壯藥赪桐乙酸乙酯部位及流份對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞的抗炎作用

魏江存，秦祖杰*，蔡文威，馬秀梅，覃麗萍，馬艷，鄭玲，譚雨坪

1.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院，南寧 530201；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530200

赪桐為馬鞭草科大青屬植物赪桐Clerodendrum japonicum(Thunb.)Sweet.，又名紅龍船、抽須紅[1]、“個(gè)朋被”(壯族語)[2]，產(chǎn)自廣西、貴州和云南等地。赪桐主要含有黃酮類、酚酸類等成分[3，4]，全株均可入藥，味甘，性涼，其具有抗炎[5，6]、抗氧化[7]和抗腫瘤[8]等作用，主治偏頭痛、跌打瘀腫、癰腫瘡毒；臨床用于肺熱咳嗽、熱淋、小便不利的治療[9]。在前期研究工作中，發(fā)現(xiàn)赪桐乙酸乙酯部位成為抗炎活性最強(qiáng)有效部位，然而，其發(fā)揮抗炎作用的具體環(huán)節(jié)和靶點(diǎn)以及主要的有效成分尚不清楚。本課題通過建立脂多糖誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞的體外炎癥模型，通過硅膠柱將赪桐乙酸乙酯部位進(jìn)行劃分的組分從其抗炎因子的表達(dá)篩選最強(qiáng)的抗炎有效組分。故本實(shí)驗(yàn)采用MTT 法于490 nm 波長下檢測(cè)壯藥赪桐乙酸乙酯部位及其不同二氯甲烷-甲醇梯度洗脫部位對(duì)細(xì)胞的毒性作用，并采用ELISA 法檢測(cè)赪桐乙酸乙酯部位及其不同二氯甲烷-甲醇各洗脫部位對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞分泌NO、TNF-a、IL-12、IL-6、IL-1β炎癥因子的影響，來篩選出赪桐乙酸乙酯部位對(duì)炎癥反應(yīng)的抑制作用最強(qiáng)的流份，為其發(fā)揮抗炎的有效成分及作用機(jī)制研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Biotek SYNERGY H1M 型多功能酶標(biāo)儀；CKX53型顯微鏡（奧林巴斯）；HWS-26 電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；CO2 培養(yǎng)箱（ESCO CCL-240B-8）；TS-200B 空氣恒溫?fù)u床（上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司）；SQP 型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 實(shí)驗(yàn)藥材 藥材采自廣西南寧市武鳴區(qū)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部唐春麗副主任中藥師鑒定為馬鞭草科大青屬植物赪桐Clerodendrum japonicum(Thunb.)Sweet.，藥用部位為全株。

1.2.2 主要試劑 胎牛血清（克拉克生物科學(xué)公司，美國）；RPMI1640 不完全培養(yǎng)液（江蘇凱基生物科技股份有限公司；生產(chǎn)批號(hào)20200806）；PBS（美國Gibco公司）；MTT、胰蛋白酶、LPS 均購自北京索萊寶科技有限公司；TNF-a（南京建成生物工程研究所，批號(hào)2020/06）；一氧化氮(NO)測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20200406）；IL-6、IL-12、IL-1β 試劑盒（北京康普同創(chuàng)生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)分別為：202008、202006、202001）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 赪桐乙酸乙酯部位及其流份的制備 將赪桐藥材8.5 kg，用80%乙醇浸泡24 h 后回流提取1.5 h 后過濾，重復(fù)提取3 次后藥渣再加60%乙醇回流提取2次，每次1.5 h，合并濾液，濃縮至無乙醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，得到赪桐乙酸乙酯浸膏662.85 g。

