果實(shí)表面蠟質(zhì)合成及乙烯和APETALA2/乙烯響應(yīng)因子調(diào)控作用的研究進(jìn)展

李 丹，關(guān)軍鋒，韓亞楠

（1.邯鄲學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，河北 邯鄲 056000；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)與食品科學(xué)研究所，河北 石家莊 050051；3.河北師范大學(xué)分析測(cè)試中心，河北 石家莊 050024）

蠟質(zhì)存在于果實(shí)表面，具有防止果實(shí)開裂、抵抗病蟲害和病原菌對(duì)果實(shí)的侵害、決定果實(shí)色澤質(zhì)地、延緩果實(shí)營(yíng)養(yǎng)成分和水分流失等功效。蠟質(zhì)組分烷烴和脂肪醛（碳鏈長(zhǎng)度≥20）的積累可以延緩棗果實(shí)的開裂[1]。綠檸檬果實(shí)油斑病的發(fā)生與蠟質(zhì)組分脂肪酸（C16、C18）和脂肪醛含量的下降有關(guān)[2]。研究表明果實(shí)蠟質(zhì)、角質(zhì)、木質(zhì)素及果皮三萜類物質(zhì)含量變化是造成‘碭山酥梨’和其突變體‘新秀梨’果皮顏色、質(zhì)地、果點(diǎn)和外表皮結(jié)構(gòu)差別以及‘Cox Orange Pippin’蘋果果皮棕褐色的原因[3-4]。據(jù)報(bào)道蘋果蠟質(zhì)組分酯質(zhì)和脂肪酸含量的升高會(huì)造成果皮油膩的發(fā)生，降低果實(shí)感官品質(zhì)[5-6]。另外去除藍(lán)莓果面白色蠟質(zhì)易引起果實(shí)軟化、腐爛及營(yíng)養(yǎng)成分如花青苷等的損失[7]。因此研究果實(shí)蠟質(zhì)合成及其調(diào)控對(duì)于提高果實(shí)品質(zhì)和延長(zhǎng)其貨架期具有重要意義。

目前對(duì)于園藝作物果實(shí)蠟質(zhì)的研究多集中于采收和貯藏階段[7-9]，并著眼于蠟質(zhì)合成代謝和轉(zhuǎn)錄調(diào)控兩方面。乙烯具有調(diào)控果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育、成熟衰老以及品質(zhì)形成的作用，但其對(duì)果實(shí)蠟質(zhì)合成的調(diào)控還鮮有報(bào)道。本綜述將從果實(shí)蠟質(zhì)的合成和調(diào)控機(jī)理，乙烯如何調(diào)節(jié)園藝作物蠟質(zhì)合成及APETALA2/乙烯響應(yīng)因子（APETALA2/ethylene-responsive factors，AP2/ERFs）如何調(diào)節(jié)模式植物、農(nóng)作物和園藝作物果實(shí)蠟質(zhì)合成這3個(gè)方面進(jìn)行介紹。

1 果實(shí)蠟質(zhì)的合成和調(diào)控

模式植物擬南芥蠟質(zhì)組成及其合成途徑目前已被研究的較為清楚，但果實(shí)蠟質(zhì)合成的途徑尚不明確。擬南芥蠟質(zhì)由超長(zhǎng)鏈脂肪酸（very-long-chain fatty acids，VLCFAs）和其衍生物，以及次生代謝產(chǎn)物萜類、甾醇類和黃酮類等組成，它們組裝成外層蠟質(zhì)晶體、蠟質(zhì)膜和無定形態(tài)鑲嵌于角質(zhì)層的內(nèi)層蠟質(zhì)（圖1）[10-11]。蘋果、梨、藍(lán)莓、番茄、葡萄等果實(shí)表面的蠟質(zhì)組成與擬南芥蠟質(zhì)組分相似，分別由脂肪酸、烷烴、脂肪醛、脂肪醇、酮和酯質(zhì)等構(gòu)成[12-16]。據(jù)此推測(cè)相同的蠟質(zhì)組成可能具有相似的合成途徑。因此篩選和鑒定參與果實(shí)蠟質(zhì)合成的功能基因，對(duì)驗(yàn)證上述猜測(cè)具有重要意義。近幾年研究不同果實(shí)蠟質(zhì)合成規(guī)律時(shí)發(fā)現(xiàn)了一些蠟質(zhì)合成基因：如梨PbLACS1、PbKCS6/KCS9/KCS20KCS2、PbFDH、PbABCG11、PbABCG12、PbLTPG1、PbLTP3和PbLTP4等；蘋果MdCER1、MdCER4、MdCER10、MdLACS2、MdKCS7/2、MdFDH、MdPAS2、MdWBC1和MdLTPG1等；以及番茄SlCER6[16-19]。這些果實(shí)蠟質(zhì)合成基因的鑒定為驗(yàn)證果實(shí)與擬南芥蠟質(zhì)合成途徑的相似性提供了新的證據(jù)。

