骨質(zhì)疏松癥中BMSCs-EVs通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)成骨分化的研究進(jìn)展

吳思友，何斌，祝紫蘭，梁寧唐小勇

1遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院（遵義市第一人民醫(yī)院）骨科，貴州 遵義 563000；2遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院整形燒傷科；3遵義市紅花崗區(qū)人民醫(yī)院骨科

骨質(zhì)疏松癥（OP）是由多種原因致使骨密度和骨量降低，骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加，從而導(dǎo)致骨折的全身退行性骨病［1］。OP發(fā)病的主要機(jī)制是成骨細(xì)胞的骨形成和破骨細(xì)胞骨吸收之間的不平衡；另外，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的數(shù)量減少和功能衰退亦是導(dǎo)致OP形成機(jī)制之一［2］。目前，治療OP藥物主要分為抗吸收、成骨和同時(shí)具備雙重藥理作用的藥物，但因藥物不良反應(yīng)而治療效果欠佳［3］。BMSCs是一種具有自我更新、多向分化潛能的細(xì)胞，其多能性成為干細(xì)胞治療的基礎(chǔ)；在特定條件下具有向成骨細(xì)胞分化的能力，并進(jìn)一步有益于誘導(dǎo)骨形成［4］。研究表明，BMSCs具有治療與年齡進(jìn)展相關(guān)退行性疾病的潛力，BMSCs的衰老過(guò)程在OP發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［5］。細(xì)胞外囊泡（EVs）是細(xì)胞分泌組成的一部分，通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞間信使通信傳遞和細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)發(fā)揮功能作用。來(lái)源于BMSCs的EVs（BMSCs-EVs）生物學(xué)特征、功能與BMSCs類似，其中包括組織修復(fù)、誘導(dǎo)成骨、促進(jìn)血管新生和骨礦化聚集作用［6］。因此，BMSCs衍生的EVs在治療OP中發(fā)揮重要作用。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）是骨形成關(guān)鍵信號(hào)調(diào)控通路之一，激活PI3K/Akt具有抵抗骨吸收、促進(jìn)成骨的作用，其在破骨細(xì)胞的分化中起重要作用［7］。研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路在骨再生、骨重建、骨代謝調(diào)節(jié)中起重要作用［8］。PI3K/Akt信號(hào)通路不僅在調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中發(fā)揮作用，而且還是間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖分化和生存周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)信號(hào)。從蛋白質(zhì)表達(dá)組學(xué)分析方面來(lái)說(shuō)，源自于細(xì)胞不同類型EV中可呈現(xiàn)出不同的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，它們通過(guò)調(diào)節(jié)信號(hào)通路的效應(yīng)機(jī)制，從而誘導(dǎo)骨形成能力、激活PI3K/Akt信號(hào)通路［9］。另有研究表明，源自BMSCs的EVs可能通過(guò)IL-1β下調(diào)來(lái)激活PI3K/Akt信號(hào)通路，從而影響成骨細(xì)胞分化。由此，BMSCs釋放的EVs可能被認(rèn)為是在骨再生醫(yī)學(xué)中充當(dāng)干細(xì)胞療法。從微小核糖核酸（microRNA）分析，富含microRNA的BMSCs-EVs被HUVECs內(nèi)吞，從而抑制PTEN表達(dá)并激活PI3K/Akt通路，促進(jìn)HUVEC增殖分化、遷移歸巢和血管新生，最終誘導(dǎo)新骨生成，促進(jìn)骨再生，因而來(lái)自BMSCs衍生EVs的microRNA通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路在骨再生、血管生成中發(fā)揮重要功能［11］?，F(xiàn)就OP中EVs通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)成骨分化的研究進(jìn)展綜述如下。