取赪桐乙酸乙酯部位浸膏150 g 加甲醇溶解拌于預(yù)處理好的適量柱色譜硅膠，烘干后上樣。分別以二氯甲烷-甲醇（70:1）、二氯甲烷-甲醇（50:1）、二氯甲烷-甲醇（30:1）、二氯甲烷-甲醇（20:1）、二氯甲烷-甲醇（10:1）梯度洗脫，各濃度10 倍柱體積，分別合并各洗脫部位，濃縮并冷凍干燥。得各部位干膏，密封保存，待用。

取赪桐乙酸乙酯部位及其不同洗脫部位粉末0.15 g 精密稱定，加入含0.1%DMSO 的RPMI1640 不完全培養(yǎng)基超聲溶解，再用RPMI1640 不完全培養(yǎng)液稀釋至3.0 mg/ml，過無菌濾膜，再用完全培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 MTT 法檢測(cè)LPS 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活性的影響及炎癥模型的建立

1.3.2.1 LPS 對(duì)細(xì)胞活性的影響 (1) LPS 母液的配置：LPS5mg+5 ml PBS 溶解，配制成濃度為1mg/ml。(2)取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7 細(xì)胞在5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。(3) 24 h 后，棄去孔內(nèi)上清液，使用1640 完全培養(yǎng)基稀釋LPS 母液，得到一系列LPS 稀釋液0、0.5、1.0、5.0、10.0、25.0 μg/ml。棄掉96 孔板中培養(yǎng)基，加入不同濃度的LPS 稀釋液，分別處理細(xì)胞12、24 h。(4)棄掉培養(yǎng)液，每孔加入110 μl MTT 與完全培養(yǎng)基混合溶液（DMEM：MTT=10：1），放入培養(yǎng)箱孵育4 h。(5) 棄掉孔內(nèi)混合液，然后每孔加入110 μl Formazan 溶劑，輕搖10 min，在490 nm 波長處測(cè)定每孔吸光度值（OD），并按公式計(jì)算細(xì)胞活力，在顯微鏡下觀察LPS 刺激24 h 后的細(xì)胞形態(tài)變化，并拍照。(6) 將結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，從而判斷不同濃度LPS對(duì)RAW 264.7 細(xì)胞活性的影響。

1.3.2.2 RAW264.7 細(xì)胞LPS 炎癥模型的建立 (1)取對(duì)數(shù)生長期RAW264.7 細(xì)胞，輕輕拍打，經(jīng)1000 rpm離心5 min，棄去上清液，用完全培養(yǎng)基配成5×104個(gè)/ml 的細(xì)胞懸浮液，接種于96 孔板中，每孔加入100 μl的細(xì)胞懸液，置37℃、含5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。(2)24 h 后，棄去孔內(nèi)上清液，用1640 完全培養(yǎng)基稀釋LPS 母液，得到一系列LPS 稀釋液0、0.5、1.0、5.0、10.0、25.0 μg/ml，分別觀察2、4、6、8、12、16、24 h 后的細(xì)胞狀態(tài)并拍照，培養(yǎng)24 h 后取細(xì)胞上清液按照NO、IL-6 試劑盒測(cè)定，確定最佳炎癥模型條件。

1.3.3 赪桐乙酸乙酯部位及其流份對(duì)細(xì)胞活性的影響（1）取對(duì)數(shù)生長期RAW264.7 細(xì)胞，用胰酶消化后，經(jīng)1000 rpm 離心5 min，棄去上清液，用完全培養(yǎng)基配成5×104個(gè)/ml 細(xì)胞懸浮液，接種96 孔板中，每孔加入100 μl 的細(xì)胞懸液，置37℃、含5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。(2) 24 h 后，棄掉孔內(nèi)上清液，分別加入100 μl濃度為3.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.06 mg/ml 的赪桐乙酸乙酯部位（YS）、二氯甲烷-甲醇（70:1）洗脫部位（YSEJ70）、二氯甲烷-甲醇（50:1）洗脫部位（YSEJ50）、二氯甲烷-甲醇（30: 1）洗脫部位（YSEJ30）、二氯甲烷-甲醇（20: 1）洗脫部位（YSEJ20）、二氯甲烷-甲醇（10:1）洗脫部位（YSEJ10）的完全培養(yǎng)基，對(duì)照組為100 μl 完全培養(yǎng)基，空白組為100 μl 完全培養(yǎng)基（無細(xì)胞），每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，置37℃、含5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。(3) 24 h 后，每孔加入110 μl MTT 與完全培養(yǎng)基混合溶液（DMEM：MTT=10：1），放入培養(yǎng)箱孵育4 h，棄掉孔內(nèi)混合溶液，每孔加入110 μl Formazan 溶劑，輕搖10 min，在490 nm 波長處測(cè)定每孔吸光度值（OD），并按公式計(jì)算細(xì)胞活力。(4) 細(xì)胞抑制率的計(jì)算公式：存活率=（藥物組OD 值一空白組OD 值）/（對(duì)照組OD 值一空白組OD 值）×100%。

