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    丹參酮IIA 對CCl4誘導小鼠急性肝損傷的保護作用

    2022-12-30 09:24:48李青青熊佳慧溫玉清楊紅勝李金斗方萌劉宇煒
    中國臨床解剖學雜志 2022年6期
    關鍵詞:抗氧化肝臟通路

    李青青,熊佳慧,溫玉清,楊紅勝,李金斗,方萌,劉宇煒

    江漢大學醫(yī)學院,武漢 430056

    急性肝損傷(acute liver injury,ALI)是指在短時間內由于各種因素引發(fā)的突發(fā)性肝細胞損傷和肝功能異常。病毒感染、藥物中毒、免疫反應和缺血再灌注等都是ALI 常見的誘發(fā)因素[1]。ALI 發(fā)生發(fā)展過程中涉及到機體內多條信號傳導通路,包括TGF-β/Smad、PI3K/Akt、Nrf2/HO-1 信號通路等。為了研究其病理機制并尋找有效的治療手段,國內外學者建立了一系列ALI 模型,其中包括由CCl4誘導的化學性肝損傷模型[2]。CCl4的肝毒性作用機制,目前公認是自由基的形成以及由此引發(fā)的鏈式過氧化反應[3]。采用CCl4構建小鼠急性肝損傷模型,技術要求相對較低,可重復性高,造模效果理想,因此得到廣泛應用。目前,針對急慢性肝臟疾病的治療尚無非常理想的方法,在沒有明確的干預手段下,ALI 可能會進一步發(fā)展,引起肝纖維化甚至肝癌,進而危及生命。在對ALI 的研究中發(fā)現,許多中藥如丹參、紅景天、姜黃等都頗具治療潛力[4~7]。Tan ⅡA 是中藥丹參的有效提取物之一,具有抗炎、抗氧化、保肝等作用[8]。為深入探究Tan ⅡA對ALI 的保護作用,本研究觀察了Tan ⅡA 對CCl4誘導的小鼠急性肝損傷的影響,并進一步研究其可能的作用機制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 動物 SPF 級C57BL/6J 小鼠30 只,6~8 周齡,均為雄性,體重(20±3) g,購自斯貝福(北京)生物技術有限公司,合格證號:SCXK(京)2019-0010。飼養(yǎng)于江漢大學實驗動物中心SPF 級動物房,溫度為20~25°C,濕度為40%~60%,光照明暗各12 h 交替循環(huán),自由攝取食物和水。

    1.1.2 藥物與試劑 丹參酮ⅡA (Tan ⅡA,分子式C19H18O3,分子量294.35,純度98.0%)購自成都普思生物科技有限公司;羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)購自美國Sigma 公司;天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、總超氧化合物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;鼠抗GAPDH 抗體,兔抗PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 抗體均購自美國CST 公司;兔抗Nrf2 抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司;兔抗HO-1 抗體購自美國Abcam 公司。

    1.1.3 儀器 全波長酶標儀(美國BioTek 公司,型號:Epoch);臺式高速冷凍離心機(湖南平凡科技有限公司,型號:TGL-22M);高通量冷凍研磨儀(寧波洛尚智能科技有限公司,型號:DHFSTPRP-CL64);化學發(fā)光成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad 公司,型號:ChemiDocTM Imaging System)。

    1.2 方法

    1.2.1 動物分組和造模 30 只C57BL/6J 小鼠適應性喂養(yǎng)1 周后,隨機分成3 組,分別為正常組、CCl4組與Tan ⅡA 保護組(Tan ⅡA 20 mg/kg+CCl4),每組10 只。Tan ⅡA 保護組連續(xù)給藥7 d(i.g.),正常組和CCl4組給予等量的CMC-Na 溶液(i.g.)。末次給藥后,除正常組外,其余各組小鼠均腹腔注射0.2% CCl4的橄欖油溶液10 mL/kg,正常組腹腔注射等體積的橄欖油。禁食12 h,稱體重,麻醉下眼球采血,靜置后離心取血清-20 °C 保存?zhèn)溆谩=馄嗜「闻K稱重,肝左葉置于4%多聚甲醛溶液中固定,用于常規(guī)HE 染色,肝右葉放入凍存管中于-80 °C 冰箱凍存?zhèn)溆?。所有實驗均按照江漢大學動物中心實驗動物福利倫理審查指南進行。動物實驗經江漢大學實驗動物倫理委員會批準(倫理編號:JHDXLL2022-036)。