圖1 植物器官表面蠟質(zhì)合成途徑[10]Fig. 1 Wax synthesis pathway on surface of plant organs[10]

1.1 果實(shí)蠟質(zhì)的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)

蠟質(zhì)合成底物脂肪酸C16:0和C18:0在LACS作用下合成C16-?；?輔酶A或C18-?；?輔酶A，它們進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在FAE催化下生成碳鏈長(zhǎng)度介于C20～C36的VLCFAs（圖1）[10]。FAE包含4種酶：KCS、KCR、HCD、ECR，其中KCS是決定VLCFAs碳鏈長(zhǎng)度的限速酶（圖1）[10,20-21]。VLCFAs經(jīng)過脂肪醇和烷烴合成通路生成其衍生物：脂肪醛、烷烴、脂肪醇、酮和酯質(zhì)等，其中CER1和CER3分別編碼脂肪醛和烷烴合成酶；而CER4/FAR、WSD1和MAH1則依次編碼脂肪醇、酯質(zhì)和酮合成酶（圖1）[10,22]。

除上述脂肪族蠟質(zhì)組分外，三萜類也是果實(shí)蠟質(zhì)重要的次生代謝產(chǎn)物，它的合成包含甲羥戊酸（mevalonate，MVA）途徑和甲基赤蘚糖醇-4-磷酸（2-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP）途徑[23]。其中MVA途徑包含3個(gè)階段：第1階段是前體異戊烯基焦磷酸（isopentenylallyl pyrophosphate，IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP）的合成；第2階段是2,3-環(huán)氧角鯊烯的合成；第3階段是將2,3-環(huán)氧角鯊烯環(huán)化成各種C30三萜骨架并完成結(jié)構(gòu)修飾。參與第3階段反應(yīng)的酶包括氧化鯊烯環(huán)化酶（oxidized squalene cyclase，OSC）和細(xì)胞色素P450單加氧酶（C28位氧化酶）、甲基轉(zhuǎn)移酶和脫氫酶等修飾酶[11]。

植物中發(fā)現(xiàn)約100種OSCs[11]。如圖2所示，蘋果MdOSC1和MdOSC3編碼的酶屬于多功能OSCs，均能催化底物合成α-香樹酯醇、β-香樹酯醇和羽扇豆醇。MdOSC4和MdOSC5參與合成β-香樹酯醇和羽扇豆醇，且MdOSC4編碼的酶也能催化底物合成日耳曼醇。植物中細(xì)胞色素P450單加氧酶成員CYP716A的主要功能是氧化三萜骨架上的C28位點(diǎn)，合成三萜酸，其中蒺藜苜蓿CYP716A12是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的家族成員，其將β-香樹酯醇氧化為齊墩果酸。另外在果實(shí)中也篩選出一些CYP716A成員，如葡萄CYP716A15和CYP716A17均可將β-香樹酯醇氧化成齊墩果酸，而葡萄CYP716A15也能將α-香樹酯醇和羽扇豆醇氧化成熊果酸和白樺脂酸。番茄CYP716A44和CYP716A46可將α-香樹酯醇、β-香樹酯醇氧化成熊果酸和齊墩果酸[24]。蘋果MdCYP716A175將MdOSC1/3/4/5編碼酶催化合成的α-香樹酯醇、β-香樹酯醇、羽扇豆醇和日耳曼醇進(jìn)行氧化修飾，合成熊果酸、齊墩果酸、白樺脂酸和摸繞酸[11]。

圖2 蘋果果實(shí)蠟質(zhì)組分合成途徑[11]Fig. 2 Synthesis pathway of wax components in apple fruits[11]

通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜與細(xì)胞膜結(jié)合或者高爾基體形成囊泡2種運(yùn)輸方式將VLCFAs及其衍生物以及三萜類等次生代謝產(chǎn)物分泌到細(xì)胞膜上，再由ABCG將其轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)外體，接著由脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（lipid transporter protein，LTP）負(fù)責(zé)將其運(yùn)輸?shù)焦麑?shí)表面，完成蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)的裝配[10-11]（圖1、2）。