1.3.4 檢測(cè)細(xì)胞因子NO、TNF-a、IL-12、IL-6 和IL-1β含量 (1) 取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7 細(xì)胞，用胰酶消化后，經(jīng)1000 rpm 離心5 min，棄去上清液，用完全培養(yǎng)基配成5×104個(gè)/ml 的細(xì)胞懸浮液，接種96 孔板中，每孔加入100 μl 的細(xì)胞懸液，置37℃、含5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。(2) 24 h 后，棄去孔內(nèi)上清液，分別加入100 μl 含藥完全培養(yǎng)基（其中赪桐乙酸乙酯部位（YS）、二氯甲烷-甲醇（70:1）洗脫部位（YSEJ70）、二氯甲烷-甲醇（50:1）洗脫部位（YSEJ50）、二氯甲烷-甲醇（30:1）洗脫部位（YSEJ30）、二氯甲烷-甲醇（20:1）洗脫部位（YSEJ20）、二氯甲烷-甲醇（10:1）洗脫部位（YSEJ10），每個(gè)洗脫部位的給藥終濃度分別為0.25、0.125、0.06 mg/ml；LPS 的終濃度為1.0 μg/ml），含LPS 1.0 μg/ml 完全培養(yǎng)基和不含LPS 完全培養(yǎng)基，即給藥組、模型組（M）和空白組（K），每組設(shè)置4 個(gè)復(fù)孔，置37℃、含5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。(3) 24 h 后，按試劑盒測(cè)定細(xì)胞分泌的NO 以及炎癥因子TNF-a、IL-12、IL-6、IL-1β 的含量。(4) ELISA 法實(shí)驗(yàn)操作步驟參考說明書。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 的細(xì)胞炎癥模型的建立

2.1.1 LPS 對(duì)RAW264.7 的細(xì)胞毒性結(jié)果 實(shí)驗(yàn)表明：1.0～25.0 μg/ml 的LPS 刺 激RAW 264.7 細(xì) 胞24 h后，細(xì)胞增長較于對(duì)照組有顯著增加（P＜0.05），其中1.0 μg/ml 的LPS 對(duì)細(xì)胞增長速度較快（P＜0.01），但在刺 激48 h 后細(xì)胞增長明顯受到抑制（P＜0.05、P＜0.01）。結(jié)果表明，25.0 μg/ml 及其以下濃度的LPS 在24 h 對(duì)細(xì)胞活力無明顯的抑制作用，但在48 h 后細(xì)胞活力明顯被抑制，結(jié)果見表1。

表1 不同濃度的LPS 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活性的影響(，n=3)Tab.1 Effects of different concentrations of LPS on the viability of RAW264.7 cells (Mean±SD, n=3)

表1 不同濃度的LPS 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活性的影響(，n=3)Tab.1 Effects of different concentrations of LPS on the viability of RAW264.7 cells (Mean±SD, n=3)

