局灶缺血性腦卒中動物模型的研究進展

范琢玉，李雨軒，沈光海*，朱鶴云

(1.延邊大學(xué)藥學(xué)院，吉林 延吉 133002；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

腦卒中又稱為腦中風(fēng)或腦血管意外，臨床主要表現(xiàn)為猝然昏倒、不省人事或口眼歪斜、半身不遂等癥狀。根據(jù)發(fā)病機制不同，臨床上可將其分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中。其中缺血性腦卒中的發(fā)病率約占腦卒中總比例的80%，主要原因是大腦中動脈或其分支的血管發(fā)生栓塞性閉塞[1]。腦血管發(fā)生閉塞后，會導(dǎo)致腦組織中氧氣和能量供應(yīng)不足，形成氧自由基，進一步誘導(dǎo)谷氨酸的釋放、細胞內(nèi)鈣的累積以及一系列炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而使腦組織產(chǎn)生不可逆的損傷[2]。此外高血壓、心臟病、糖尿病和一些日常的不良習(xí)慣都有可能引發(fā)腦卒中。

目前針對腦卒中發(fā)病情況的研究難點主要包括以下幾個方面：①人類缺血性腦卒中的表現(xiàn)、原因和發(fā)生病變的結(jié)構(gòu)部位極其多樣；②在發(fā)生缺血性腦卒中時，人體病理生理學(xué)形態(tài)會迅速發(fā)生改變，這一過程通常無法通過人類中風(fēng)的成像技術(shù)檢測；③在腦卒中的病理生理學(xué)研究中，血液灌注和血液循環(huán)系統(tǒng)(如側(cè)支循環(huán))也至關(guān)重要，但無法在體外模型中建模。因此，建立良好的動物或細胞模型對于腦卒中的研究和治療中十分重要[3]。

1 實驗對象的選擇

腦卒中實驗多選用小型動物(如小鼠、大鼠、兔子等)。與大型動物相比，小型動物實驗成本更低，可接受性更高。大鼠是腦卒中研究中最常用的動物之一[4]，其腦血管系統(tǒng)和生理學(xué)特性與人類相似，適中的體型便于監(jiān)測生理參數(shù)，更重要的是容易進行重復(fù)性研究。

2 常見的缺血性腦卒中模型

2.1 腔內(nèi)縫合大腦中動脈栓塞模型

由于大腦中動脈及其分支最易受到影響形成大腦中動脈栓塞，從而引發(fā)缺血性腦卒中，因此可通過阻斷大腦中動脈來構(gòu)建大腦中動脈栓塞模型。大腦中動脈栓塞模型具有較低的侵入性，同時也是最接近人類缺血性中風(fēng)的一種技術(shù)，目前在科研上已被廣泛使用[5]。大腦中動脈栓塞模型常采用線栓法進行[6]，該方法創(chuàng)傷較小，不需要進行開顱手術(shù)，因此避免了對顱骨結(jié)構(gòu)的損傷。線栓插入的方式可分為頸外動脈插線和頸總動脈插線。頸總動脈插線法是在分離出大鼠的頸外動脈、頸總動脈和頸內(nèi)動脈后，暫時阻斷頸外動脈，將線栓從頸總動脈直接引入到頸內(nèi)動脈，并推進線栓，直到中斷大腦中動脈的血液供應(yīng)。頸外動脈插線是將線栓插入橫斷的頸外動脈中，從頸外動脈推入線栓穿過頸內(nèi)動脈到達大腦中動脈，從而中斷大腦中動脈的血液供應(yīng)。該方法可實現(xiàn)永久性大腦中動脈栓塞或短暫性大腦中動脈栓塞。頸外動脈插線是暫時性大腦中動脈栓塞的較好選擇，因為它保持了再灌注所需的解剖完整性[7]。大鼠大腦中動脈栓塞模型最常見的腦組織缺血持續(xù)時間為60、90和120 min，或永久性缺血，誘發(fā)梗死的成功率為88%～100%。