    1.2.2 肝臟指數計算 小鼠眼球取血前稱體重,麻醉下頸部脫臼處死后剖腹取肝臟,稱肝重,計算肝臟指數[肝重(g)/體重(g)×100%]。

    1.2.3 血清生化指標檢測 眼球采血收集約1 mL 血樣,靜置后低溫離心獲取血清,按照相應試劑盒說明書操作,全波長酶標儀(波長510 nm)檢測血清中AST 和ALT 活 性。

    1.2.4 肝組織生化指標檢測 稱取0.1 g 肝組織,加入0.9 mL 冰生理鹽水,剪碎,低溫勻漿,臺式高速冷凍離心機(4 °C,12000 r/min)離心,靜置后獲得上清液。根據相應試劑盒說明書,分別檢測肝組織中SOD 活性及GSH、MDA 含量。

    1.2.5 肝臟組織病理學檢查 肝左葉置于4%多聚甲醛溶液中固定,脫水透明,石蠟包埋,5 μm 切片,烤片,常規(guī)HE 染色,透明干燥后中性樹膠封片,光學顯微鏡下觀察肝組織病理學變化并拍照。

    1.2.6 免疫組織化學分析 5 μm 石蠟切片脫蠟后梯度酒精中水化,0.01 mol/L 檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)非酶抗原修復。按照通用SP 檢測試劑盒說明書,濕盒避光孵育,分別滴加相應的一抗(1:2000 稀釋的兔抗HO-1 抗體;1:100 稀釋的兔抗p-PI3K、p-Akt 和Nrf2 抗體),4 °C 孵育過夜,二抗室溫孵育30 min,DAB 顯色,蘇木精復染,脫水封片。光學顯微鏡隨機拍攝八個視野并通過ImageJ 軟件(V1.8.0)取平均光密度值。

    1.2.7 Western blot 常規(guī)提取小鼠肝組織中細胞總蛋白,BCA 法測定蛋白濃度,SDS-PAGE 凝膠電泳分離,轉至PVDF 膜上,封閉(3% BSA)90 min 后,孵育一抗,一抗包括鼠抗GAPDH,兔抗PI3K、p-PI3K、Akt 和Nrf2 抗體(1:1000 稀釋),兔抗p-Akt 和HO-1 抗體(1:2000 稀釋),4 °C 孵育過夜。室溫孵育辣根酶標記山羊抗兔IgG 二抗(1:10000 稀釋)/辣根酶標記山羊抗小鼠IgG 二抗(1:10000 稀釋),ECL 法曝光顯影,觀察并拍照,ImageJ 軟件(V1.8.0)進行灰度分析。

    1.3 統(tǒng)計學方法

    2 結果

    2.1 Tan ⅡA 對CCl4誘導的急性肝損傷小鼠肝臟指數的影響

    與正常組比較,7 d 末時,CCl4組小鼠體重、肝重以及肝臟指數均明顯升高(表1,P<0.01),表明CCl4誘導急性肝損傷后導致小鼠肝臟發(fā)生腫脹;而與CCl4組比較,Tan ⅡA 保護組小鼠體重、肝重以及肝臟指數均顯著降低(表1,P<0.01),表明Tan ⅡA 可以緩解小鼠肝臟腫脹。

    表1 Tan ⅡA 對小鼠肝臟指數的影響(,n=10)Tab.1 The effect of Tan ⅡA on liver index in mice (Mean±SD, n=10)

    表1 Tan ⅡA 對小鼠肝臟指數的影響(,n=10)Tab.1 The effect of Tan ⅡA on liver index in mice (Mean±SD, n=10)

    與正常組比較:##P<0.01;與CCl4組比較:**P<0.01。##P<0.01 νs Control group;**P<0.01 vs CCl4 group.

    2.2 Tan ⅡA 對CCl4誘導的急性肝損傷小鼠血清AST和ALT 活性的影響

    與正常組比較,CCl4組小鼠血清中AST 和ALT活性顯著升高(圖1,P<0.01),而Tan ⅡA 使其升高的AST、ALT 活性降低(圖1A,P<0.01;圖1B,P<0.05),說明Tan ⅡA 對CCl4誘導的小鼠急性肝損傷有一定的保護作用。

    圖1 Tan ⅡA 對小鼠血清AST 和ALT 活性的影響A:小鼠血清AST 活性B:小鼠血清ALT 活性 與正常組比較:## P<0.01;與CCl4 組比較:*P<0.05,** P<0.01(圖2,圖4A,圖5A 同)Fig.1 The effect of Tan ⅡA on serum AST and ALT activities in miceA: The activity of serum AST; B: The activity of serum ALT;##P<0.01 vs control group;*P<0.05,**P<0.01 vs CCl4 group (Fig.2,Fig.4A,Fig.5A are the same)