注：Δ P＜0.05，ΔΔ P＜0.01 與空白對(duì)照組比較Note: Δ P＜0.05,ΔΔ P＜0.01 vs blank control group

表2 不同濃度的LPS 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞分泌NO 的影響(，n=4)Tab.2 Effect of different concentrations of LPS on NO secretion in RAW264.7 cells(Mean±SD, n=4)

表2 不同濃度的LPS 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞分泌NO 的影響(，n=4)Tab.2 Effect of different concentrations of LPS on NO secretion in RAW264.7 cells(Mean±SD, n=4)

注：ΔΔ P＜0.01，ΔΔΔ P＜0.001 與空白對(duì)照組比較Note: ΔΔ P＜0.01,ΔΔΔ P＜0.001 vs blank control group

2.1.2 LPS 對(duì)RAW264.7 的細(xì)胞形態(tài)變化 不同濃度LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞24 h 后，用顯微鏡下觀察，結(jié)果表明：RAW 264.7 細(xì)胞在正常生長情況下，細(xì)胞形態(tài)呈圓形或橢圓形，像珍珠一樣光亮透明，且邊界清晰；當(dāng)其受到LPS 刺激后，部分細(xì)胞由圓形變?yōu)樗笮位蚨噙呅危疫吘壪蛲馍煺?，出現(xiàn)觸角，邊界逐漸變得不清晰，隨著LPS 濃度增高，細(xì)胞形態(tài)變化越明顯，結(jié)果見圖1。

圖1 不同濃度LPS 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞24h 后形態(tài)的變化A:對(duì)照組B: LPS,1.0 μg/ml C: LPS,2.0 μg/ml D: LPS,5.0 μg/ml E: LPS,10.0 μg/ml F: LPS,25.0 μg/mlFig.1 The morphological changes of RAW264.7 cells 24h after stimulating by different concentrations of LPS A: Control; B: LPS,1.0 μg/ml; C: LPS,2.0 μg/ml; D: LPS,5.0 μg/ml; E: LPS,10.0 μg/ml; F: LPS,25.0 μg/ml

2.1.3 LPS 對(duì)NO 的表達(dá)的影響 RAW264.7 細(xì)胞在1.0、2.0、5.0、10.0、25.0 μg/ml 的LPS 刺激細(xì)胞24 h 后會(huì)釋放促炎因子NO，NO 的含量較空白對(duì)照組極顯著增加（P＜0.001），且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，其中1.0 μg/ml 的LPS 刺激下，NO 的表達(dá)量可以顯著增加1.16 倍。

2.1.4 LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 的細(xì)胞炎癥模型的確定根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及結(jié)合細(xì)胞活力、形態(tài)、狀態(tài)變化及NO 表達(dá)結(jié)果，選取1μg/mL 的LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞24 h，建立炎癥反應(yīng)模型。

2.2 赪桐乙酸乙酯部位及其流份對(duì)細(xì)胞活性的影響

2～0.06 mg/ml 的赪桐乙酸乙酯部位及流份分別作用RAW264.7 細(xì)胞24、48 h，結(jié)果表明：隨著濃度的增高，培養(yǎng)時(shí)間越長，赪桐乙酸乙酯部位及其洗脫流份對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用越強(qiáng)，濃度在0.5 mg/ml 以上具有明顯的細(xì)胞毒性，而0.5 mg/ml 以下濃度對(duì)細(xì)胞活力具有增強(qiáng)作用（P＜0.05），說明當(dāng)為0.5 mg/ml及以下濃度時(shí)，給藥濃度在安全范圍內(nèi)，可以用于對(duì)細(xì)胞進(jìn)行研究，結(jié)果見表3。

表3 乙酸乙酯部位及其流份對(duì)細(xì)胞活性的影響 (，n=3)Tab.3 The influence of ethyl acetate fraction and its fraction on cell viability (Mean±SD, n=3)

