依賴腺苷三磷酸。

HSPs 常作為分子伴侶廣泛存在于原核生物和真核生物中，并參與其蛋白質(zhì)的折疊[8]。HSPs 在改善細胞對不利條件的抵抗力方面發(fā)揮著重要作用，例如，在生理應(yīng)激期間（如組織分化、生長和激素刺激）保持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)[9]；在病理應(yīng)激期間（如高溫、缺氧缺血、炎癥反應(yīng)等有害刺激），HSP 家族成員及其釋放出的熱休克轉(zhuǎn)錄因子表達調(diào)控，協(xié)同免疫，減少細胞的損傷及凋亡[10]。

2 HSPs 在妊娠生殖中的作用及與發(fā)生URSA的機制

HSPs 已被發(fā)現(xiàn)與蛻膜、著床和胎盤有關(guān)，其失調(diào)與著床失敗、妊娠丟失和其他母胎并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)。有學者在回顧性研究中論述了HSP家族不同成員在妊娠期間的作用：HSP27 促進蛻膜化及子癇前期發(fā)?。籋SP40 損害早產(chǎn)相關(guān)機制，促進子癇前期發(fā)病；HSP60 誘導(dǎo)類固醇激素，特別是孕酮的合成，促進胚泡發(fā)育；HSP70 保持蛻膜細胞完整性，在蛻膜樹突狀細胞中誘導(dǎo)“促炎癥成熟程序”，促進胚泡發(fā)育，保護胚胎免受高溫的致命影響；HSP90 促進類固醇受體的成熟和識別；HSC70 調(diào)節(jié)蛻膜化人胚胎干細胞的容受性，促進蛻膜化，誘導(dǎo)人胚胎干細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；GRP78 應(yīng)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促進激活合胞體；HSP105 支持胚胎植入[11]。

2.1 HSPs調(diào)節(jié)母胎界面免疫細胞功能

妊娠過程可以說是同種半異型體胎兒的移植過程，母胎界面良好的免疫耐受狀態(tài)可確保胎兒免受母體免疫系統(tǒng)對父系白細胞抗原攜帶抗原的攻擊。蛻膜自然殺傷細胞、T 淋巴細胞、巨噬細胞等共同構(gòu)成母胎界面免疫耐受的免疫細胞。HSPs參與自然殺傷細胞的激活，并介導(dǎo)其對應(yīng)激狀態(tài)的反應(yīng)，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。

2.1.1 HSPs 對自然殺傷細胞的調(diào)節(jié)作用自然殺傷細胞又稱NK 細胞，其分為外周血NK 細胞和蛻膜NK 細胞，蛻膜NK 細胞在妊娠早期迅速增加，促進胎盤發(fā)育過程中的血管生成和滋養(yǎng)層侵入，相反，外周血NK 細胞在正常妊娠受精卵植入后呈下降趨勢，而RSA 患者外周血NK 細胞CD56+/CD16+升高，細胞毒性增強，均可損傷妊娠組織，造成反復(fù)流產(chǎn)[12]。

HSP70 衍生肽可誘導(dǎo)純化NK 細胞的趨化性和細胞毒性，膜結(jié)合型HSP70 對NK 細胞具有免疫刺激作用，而細胞質(zhì)高水平HSP70 會干擾細胞凋亡通路從而介導(dǎo)治療抵抗[13]。NK 細胞上HSP70 的受體CD94，具有介導(dǎo)HSP70 刺激NK 細胞增殖和活性的能力[14]，在RSA 患者和體外受精失敗女性中的表達顯著增加[15]。此外，有研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留的GP96/GRP94（HSP96）能夠觸發(fā)NK 細胞反應(yīng)[16]，使外周血NK 細胞活性增強，并伴隨CD56+NK 細胞群擴大及γ 干擾素分泌增加。