1 BMSCs-EVs的結(jié)構(gòu)特性及功能

1.1 BMSCs-EVs的特征EVs是幾乎所有活細(xì)胞分泌的納米級(jí)膜囊泡，質(zhì)膜通過(guò)出芽或細(xì)胞內(nèi)吞作用運(yùn)輸途徑形成，EVs通常分為多個(gè)類別，最常見(jiàn)的分類據(jù)直徑大小分為三類：外泌體（40～100 nm）、微泡（MV；100～1 000 nm）和凋亡小體（50～5 000 nm）［12］，EVs富含大量蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸（mRNA、ncRNA和DNA）等生物活性分子，能快速將細(xì)胞間信使傳遞到鄰近細(xì)胞或?qū)⑵鋽y帶轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處的靶細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的各種生理和病理過(guò)程。EVs通過(guò)在細(xì)胞之間相互轉(zhuǎn)移生物活性內(nèi)容物，通過(guò)細(xì)胞間通信信息表達(dá)聯(lián)合EVs的骨代謝和骨再生作用，在OP發(fā)病機(jī)制數(shù)量和功能代謝中發(fā)揮重要作用［13］，EVs一旦與成骨細(xì)胞膜上表達(dá)的RANKL相結(jié)合，激發(fā)骨形成相關(guān)信號(hào)通路，誘導(dǎo)成骨樣細(xì)胞和骨鈣結(jié)節(jié)沉積能在間充質(zhì)干細(xì)胞上刺激成骨分化。

研究表明，BMSCs-EVs中含有許多蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、信使RNA和microRNA等生物活性分子，在不同的生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。還可穩(wěn)定表達(dá)識(shí)別EVs蛋白的特異性表面標(biāo)志物，即CD9、CD63、CD81，BMSCs-EVs具有獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)［14］，如快速傳遞性、無(wú)免疫原性、內(nèi)在歸巢效應(yīng)、無(wú)致癌性、無(wú)倫理爭(zhēng)議、易獲取和儲(chǔ)藏等，其在多種骨骼肌肉系統(tǒng)疾病中具有巨大治療潛力。BMSCs-EVs具有誘導(dǎo)成骨、促進(jìn)骨再生、血管生成和骨礦化作用，BMSCs-EVs的無(wú)細(xì)胞療法是一種有前景的骨再生方式。然而，BMSCs-EVs的骨代謝研究仍處于早期階段。據(jù)報(bào)道，MSC-EVs可通過(guò)增強(qiáng)成骨細(xì)胞的活性和促進(jìn)血管生成來(lái)誘導(dǎo)新骨形成，尤其是在OP治療方面的潛力，從RNA或蛋白質(zhì)角度分析，有未經(jīng)修飾的RNA及蛋白表達(dá)的MSC-EVs僅顯現(xiàn)出中等治療效果，修飾的RNA及蛋白表達(dá)的MSC-EVs顯現(xiàn)出較好治療效果，由此可見(jiàn)，富含RNA或蛋白質(zhì)的基因治療技術(shù)工程MSCs可能會(huì)增強(qiáng)MSC-EVs的成骨能力來(lái)誘導(dǎo)新骨形成［15］。因此，應(yīng)用含有RNA或蛋白質(zhì)的BMSCs-EVs具有明顯促進(jìn)成骨的特性。