表3 乙酸乙酯部位及其流份對(duì)細(xì)胞活性的影響 (，n=3)Tab.3 The influence of ethyl acetate fraction and its fraction on cell viability (Mean±SD, n=3)

注：ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01，ΔΔΔP＜0.001 與空白對(duì)照組比較Note: ΔP＜0.05,ΔΔP＜0.01,ΔΔΔP＜0.001 vs blank control group

2.3 赪桐乙酸乙酯部位及其流份對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞分泌NO 和TNF-α 的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組的NO 的分泌量顯著增加，這是巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥的表現(xiàn)。與模型組相比：乙酸乙酯高劑量組、中劑量組均能顯著的降低炎癥因子NO 和TNF-α 的分泌；赪桐二氯甲烷-甲醇（50:1）洗脫部位高、中、低劑量組可以顯著抑制NO 和TNF-α 的分泌；赪桐二氯甲烷-甲醇（30:1）洗脫部位和二氯甲烷-甲醇（20:1）洗脫部位的高、中劑量均有抑制作用；而赪桐二氯甲烷-甲醇（70:1）洗脫部位和赪桐二氯甲烷-甲醇（10:1）洗脫部位的高劑量組可以顯著抑制（P＜0.05）。低劑量有抑制趨勢(shì)但與模型組比較沒有顯著差異，結(jié)果見表4。

表4 對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞分泌TNF-a 的影響 (，n=4)Tab.4 Effect on LPS-induced TNF-a secretion in RAW264.7 cells (Mean± SD, n=4)

表4 對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞分泌TNF-a 的影響 (，n=4)Tab.4 Effect on LPS-induced TNF-a secretion in RAW264.7 cells (Mean± SD, n=4)

注：ΔΔP＜0.01，ΔΔΔP＜0.001 與空白對(duì)照組比較；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 與模型對(duì)照組比較Note: ΔΔP＜0.01,ΔΔΔP＜0.001 vs blank control group;*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 VS model control group

2.4 赪桐乙酸乙酯部位及其流份對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞分泌IL-6、IL-12 和IL-1β 的影響

與空白對(duì)照組比較，在LPS 的誘導(dǎo)下，模型組的的分泌量顯著IL-6、L-12 和IL-1β 增加。加入赪桐乙酸乙酯部位及其流份干預(yù)后，IL-6、L-12 和IL-1β 的分泌量得到明顯的減少，與模型組相比：赪桐乙酸乙酯高劑量組、中劑量組能顯著的降低炎癥因子IL-6、L-12 和IL-1β 的分泌，而低劑量有抑制作用但沒有顯著差異；赪桐二氯甲烷-甲醇（50:1）洗脫部位的高、中、低劑量組可以極顯著抑制IL-6、L-12 和IL-1β 的分泌；二氯甲烷-甲醇（30:1）洗脫部位和二氯甲烷-甲醇（20:1）洗脫部位的高、中劑量均能顯著抑制IL-6、L-12 和IL-1β 的分泌，低劑量有抑制作用但沒有顯著差異；而赪桐二氯甲烷-甲醇（70:1）洗脫部位、二氯甲烷-甲醇（10:1）洗脫部位的高劑量組、中劑量組可以顯著抑制（P＜0.01），低劑量有抑制趨勢(shì)但與模型組比較沒有顯著差異。結(jié)果見表5。

赪桐二氯甲烷-甲醇（70:1）洗脫部位高、中、低劑量組均能抑制炎癥因子IL-12 的分泌；而赪桐二氯甲烷-甲醇（10:1）洗脫部位的高劑量組有顯著差異，中劑量組具有抑制抑制作用但與模型組比較沒有顯著差異。赪桐二氯甲烷-甲醇（70:1）洗脫部位和赪桐二氯甲烷-甲醇（10:1）洗脫部位的高、中、低劑量組與模型組比較抑制炎癥因子IL-1β沒有顯著差異。結(jié)果見表5。