2.1.2 HSPs 對T 淋巴細胞及巨噬細胞的調(diào)節(jié)作用T 淋巴細胞包括輔助性和調(diào)節(jié)性T 淋巴細胞，抗原呈遞細胞包括樹突狀細胞和巨噬細胞及其各自亞群，調(diào)節(jié)性T 淋巴細胞在妊娠期間數(shù)量和活性的下調(diào)會導(dǎo)致流產(chǎn)，對母-胎免疫耐受的建立至關(guān)重要。HSP60 通過激活Toll樣受體4（Toll-like receptor 4,TLR4）和TLR2 調(diào)節(jié)先天免疫系統(tǒng)，對調(diào)節(jié)性T 淋巴細胞表現(xiàn)出抗炎功能，促進巨噬細胞M2 表型功能及腫瘤壞死因子α、白細胞介素6（Interleukin-6,IL-6）、IL-12、IL-15 等炎癥因子分泌，在孕婦血清中含量增加，與增強胎兒耐受性的免疫抑制有關(guān)[17]。HSP70、HSP90 亦可誘導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)生促炎因子調(diào)節(jié)免疫平衡。

2.2 HSPs調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜蛻膜化

子宮內(nèi)膜間質(zhì)室中細長的成纖維間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變?yōu)樘厥獾膱A形上皮蛻膜細胞稱為蛻膜化。妊娠母體子宮內(nèi)膜廣泛重塑，胚胎干細胞通過卵巢類固醇激素作用，發(fā)生形態(tài)學、生化和代謝改變，對胚胎識別和黏附、滋養(yǎng)層侵襲、胎盤形成至關(guān)重要，保護發(fā)育中的胚胎免受母體免疫監(jiān)測，并為其提供營養(yǎng)援助，蛻膜化異?？蓪?dǎo)致子宮內(nèi)膜和妊娠并發(fā)癥，致使流產(chǎn)發(fā)生。HSPs 在蛻膜化過程中以改變子宮內(nèi)膜容受性和誘導(dǎo)結(jié)合蛻膜細胞的相關(guān)受體為主。

HSPA8（即HSC70/HSC71/HSP71/HSP73）在正常蛻膜化人胚胎干細胞中高表達，而與發(fā)育受損的胚胎相互作用期間，微陣列分析發(fā)現(xiàn)HSPA8基因下調(diào)最為顯著，致使蛻膜化時子宮內(nèi)膜容受性降低[18]。HSP70 誘導(dǎo)結(jié)合蛻膜CD1a+樹突狀細胞上的CD91 和TLR4 受體，參與促炎性成熟程序，誘導(dǎo)蛻膜細胞成熟，并同時合成IL-15[19]。

李慧芳等[20]研究發(fā)現(xiàn)RSA 小鼠蛻膜中HSP27 表達相比于正常小鼠明顯升高，使用中藥壽胎丸調(diào)控其表達可降低胚胎丟失率。GULIC等[21]發(fā)現(xiàn)稽留流產(chǎn)和胚胎停育患者蛻膜組織切片中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白GP96 侵入滋養(yǎng)層細胞，免疫熒光染色結(jié)果顯示GP96 蛋白表達強于正常早孕女性，與受體CD91 和TLR4 結(jié)合后可能誘導(dǎo)有害免疫反應(yīng)。母胎界面釋放GP96 后，滋養(yǎng)層和蛻膜細胞中CD91 和TLR4 的表達在分娩起始和病理性早孕終止的生理機制中發(fā)揮重要作用，抗原呈遞CD1a+未成熟樹突狀細胞、CD83+成熟樹突狀細胞、CD14+巨噬細胞及早孕蛻膜中CD3+CD56-T 和CD3-CD56+NK 細胞可能是GP96 的相關(guān)作用靶點。

2.3 HSPs參與自噬、細胞凋亡

HSPs 在子宮內(nèi)膜、蛻膜、輸卵管、胎盤等生殖組織中均有表達[22]。在妊娠過程中HSP70 廣泛存在于滋養(yǎng)層細胞、內(nèi)皮細胞的細胞核和細胞質(zhì)中，抑制妊娠母體過度自噬，其濃度與預(yù)防細胞衰老和凋亡密切相關(guān)。