1.2 BMSCs-EVs的功能MSCs能分泌多種EVs以保持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)維持正常的功能，MSC-EVs攜帶大量核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，以及豐富的miRNA，可將這些生物活性分子快速輸送到受體細(xì)胞中，從而使MSC-EVs在無(wú)細(xì)胞治療中得到合理應(yīng)用［16］。從BMSCs-EVs的miRNA方面分析，蘊(yùn)含BMSCs-EVs的多種miRNA（如miR-27a）可能通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路傳導(dǎo)修飾BMSCs-EVs中的特定miRNA來(lái)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化，有效激活Wnt/β-catenin以促進(jìn)骨形成［17］。由于BMSC-EVs富含多種miRNAs，不同miRNAs之間可能存在復(fù)雜的相互調(diào)節(jié)影響。據(jù)報(bào)道，MSC-EVs可通過(guò)增加骨形成、減少骨髓脂肪堆積和骨吸收來(lái)防止OP的骨丟失并維持骨強(qiáng)度，同時(shí)BMSCs-EVs含有更多的促分化和趨化蛋白，它們能促進(jìn)骨和軟骨組織的生長(zhǎng)，為靶向治療應(yīng)用選擇合適的EVs種屬和供體的重要性，從蛋白質(zhì)含量和功能作用方面呈現(xiàn)出不同的特征［18］。OP病理機(jī)制改變細(xì)胞的EVs不同地影響B(tài)MSC衰老代謝和骨形成方面的成骨標(biāo)志物表達(dá)。因此，不應(yīng)忽略組織或細(xì)胞微環(huán)境，因?yàn)樗鼈兛赡軙?huì)抵抗EVs治療的預(yù)期效果。此外，我們認(rèn)為細(xì)胞的種屬和供體的年齡是重要因素，應(yīng)用MSC衍生的EVs可能有利于治療年齡相關(guān)的骨代謝性疾病［19］。近年來(lái)，BMSCs-EVs已被作為納米載體用于慢性骨病研究中，BMSCs-EVs的蛋白表達(dá)譜分析顯示，適當(dāng)修飾BMSCs中的功能蛋白，使其富含內(nèi)源性活性分子的BMSCs-EVs蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)成骨或抑制破骨細(xì)胞生成［20］。盡管BMSCs-EVs在治療骨代謝疾病中具有巨大潛力，但仍有不足之處，如BMSCs-EVs的純化、質(zhì)量、鑒定、運(yùn)輸、半衰期和長(zhǎng)期安全性等。

1.3 BMSCs-EVs的作用

1.3.1 促進(jìn)成骨分化、骨重建、骨礦化BMSCs和破骨細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞分泌的EVs以及向成骨細(xì)胞運(yùn)輸microRNAs可調(diào)節(jié)骨形成，BMSCs衍生的EVs可以修復(fù)、改善BMSCs功能，其中外泌體和微泡是最常用的EVs類別，它們通過(guò)將包括核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)在內(nèi)的生物活性分子轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中，進(jìn)一步調(diào)節(jié)其細(xì)胞旁分泌作用，由于MSCs對(duì)骨再生的促進(jìn)作用，MSCs的EVs亦具有促進(jìn)骨形成的作用［21］。另BMSCs-EVs已被證明可攜帶成骨相關(guān)的基因，從而調(diào)節(jié)BMSCs的成骨分化和礦化功能，BMSC-EV-miRNAs（miR-29b-3p、miR-20a）通過(guò)靶向調(diào)節(jié)促進(jìn)BMSCs的成骨分化，BMSCs-EVs可能通過(guò)多個(gè)關(guān)鍵的miRNA調(diào)節(jié)BMP/Smad信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)影響成骨分化。從蛋白組學(xué)方面分析，BMSCs-EVs可上調(diào)影響Wnt1和β-catenin的蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)BMSCs的成骨分化［6］。

1.3.2 促進(jìn)新生血管生成EVs在體外和體內(nèi)均具有增強(qiáng)促血管生成的作用，進(jìn)而誘導(dǎo)成骨，針對(duì)EVs的促血管生成作用的機(jī)制以及調(diào)節(jié)EV在供體細(xì)胞中的機(jī)制及其不清，然而MSCs分泌的EVs在體外對(duì)HUVECs具有強(qiáng)烈的促血管生成作用［22］，BMSCs衍生的EVs通過(guò)加速促進(jìn)血管生成作用，從而促進(jìn)骨再生。