1.2 果實(shí)蠟質(zhì)功能及合成結(jié)構(gòu)基因的研究

在蘋果、梨、柑橘、臍橙、桃和番茄等果實(shí)中可調(diào)控蠟質(zhì)合成的蠟質(zhì)合成酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼的基因被稱為蠟質(zhì)合成結(jié)構(gòu)基因。例如，蘋果MdLACS2基因不僅能提高蘋果抗旱能力，使果面光滑，改善蘋果品質(zhì)，而且為蘋果分子育種或者砧木選擇提供了候選基因[25]。異源過表達(dá)MdCER1和MdCER2降低了轉(zhuǎn)基因擬南芥株系對(duì)脫落酸（abscisic acid，ABA）敏感性，葉片和莖表面蠟質(zhì)積累增多，葉片保水和抗旱能力增強(qiáng)[26]。蘋果MdKCS1在轉(zhuǎn)錄因子MdMYB30的調(diào)控下表達(dá)，可以提高蘋果愈傷組織的蠟質(zhì)含量和抵御斑點(diǎn)葡萄球菌侵染的能力[27]。研究低溫、3種活性因子以及乙烯利對(duì)幾種梨果實(shí)蠟質(zhì)代謝的影響，通過同源序列比對(duì)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析鑒定出與蠟質(zhì)合成、分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因包括PbMAH1、PbKCS9/KCS20、PbCER60、PbDGAT1、PbFDH1和PbLTP4/LTPG1/CER5/WBC11等[19,28]。

進(jìn)化分析篩選出的柑橘基因CsKCS2和CsKCS11在果實(shí)成熟期的果皮中表達(dá)量較高，在擬南芥中過表達(dá)CsKCS2和CsKCS11可增加葉片的蠟質(zhì)積累[29]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)合熒光定量鑒定出多個(gè)參與發(fā)育期‘紐荷爾’臍橙果實(shí)蠟質(zhì)合成的關(guān)鍵基因（如CsACC1、CsCAC3、CsLACS1/LACS2/LACS4、CsKCS6/CER6/KCS10/KCS9/KCS11、CsCER1、CsCER2、CsCER3、CsCER10、CsCER4、CsFAR2和CsABCG11等）[30]。

在ABA誘導(dǎo)下，番茄SlCER6受轉(zhuǎn)錄因子SlMYB31的調(diào)控并表達(dá)，它們共同作用促進(jìn)番茄果實(shí)蠟質(zhì)的合成[16]。在‘October Sun’桃果實(shí)中也相繼篩選出3個(gè)蠟質(zhì)合成酶基因（PpCER1、PpLACS1和PpLipase）[31]。從越橘蠟質(zhì)缺失突變體GT和患油斑病的綠檸檬中依次鑒定出與果實(shí)蠟質(zhì)組分脂肪酸和酮類合成相關(guān)的一系列基因FabZ、FAD2、SAD6、CER26-like、FAR2、CER3-like、LTP、MIXTA和BAS等[2,32]。另外研究發(fā)現(xiàn)黃瓜基因CER4和CER7調(diào)控果實(shí)蠟質(zhì)合成，以應(yīng)對(duì)干旱脅迫，使果實(shí)順利完成受精并防止器官融合[33]。

以上多數(shù)研究只對(duì)果實(shí)蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)基因完成了初篩，基因功能驗(yàn)證研究較少，且目前已知果實(shí)中相關(guān)基因的數(shù)量遠(yuǎn)少于模式植物，有待進(jìn)一步的鑒定和驗(yàn)證。

1.3 果實(shí)等植物器官中蠟質(zhì)合成的調(diào)控

果實(shí)等植物器官中蠟質(zhì)的合成和積累受到環(huán)境因素（如溫度、光照、濕度和病原微生物等）和遺傳特征的共同影響[34-35]。首先熱處理和低溫分別改變了‘Golden Delicious’蘋果果實(shí)和鹽芥葉片的蠟質(zhì)組分比例和晶體結(jié)構(gòu)[36-37]。光照引起擬南芥AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子DEWAX與SPL9（SQUAMOSA promoter binding protein-like 9）結(jié)合，共同作用抑制葉片和莖組織中烷烴和脂肪醇合成酶基因CER1和CER4的表達(dá)[38]。蘋果果實(shí)蠟質(zhì)的積累可以提高其對(duì)病原菌侵害的抵抗力[11]。ABA響應(yīng)干旱脅迫，轉(zhuǎn)錄因子MYB96結(jié)合在KCS啟動(dòng)子區(qū)啟動(dòng)其表達(dá)，這促進(jìn)了擬南芥葉片蠟質(zhì)的積累[39]，另外ABA也能直接調(diào)控成熟櫻桃果實(shí)蠟質(zhì)組分奇數(shù)碳烷烴和C18脂肪酸含量的增加[40]；但ABA缺乏會(huì)引起甜橙果實(shí)蠟質(zhì)晶體和代謝的改變從而導(dǎo)致成熟期果皮滲透率的增加[41]。乙烯、茉莉酸甲酯、棕櫚酸和已二酸均對(duì)不同品種梨果實(shí)蠟質(zhì)積累有不同程度的促進(jìn)作用[28]。