自噬是一種高度保守的進化過程，可清除受損的細胞器和外來病原體以維持細胞穩(wěn)態(tài)，自噬失調(diào)是導(dǎo)致自然流產(chǎn)的機制之一。有研究通過酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測212例孕婦外周血單核細胞中p62 的濃度以反映自噬程度，結(jié)果顯示p62 濃度與自噬程度呈負相關(guān)，且隨著先前活產(chǎn)、早產(chǎn)或足月分娩次數(shù)的增加而增加，細胞內(nèi)HSP70 濃度與p62 水平存在強相關(guān)性，提示HSP70 可作為自噬抑制劑調(diào)節(jié)妊娠期間外周血單核細胞的自噬程度[23]。此外，經(jīng)產(chǎn)婦外周血單核細胞中HSP70 的水平高于未產(chǎn)婦，說明與首次暴露于胎兒抗原的未產(chǎn)婦相比，經(jīng)產(chǎn)婦妊娠相關(guān)免疫和生理反應(yīng)的重新激活可能會引發(fā)更強烈的應(yīng)激反應(yīng)，通過誘導(dǎo)外周血單核細胞產(chǎn)生HSP70 以限制妊娠期間的自噬能力，具有下調(diào)促炎免疫和維持胎兒健康的重要作用。

正常妊娠依賴于胎盤和蛻膜組織細胞增殖、凋亡之間的動態(tài)平衡，由多種原因引起的細胞凋亡異?？赡軙?dǎo)致妊娠失敗或病理妊娠[24]。1 項關(guān)于HSP70 異常表達與自然流產(chǎn)關(guān)系的臨床研究中，分別收集50例自然流產(chǎn)和人工流產(chǎn)患者的蛻膜組織，觀察到自然流產(chǎn)組的細胞凋亡率、HSP70 蛋白及mRNA 表達量均顯著高于人工流產(chǎn)組[25]。HSP70的過度表達可引發(fā)蛻膜組織缺血、胚胎生長受限和免疫細胞過度刺激，其介導(dǎo)凋亡的機制是經(jīng)線粒體信號通路形成凋亡小體或激活JNK 信號通路[26]。HSP70 還可保護細胞免受活性氧誘導(dǎo)的DNA鏈斷裂和脂質(zhì)過氧化的影響，抑制凋亡介導(dǎo)的細胞死亡過程，保護細胞免受腫瘤壞死因子α 介導(dǎo)的炎癥效應(yīng)和細胞毒性作用。

2.4 HSPs調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

任何引起蛋白分泌負荷增加的因素及病理狀態(tài)下突變蛋白的存在，均可使細胞質(zhì)中蓄積錯誤折疊或未折疊蛋白，此狀態(tài)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。妊娠女性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)會誘發(fā)胎盤滋養(yǎng)細胞生物學行為異常，影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)維持胎盤轉(zhuǎn)運代謝的功能。

GALGANI等[27]在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與子宮內(nèi)膜容受性缺陷的研究中發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜中葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 水平升高是URSA 胚胎植入缺陷的原因之一，其隸屬HSP70 家族，是未折疊蛋白反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)者，與α2-巨球蛋白相互作用調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細胞融合[28]，促進胎盤形成的合胞化過程，在應(yīng)激和缺氧條件下，與p53 蛋白共表達于滋養(yǎng)層細胞表面，并作為分子伴侶參與p53 的失活和穩(wěn)定，從而調(diào)控下游靶基因，引起細胞周期停滯及凋亡。

HSP47 是定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的膠原蛋白特異性分子伴侶，由SERPINH1基因編碼，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族，通過與免疫球蛋白結(jié)合蛋白的競爭或結(jié)合，促進肌醇酶1α 的激活以減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生[29]。HSP47 生成障礙會導(dǎo)致膠原蛋白合成異?；蝈e誤折疊，使基底膜發(fā)生不連續(xù)斷裂，此外，HSP47 基因敲除可導(dǎo)致細胞凋亡標志物CHOP 的表達上調(diào)[30]，均可致胚胎死亡。