    2.3 Tan ⅡA 對CCl4 誘導的急性肝損傷小鼠肝組織SOD 活性及GSH、MDA 含量的影響

    與正常組比較,經CCl4誘導后的急性肝損傷小鼠肝臟脂質過氧化副產物MDA 含量顯著增加(圖2A,P<0.01),抗氧化劑SOD 活性與GSH 含量明顯降低(圖2B 和2C,P<0.01)。與CCl4組比較,Tan ⅡA 保護組將升高的MDA 含量降低(圖2A,P<0.05),并使降低的SOD 活性與GSH 含量升高(圖2B,P<0.01;圖2C,P<0.05)。這些結果提示Tan ⅡA 可能提高了肝臟的抗氧化能力,具有抗肝細胞脂質過氧化的作用。

    圖2 Tan ⅡA 對小鼠肝組織SOD 活性及GSH、MDA 含量的影響A:小鼠肝組織MDA 含量B:小鼠肝組織SOD 活性C:小鼠肝組織GSH 含量Fig.2 The effect of Tan ⅡA on SOD activity and GSH and MDA content in liver tissue in miceA:The content of MDA in liver tissue; B: The activity of SOD in liver tissue; C: The content of GSH in liver tissue

    2.4 Tan ⅡA 對CCl4誘導的急性肝損傷小鼠肝組織病理學的影響

    光鏡下觀察到,正常組小鼠肝小葉結構完整,肝細胞排列整齊,呈索狀,以中央靜脈為中心呈放射狀向四周排列,無變性壞死,無炎性細胞浸潤(圖3A)。CCl4組小鼠部分肝小葉結構破壞,肝索排列紊亂,有明顯的以氣球樣變和脂肪變性為特征的肝細胞變性,炎性細胞浸潤,枯否細胞增生(圖3B)。Tan ⅡA 保護組較CCl4組而言,肝小葉結構基本恢復正常,肝細胞脂肪變性程度有所緩解,病理損傷程度明顯改善(圖3C)。

    圖3 Tan ⅡA 對小鼠肝組織病理學的影響(HE:×200) A:正常組小鼠;B:CCl4組小鼠;C:Tan ⅡA 保護組小鼠Fig.3 The effect of Tan ⅡA on pathological changes of liver tissue in mice (HE:×200)A: Control group; B: CCl4 group; C:Tan ⅡA group

    2.5 Tan ⅡA 對PI3K/Akt 信號通路的影響

    與正常組比較,CCl4誘導后p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達水平明顯降低。而經Tan ⅡA 處理后,二者的表達水平顯著升高(圖4A,P<0.01)。上述證據表明TanⅡA 在對CCl4誘導的小鼠急性肝損傷中影響了PI3K 和Akt 的磷酸化。免疫組化結果與Western bolt 結果一致,急性肝損傷小鼠給予Tan ⅡA 處理后,p-PI3K 與p-Akt 的蛋白表達水平均恢復正常(圖4B 和4C)。

    圖4 Tan ⅡA 對PI3K/Akt 信號通路的影響A:Western blot 檢測小鼠肝組織p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt 蛋白表達水平B~C:免疫組化(×200) 檢測小鼠肝組織p-PI3K(B)、p-Akt(C)蛋白表達水平Fig.4 The effect of Tan ⅡA on PI3K/Akt signaling pathwayA: The expression levels of p-PI3K,PI3K,p-Akt and Akt proteins in liver tissue detected by Western blot; B~C: The expression levels of p-PI3K (B) and p-Akt (C) proteins in liver tissue detectd by immunohistochemistry (×200)

    2.6 Tan ⅡA 對Nrf2/HO-1 信號通路的影響

    與正常組比較,CCl4組Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平明顯降低。Tan ⅡA 處理后,Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平顯著上升(圖5A,P<0.01)。因此,Tan ⅡA 可能是通過激活急性肝損傷小鼠的Nrf2/HO-1 信號通路來發(fā)揮其抗氧化、保肝作用。同時免疫組化結果顯示,在正常組和Tan ⅡA 保護組的中央靜脈周圍存在大量活化的Nrf2 和HO-1 蛋白(圖5B 和5C)。

    圖5 Tan ⅡA 對Nrf2/HO-1 信號通路的影響A:Western blot 檢測小鼠肝組織Nrf2、HO-1 蛋白表達水平B~C:免疫組化(×200)檢測小鼠肝組織Nrf2(B)、HO-1(C)蛋白表達水平(×200)Fig.5 The effect of Tan ⅡA on Nrf2/HO-1 signaling pathwayA: The expression levels of Nrf2 and HO-1 proteins in liver tissue detected by Western blot;B~C: The expression levels of Nrf2 (B) and HO-1 (C)proteins in liver tissue detectd by immunohistochemistry (×200)