2 BMSCs-EVs通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)骨形成的機(jī)制

PI3K/Akt信號(hào)通路傳導(dǎo)關(guān)鍵核心是絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt，是運(yùn)輸細(xì)胞表面受體生長(zhǎng)和存活信號(hào)的通道，PI3Ks是PI3K/Akt信號(hào)通路上游的關(guān)鍵元件。Akt活化中的膜易位由PH結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)，催化結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)包括一個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)蘇氨酸殘基Thr308位點(diǎn)，這是Akt活化所必需的磷酸化位點(diǎn)。C端調(diào)控區(qū)域由40個(gè)氨基酸組成，包含一個(gè)疏水區(qū)，其中包含激活A(yù)kt的第二個(gè)磷酸化位點(diǎn)，即絲氨酸殘基Ser473。主要參與細(xì)胞增殖、存活、血管生成和腫瘤細(xì)胞侵襲的作用［23］。因此，PKB/Akt信號(hào)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、代謝和存活的核心信號(hào)通路之一，PI3K/Akt信號(hào)通路通過(guò)激活參與細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換和細(xì)胞增殖的下游效應(yīng)器在許多生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在細(xì)胞受到不同外界刺激，如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和激素可以誘導(dǎo)PI3K的活性［24］，另外，G蛋白偶聯(lián)受體也可激活PI3K。PI3K及其下游靶標(biāo)蛋白激酶B或Akt在細(xì)胞存活、增殖、分化、遷移和代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2.1 PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控骨形成許多骨骼肌肉系統(tǒng)中調(diào)節(jié)骨再生、骨重建、骨代謝過(guò)程的關(guān)鍵信號(hào)通路之一是PI3K/Akt通路，該通路被證明與成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化有關(guān)。其中PI3K是一種異二聚酶，是骨吸收和骨形成的關(guān)鍵因素；一旦PI3K被磷酸化，就會(huì)激活A(yù)kt，PI3K/Akt亦參與成骨細(xì)胞生長(zhǎng)分化功能和骨骼發(fā)育，如Akt1的全身丟失會(huì)導(dǎo)致骨量減少，這可能與加速細(xì)胞凋亡和成骨細(xì)胞分化功能減退有關(guān)［25］，PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)涉及多種細(xì)胞類型的生長(zhǎng)、增殖、分化過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號(hào)通路在成骨細(xì)胞分化和骨組織代謝中起重要作用，當(dāng)激活PI3K/Akt信號(hào)通路可引起骨組織相關(guān)信號(hào)分子的一系列變化，如促進(jìn)成骨分化標(biāo)志物堿性磷酸酶（ALP）的表達(dá)［26］。

2.2 PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控BMSC分泌的EVs促進(jìn)成骨分化PI3K/Akt作為骨骼肌肉系統(tǒng)疾病重要的骨代謝調(diào)節(jié)劑，能從根本上誘導(dǎo)骨形成。miRNA在MSC衍生的EV中對(duì)B淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)特性的功能，運(yùn)用這些特異性miRNA可以調(diào)節(jié)激活PI3K-Akt信號(hào)通路，其也是MSC衍生的EV攜帶miRNA治療后常見(jiàn)受損的信號(hào)通路之一［27］。從BMSCs-EVs的RNA測(cè)序?qū)用嫔戏治?，可?jiàn)相關(guān)成骨基因表達(dá)上調(diào)，這可能與激活PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)，與microRNA分析結(jié)果達(dá)成一致。上述研究表明，miR-21、miR-29、miR-221和let-7a在MSC-EVs與BMP和PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)，RNA生物信息測(cè)序證明了PI3K/Akt信號(hào)通路可能是骨重塑調(diào)控分子靶點(diǎn)，僅限于發(fā)生在骨骼和肌肉系統(tǒng)疾病中［28］。由此可知，PI3K/Akt信號(hào)通路與BMSCs-EVs的相關(guān)性，在OP治療中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，BMSCs-EVs通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)成骨分化，BMSCs-EVs目前仍處于早期研究階段，尤其在骨科方向研究相對(duì)較少，其在骨代謝疾病OP的作用與機(jī)制的研究仍較少，且與PI3K/Akt信號(hào)通路通過(guò)促進(jìn)成骨影響發(fā)病機(jī)制的研究較少。BMSCs-EVs的治療研究?jī)H局限于基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)上，雖已證明其能促進(jìn)骨再生，但如何將其有效地應(yīng)用于臨床中OP患者的治療仍面臨許多困擾，需進(jìn)一步開(kāi)展更多臨床試驗(yàn)。研究雖證實(shí)在促進(jìn)成骨分化過(guò)程中，BMSCs-EVs與PI3K/Akt信號(hào)通路間存在相互聯(lián)系，但目前具體機(jī)制仍不明確。