2.5 HSPs參與生殖細胞發(fā)育及精子調(diào)節(jié)

精液參數(shù)水平影響胚胎早期分化發(fā)育。有前瞻性研究通過蛋白印跡法比對16例反復(fù)妊娠丟失男性和20例正常男性的精液樣本差異表達蛋白，結(jié)果顯示反復(fù)妊娠丟失男性精子中睪丸富集熱休克蛋白（HSPA2）呈低表達[31]。這歸因于精子內(nèi)非正常組蛋白修飾導(dǎo)致氧化應(yīng)激[32]，使HSPA2 蛋白化學烷基化，與重組蛋白SPAM1 和ARSA 協(xié)同作用，使精子透明帶結(jié)合或穿透異常，造成受精后胚胎發(fā)育障礙。HSPA2 在精索靜脈曲張或弱精癥患者精子中表達不足，提示與射精濃度存在強相關(guān)性，可影響精子在女性生殖道上升過程中的功能轉(zhuǎn)化，造成特發(fā)性精子-卵母細胞識別障礙[33]。HSPA2 通過聚集絲裂原活化激酶級聯(lián)的特定成分，選擇性介導(dǎo)JNK 信號通路，使支架蛋白JIP4 在反復(fù)妊娠丟失男性精子中過表達[31]，提示熱休克蛋白突變的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能是早期胚胎發(fā)育質(zhì)量的影響因素。

此外，精子DNA 的完整性決定受精后胚胎形成、著床及子代健康，精子DNA 損傷機制主要為凋亡、氧化應(yīng)激及核染色質(zhì)“濃縮”異常。睪丸過熱或病理及應(yīng)激狀態(tài)下睪丸中活性氧濃度升高也會破壞精子細胞核的完整性。HSP90 參與調(diào)控生精細胞減數(shù)分裂，對阻礙生殖功能的內(nèi)、外源性生物活性物質(zhì)具有清除能力，可避免因DNA 損傷而引起精子細胞周期阻滯。HSP90 家族成員TRAP1可影響活性氧的產(chǎn)生部位或加快其分解，抑制濃度過量引發(fā)的精子細胞死亡[34]。HSP90 還可激活一氧化氮合酶，產(chǎn)生在細胞信號肽中充當抗氧化劑或自由基作用的一氧化氮以保護精子[35]。

2.6 HSPs與雌孕激素水平相關(guān)

體外受精和胚胎移植時期高濃度血清雌二醇可損傷子宮內(nèi)膜容受性，干擾內(nèi)膜成熟并降低胚胎植入率，可能是由于超生理水平的雌二醇下調(diào)子宮內(nèi)膜上皮細胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 的激活狀態(tài)所致。CHEN等[36]實驗證明HSP70 是子宮內(nèi)膜上皮細胞高雌二醇信號通路中NF-κB 的上游調(diào)節(jié)蛋白。分離子宮內(nèi)膜上皮細胞并培養(yǎng)于高濃度雌二醇中，發(fā)現(xiàn)高濃度雌二醇可結(jié)合雌激素受體，增強熱休克因子HSF-1 活性，增加HSP70 表達。誘導(dǎo)型HSP70 與IκB 激酶γ 形成復(fù)合物并降低激酶活性，抑制子宮內(nèi)膜上皮細胞中IκB 激酶α 磷酸化，抑制核內(nèi)轉(zhuǎn)化生長因子β1介導(dǎo)NF-κB 活化，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜上皮細胞凋亡。

孕酮是一種類固醇激素，由膽固醇從細胞質(zhì)運輸?shù)骄€粒體內(nèi)膜合成，胎盤中孕酮的合成可為胚胎植入子宮內(nèi)膜做準備，并維持妊娠至足月，早孕母體血清中孕酮值過低是先兆流產(chǎn)的征兆。人胎盤絨毛膜癌細胞系可高表達特定的類固醇生成酶，目前被廣泛用于胎盤類固醇生成。JESSICA等[37]發(fā)現(xiàn)HSP60 定位于人胎盤線粒體接觸位點，與STARD3 和P450scc 蛋白相互作用，以劑量依賴性方式結(jié)合膽固醇，在人胎盤絨毛膜癌細胞中過表達，刺激孕酮合成，此結(jié)果在非類固醇生成的人胚胎腎293 細胞系中被證實。