大腦中動脈栓塞模型具有以下幾個優(yōu)點[8]：①人類缺血性中風(fēng)通常是因為大腦中動脈受到影響發(fā)生閉塞，該模型能很好地模擬人類缺血性中風(fēng)的情況，并顯示出與人類中風(fēng)相似的腦組織陰影成像；②大腦中動脈栓塞模型的特點是梗死體積大，重現(xiàn)性高，再灌注和缺血的持續(xù)時間可以精確控制；③該模型建立過程相對容易執(zhí)行且不耗時。但根據(jù)線栓的類型和實驗人員的操作水平不同，有可能在建模時會導(dǎo)致血管破裂和蛛網(wǎng)膜下腔出血從而導(dǎo)致建模失敗。這些缺點可以通過使用硅涂層縫合線和在激光多普勒血流探測儀的引導(dǎo)下放置線栓來解決。

2.2 開顱手術(shù)模型

開顱手術(shù)模型通過手術(shù)直接切除大腦中動脈來實現(xiàn)，需要開顱和切開硬腦膜以暴露大腦中動脈。具體操作方法可分為兩種：①首先分離腮腺和顳肌，橫切顴弓，移除覆蓋在大腦中動脈上的顱骨，通過電凝和附加橫斷阻斷大腦中動脈，導(dǎo)致永久性阻斷，或者通過微動脈瘤夾、鉤子、結(jié)扎等方法在小鼠體內(nèi)實現(xiàn)大腦中動脈永久性阻斷[9]。②三血管閉塞模型[10]，該模型涉及兩個頸總動脈的額外閉塞，可減少側(cè)支血流，鞏固缺血性損傷。梗死范圍取決于大腦中動脈和頸總動脈是永久性還是暫時性閉塞。該方法誘導(dǎo)的腦缺血損害了大部分額葉、頂葉、顳葉和頭端枕葉皮質(zhì)、底層白質(zhì)和紋狀體邊緣部分[11]。但可以避免腔內(nèi)縫合大腦中動脈栓塞模型中出現(xiàn)的丘腦、下丘腦、海馬和中腦損傷。與腔內(nèi)縫合大腦中動脈栓塞模型相比，該方法可誘導(dǎo)更小的梗死體積。

開顱手術(shù)模型的主要優(yōu)點是在梗死面積和神經(jīng)功能缺損方面具有良好的可重復(fù)性，實驗動物死亡率低，并且可以通過視覺確認(rèn)實驗是否成功。主要缺點是在顱骨切除的過程中，可能會因為鉆孔或電凝等操作導(dǎo)致底層皮質(zhì)損傷或血管破裂，還有可能影響顱內(nèi)壓，因此該模型的建立需要實驗操作人員具有較高的手術(shù)技巧。

2.3 光血栓模型

光血栓腦卒中模型是基于血管內(nèi)的光氧化反應(yīng)[12]，該反應(yīng)會導(dǎo)致大腦皮質(zhì)明確的缺血性損傷，并且會使紋狀體發(fā)生一定的改變。光血栓腦卒中模型是通過在小鼠腹腔注射或大鼠靜脈注射光活性染料(如孟加拉玫瑰紅、紅色素B)后，用特定波長的光束照射大腦幾分鐘來構(gòu)建的[13]。這一過程可在動物腦中產(chǎn)生氧自由基，導(dǎo)致內(nèi)皮損傷、血小板活化，光照區(qū)域的軟腦膜和腦實質(zhì)內(nèi)血管發(fā)生聚集，從而造成腦組織缺血。

光血栓腦卒中模型的主要優(yōu)點是能使大鼠腦組織缺血細胞快速死亡、所需的手術(shù)干預(yù)最少，而且重復(fù)性高、死亡率低等[14]。該模型的缺點在于腦組織缺血是由于其末端動脈閉塞引起的，這種快速演變的缺血性損傷和同時發(fā)生的內(nèi)皮損傷與早期細胞毒性(細胞內(nèi))及同時發(fā)生的血管源性(細胞外)水腫形成有關(guān)。此外該模型中僅出現(xiàn)少量或無缺血半暗帶和局部側(cè)支循環(huán)/再灌注。