    3 討論

    肝臟是機體內具有代謝、儲存、分泌、解毒等多功能的重要臟器,多種因素均可能導致急慢性肝臟損傷。ALI 的發(fā)病機制與氧化應激、炎癥反應等關系十分密切,其會導致肝細胞損傷或壞死,進而出現肝功能異常[9]。多數急性肝損傷患者的血清AST、ALT 活性以及肝組織氧化指標等都會在短時間內出現明顯的異常變化。

    CCl4作為典型的致肝毒性物質,被廣泛用于建立肝臟中毒模型。影響其肝毒性的因素主要包括染毒的劑量以及持續(xù)接觸的時間。肝毒性刺激會導致肝細胞出現脂質過氧化、鈣離子失衡等病理變化,長期染毒會使肝臟發(fā)生脂肪病變、纖維化甚至肝癌[10]。本研究中,小鼠經CCl4造模后:①肝臟指數升高,間接反映肝臟結構和功能受損;②血清AST、ALT 活性上升,表明炎癥引起肝細胞膜通透性增加,AST、ALT 進入血漿;③肝組織SOD 活性降低,表示抗氧化酶被抑制,GSH 表現為非酶性小分子抗氧化劑的作用,其含量的下降表明肝組織氧化平衡被破壞,而MDA 是氧化損傷的代謝終產物,其含量上升間接反映氧自由基代謝受阻;④肝臟病理學檢查直接觀察到肝組織結構被破壞,炎癥反應明顯。上述結果表明,CCl4成功誘導小鼠急性肝損傷,這與相關報道是一致的[5~7]。

    Tan ⅡA 是丹參干燥根及根莖的一種有效提取物,具有保護血管內皮、抗炎、抗氧化、改善微循環(huán)等作用[8]。本研究結果顯示,Tan ⅡA 給藥后:①使升高的肝臟指數下降,表明小鼠肝臟結構和功能得到了一定程度的恢復;②有效降低了CCl4引起的小鼠血清AST、ALT 活性的升高,提示小鼠急性肝損傷程度有所緩解;③提高了肝組織SOD 活性與GSH 含量,降低了MDA 含量,反映肝組織抗氧化能力有所提高;④肝臟病理學檢查結果得到了明顯改善。上述結果表明,Tan ⅡA 能夠有效地保護CCl4誘導的小鼠急性肝損傷,具有一定的保肝護肝作用。

    PI3K/Akt 與Nrf2/HO-1 通路是機體內兩條重要的信號傳導通路。PI3K 經生長因子、胰島素等受體活化后,產生第二信使PIP3,與細胞內的信號蛋白Akt結合,促進Akt 活化,調節(jié)其下游多種靶基因的表達,包括Bax、Bcl-2、caspase-3/caspase-9、NF-κB 等,從而實現對細胞增殖、分化、凋亡和遷移等功能的調節(jié)作用[11]。而Nrf2/HO-1 信號通路對于消除機體氧化應激至關重要,機體的抗氧化能力可能與Nrf2、HO-1 蛋白的表達水平有關。正常生理情況下,Nrf2 與Keap1 蛋白相結合,在細胞質中呈現無活性狀態(tài),并經由泛素-蛋白酶體系統(tǒng)快速降解;而在氧化應激下,Nrf2 發(fā)生磷酸化,從Keap1 解離并進入細胞核,結合DNA 上的抗氧化反應元件(ARE),誘導一系列細胞保護性基因表達,如抗氧化酶HO-1[12]。已有研究表明,這兩條信號通路在ALI 的發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要作用[11~15]。同時,以前的研究也表明PI3K/Akt 信號通路能夠參與Nrf2 的磷酸化,進而對氧化應激起到保護作用[16,17]。本研究證實,CCl4在誘導ALI 的過程中,抑制了PI3K 和Akt 蛋白的磷酸化,也抑制了Nrf2/HO-1通路的信號傳導。而Tan ⅡA 能夠有效激活PI3K/Akt信號通路,誘導Nrf2 轉位入核,上調HO-1 蛋白表達,從而緩解氧化應激。

    綜上所述,Tan ⅡA 可能通過PI3K/Akt/Nrf2/HO-1信號通路保護CCl4所引起的ALI,本研究結果為深入探究Tan ⅡA 防治ALI 的作用機制提供了一定的實驗依據。

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