表5 對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞分泌IL-6、IL-12 和IL-1β 的影響 (，n=4)Tab.5 Effect on LPS-induced RAW264.7 cells to secrete IL-6,IL-12 and IL-1β(Mean±SD, n=4)

表5 對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞分泌IL-6、IL-12 和IL-1β 的影響 (，n=4)Tab.5 Effect on LPS-induced RAW264.7 cells to secrete IL-6,IL-12 and IL-1β(Mean±SD, n=4)

注：ΔΔP＜0.01，ΔΔΔP＜0.001 與空白對(duì)照組比較；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 與模型對(duì)照組比較Note: ΔΔP＜0.01,ΔΔΔP＜0.001 VS blank control group;*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs model control group

3 討論

本研究以脂多糖(LPS) 誘導(dǎo)RAW264.7 作為炎癥細(xì)胞模型，LPS 誘導(dǎo)激活RAW264.7 細(xì)胞分泌iNOS，iNOS 活化會(huì)直接催化NO 生成，NO 釋放量明顯升高，從而使得細(xì)胞釋放重要的炎癥標(biāo)志因子TNF-a，而TNF-a在炎癥網(wǎng)絡(luò)中具有關(guān)鍵作用，是全身炎性反應(yīng)的始動(dòng)介質(zhì)，可誘導(dǎo)IL-1、IL-6、IL-10、IL-1β 表達(dá)釋放，使炎性損傷的級(jí)聯(lián)效應(yīng)放大，從而進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)[10-12]。

本研究結(jié)果顯示，1μg/m L 的LPS 刺 激RAW 264.7 細(xì)胞后NO、TNF-a、IL-12、IL-6、IL-1β 炎癥因子分泌顯著增加，炎癥模型成功。赪桐二氯甲烷-甲醇（50:1）洗脫部位（YSEJ50）高、中、低劑量都能顯著抑制炎癥因子的釋放，二氯甲烷-甲醇（30:1）洗脫部位（YSEJ30）、二氯甲烷-甲醇（20:1）洗脫部位（YSEJ20）只有高、中劑量能炎癥因子的釋放，二氯甲烷-甲醇（70:1）洗脫部位（YSEJ70）、二氯甲烷-甲醇（10:1）洗脫部位（YSEJ10）只有高劑量能抑制炎癥因子IL-12、IL-6、TNF-a 炎癥因子釋放，對(duì)NO 的分泌沒有抑制作用。說明赪桐乙酸乙酯部位與其不同梯度二氯甲烷-甲醇洗脫部位抗炎機(jī)制是通過抑制NO、TNF-a、IL-12、IL-6、IL-1β 炎癥因子的產(chǎn)生起作用。

赪桐乙酸乙酯部位及其不同極性洗脫部位抗炎機(jī)制是通過抑制NO、TNF-a、IL-12、IL-6、IL-1β 炎癥因子的產(chǎn)生起作用，隨著赪桐乙酸乙酯部位及其不同極性洗脫部位藥物濃度越大，炎癥因子分泌越少，有劑量依賴性，赪桐二氯甲烷-甲醇（50:1）洗脫部位和二氯甲烷-甲醇（30:1）洗脫部位的抗炎能力較大。本實(shí)驗(yàn)研究赪桐乙酸乙酯部位及其二氯甲烷-甲醇（70:1）、二氯甲烷-甲醇（50:1）、二氯甲烷-甲醇（30:1）、二氯甲烷-甲醇（20:1）、二氯甲烷-甲醇（10:1）梯度洗脫部位對(duì)LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞體外炎癥的抗炎作用，而未涉及到體內(nèi)抗炎作用研究，如果結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究抗炎作用，可更深入篩選出抗炎最強(qiáng)的有效部位（流份）。研究從赪桐對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細(xì)胞炎癥入手，可以進(jìn)一步研究赪桐對(duì)急、慢性炎癥的影響，挖掘壯藥赪桐藥材新的治療作用。