2.4 內(nèi)皮素-1模型

內(nèi)皮素-1是一種具有長效性的血管收縮肽[15]。它可以直接用于暴露的大腦中動脈，進行腦內(nèi)(立體定向)注射或應(yīng)用于皮質(zhì)表面，從而導(dǎo)致劑量依賴性缺血損傷和邊緣缺血性水腫[16]。當(dāng)內(nèi)皮素-1應(yīng)用于皮質(zhì)表面時產(chǎn)生的缺血損傷與永久性大腦中動脈栓塞缺血損傷類似，而內(nèi)皮素-1定向注射會導(dǎo)致所涉及的皮質(zhì)層發(fā)生半圓形梗死。內(nèi)皮素-1的血管收縮特性也可用于建立大腦前動脈栓塞的模型。

內(nèi)皮素-1模型的優(yōu)點是侵入性小、死亡率低，以及有可能在腦深部區(qū)域和淺部區(qū)域直接誘發(fā)局灶性缺血。然而由于內(nèi)皮素-1受體和內(nèi)皮素-1轉(zhuǎn)化酶也是由神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞進行表達，所以該模型的應(yīng)用具有局限性[17]。

2.5 栓塞性卒中模型

栓塞性卒中模型可分為微球/巨球栓塞模型和血栓栓塞模型。微球栓塞模型是使用微導(dǎo)管通過頸外動脈將微球插入大腦中動脈或頸內(nèi)動脈中，微球的直徑為20～50 μm，會隨著血液的流動，被動地沖入到腦部的血液循環(huán)中從而導(dǎo)致多灶性和異質(zhì)性梗死[18]。注射后24 h內(nèi)病灶區(qū)域緩慢增大。病變的范圍和嚴(yán)重程度可通過調(diào)節(jié)注射微球的大小和注射劑量來控制。在巨球栓塞模型中，巨球的直徑為100～400 μm，這些球體被注入到頸內(nèi)動脈后會造成動脈栓塞，從而導(dǎo)致腦組織局灶性缺血損傷[19]。與大腦中動脈栓塞模型相比，微球/巨球栓塞模型的優(yōu)點是保留了下丘腦的血液供應(yīng)，從而避免了下丘腦梗死和及其產(chǎn)生的不良反應(yīng)。

血栓栓塞模型是通過自體血液中自發(fā)形成的血塊或凝血酶誘導(dǎo)的血栓而建立的模型[20]。誘導(dǎo)血栓時可直接將凝血酶注入到頸內(nèi)動脈的顱內(nèi)段或大腦中動脈中。該模型更接近于在大部分人類中風(fēng)后觀察到的血管閉塞機制。血栓栓塞模型中梗死的體積和部位取決于血栓的大小和血管的彈性。與線栓大腦中動脈栓塞引起的缺血性病變相比，血栓栓塞模型梗死體積更小，腦組織發(fā)生的病理生理變化更大。

綜上所述，缺血性腦卒中約占臨床腦卒中總比例的80%，其中以大腦中動脈栓塞最為常見[21]。缺血性腦卒中的嚴(yán)重程度及愈后的恢復(fù)情況與腦組織局部缺血的持續(xù)時間、血壓高低、梗死體積以及年齡和性別都有必不可分的聯(lián)系[22]。缺血性腦卒中動物模型的建立對進行人類腦卒中的研究有很大幫助。由于該類模型面臨造模成本高、耗時長等問題，因此，對于此類動物模型的研究并不深入。而且腦卒中是一個系列性疾病，如動脈粥樣硬化、炎癥或感染等原因都可能引起梗塞?，F(xiàn)有模型多使用健康和年輕的動物，與患病人群情況仍有較大偏差。所以如何建造經(jīng)濟合適、具有高度復(fù)雜性疾病的動物模型將成為科研人員面臨的首要任務(wù)。