2.7 HSPs參與同型半胱氨酸代謝

妊娠女性葉酸缺乏或葉酸代謝基因異常可引起同型半胱氨酸堆積，高同型半胱氨酸血癥對胚胎有毒性作用，可破壞機體凝血功能及纖溶系統(tǒng)，損傷血管內(nèi)皮形成微血栓，抑制絨毛膜形成，引起胚胎著床不良而致流產(chǎn)[38]。HSP27 在同型半胱氨酸代謝途徑中發(fā)揮保護機體的正向作用。血清HSP27 水平與動脈粥樣硬化程度呈負相關(guān)，田欣[39]研究發(fā)現(xiàn)HSP27 可減弱同型半胱氨酸對內(nèi)皮細胞表達一氧化氮的影響，抑制黏附分子和趨化因子mRNA 表達，減弱同型半胱氨酸誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷。此外，高水平HSP27 可促進線粒體凋亡相關(guān)蛋白B 淋巴細胞瘤-2 表達，抑制Bax、下游Caspase-3活化和PARP 裂解，抑制同型半胱氨酸引起的內(nèi)皮細胞凋亡，起到細胞保護作用。

3 HSPs與妊娠相關(guān)疾病

HSPs 是哺乳動物受精后最先產(chǎn)生的蛋白質(zhì)之一，可促進胚胎線粒體中的孕酮合成或與胚胎存活相關(guān)的植入前因子結(jié)合[40]，在妊娠早期胚胎和母體蛻膜中持續(xù)表達以維持細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的完整性。HSP70 隨著妊娠進展而逐漸增加，參與并調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答過程，觸發(fā)胎兒免疫耐受，這在一定程度上對胎兒有利。但當HSP70 增加達到閾值后，會大量沉積于胎盤絨毛膜中，使自噬失調(diào)而致流產(chǎn)[41]。MATSUDA等[42]探究RSA 非妊娠女性血管功能障礙的嚴重程度與抗HSPs 抗體的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)抗磷脂抗體陽性的RSA 患者或抗磷脂綜合征患者的抗HSP60、HSP70 抗體水平均顯著升高，但與血管僵硬指數(shù)（臂踝脈搏波速度、頸動脈增強指數(shù)）無相關(guān)性，還需進一步探究抗HSPs 抗體在RSA 血管功能中的病理、生理機制。

MAKRI等[43]研究發(fā)現(xiàn)妊娠12 周前，HSP60/HSP70 的比值≥6，流產(chǎn)風險增加，且HSP60 和HSP70 的比例失衡是由于母體或胚胎組織自身釋放失調(diào)所致，與后期其他因素所致的生物合成無關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)未足月胎膜早破患者的胎盤中央?yún)^(qū)HSP60 和HSP70 的基因表達水平明顯高于正常妊娠女性，而胎膜完整早產(chǎn)患者和正常妊娠女性之間未發(fā)現(xiàn)類似差異[44]，提示妊娠晚期HSP60 與HSP70的增高可能會可誘發(fā)胎膜破裂導(dǎo)致早產(chǎn)。

4 總結(jié)

綜上所述，HSPs 可調(diào)節(jié)母胎界面免疫、細胞自噬與凋亡、子宮內(nèi)膜蛻膜化等多種維持成功妊娠的相關(guān)因素，在滋養(yǎng)細胞侵襲、胎盤形成及胚胎植入等生理妊娠過程中發(fā)揮重要作用。HSPs 可作為一種反映胚胎生育能力、預(yù)測妊娠結(jié)局的生物學指標，具有成為治療反復(fù)妊娠失敗新靶點的潛在作用。目前關(guān)于HSPs 與URSA 的直接研究較少，需要進一步探索以明確和證實其參與病理妊娠的分子機制，同時為其他妊娠相關(guān)疾病的機制研究和預(yù)防治療提供新思路。