對(duì)果實(shí)等植物器官蠟質(zhì)積累的調(diào)控包括3種方式：轉(zhuǎn)錄調(diào)控、翻譯調(diào)控和翻譯后調(diào)控。轉(zhuǎn)錄調(diào)控主要的轉(zhuǎn)錄因子有AP2/ERF型、MYB型和HD-ZIP IV型[42]。柑橘基因CsMYB30的異源表達(dá)可以提高擬南芥葉片蠟質(zhì)含量并改變蠟質(zhì)組分比例和晶體結(jié)構(gòu)，使植株對(duì)ABA和干旱的敏感性降低[43]。ABA通過調(diào)控MYB轉(zhuǎn)錄因子GL1的表達(dá)來增加發(fā)育期柑橘果實(shí)蠟質(zhì)含量，并促進(jìn)果實(shí)成熟[44]。蘋果的果銹病由果實(shí)蠟質(zhì)合成代謝紊亂引起，這與果皮中MdSHN3轉(zhuǎn)錄本的降低有關(guān)[45]。除上述轉(zhuǎn)錄調(diào)控外，翻譯和翻譯后調(diào)控在蠟質(zhì)合成調(diào)控研究中也曾有報(bào)道。E3連接酶DHS（DROUGHT HYPERSENSITIVE）泛素化降解HD-ZIP IV型轉(zhuǎn)錄因子ROC4的表達(dá)，從而削弱水稻葉片蠟質(zhì)的積累[46]。應(yīng)對(duì)高濕環(huán)境時(shí)，Kelch類F-box基因SAGL1（SMALL AND GLOSSY LEAVES1）加速烷烴合成酶編碼基因CER3的降解，從而減少擬南芥葉片組織蠟質(zhì)組分烷烴的積累，增加葉片滲透性[47]。

2 乙烯調(diào)控園藝作物果實(shí)蠟質(zhì)合成

乙烯調(diào)控果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育并響應(yīng)各種環(huán)境因子來調(diào)控果實(shí)品質(zhì)形成和貨架期品質(zhì)劣變，其中次生代謝物蠟質(zhì)具有防止果實(shí)開裂、失水、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失、果皮油膩、抵御病原菌侵害和UV-C輻射等重要作用[48]。因此從果實(shí)品質(zhì)形成、延緩品質(zhì)劣變和開發(fā)果品貯藏保鮮新技術(shù)的角度考慮，探究乙烯與果實(shí)蠟質(zhì)合成的調(diào)控關(guān)系就顯得尤為重要。

2.1 乙烯調(diào)控蘋果果實(shí)蠟質(zhì)的合成

研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期低溫貯藏時(shí)，乙烯加速蠟質(zhì)晶體的融化和果實(shí)衰老，可能通過上調(diào)基因MdCER6、MdCER4和MdWSD1的表達(dá)加速蠟質(zhì)組分VLCFAs及后續(xù)衍生物脂肪醇和烷烴的合成，進(jìn)而改變蘋果品質(zhì)[5,49]。與之相反的是，乙烯抑制劑1-甲基環(huán)丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）結(jié)合氣調(diào)處理延緩了‘新紅星’‘紅富士’‘Royal Gala’等蘋果蠟質(zhì)中C16烷酸、C18:2烯酸、C28烷酸、C29脂肪醇、C18?；?丁醇酯、C18酰基-己醇酯等物質(zhì)的積累，降低奇數(shù)碳烴類物質(zhì)（如C27烷烴、C29烷烴和C29烯烴）含量，同時(shí)延緩‘Royal Gala’蘋果蠟質(zhì)晶體含量增多和體積增大的進(jìn)程，使蠟質(zhì)分布不均勻，加速果面微裂紋的形成，但提高了果實(shí)可滴定酸和可溶性糖的含量[49-51]。綜上說明乙烯促進(jìn)果實(shí)蠟質(zhì)組分、蠟質(zhì)晶體含量和形態(tài)的改變，而1-MCP的作用相反，進(jìn)而影響果實(shí)品質(zhì)和衰老進(jìn)程。另外，采后貯藏階段蘋果蠟質(zhì)中脂肪酸（尤其是C16和C18）和酯類物質(zhì)含量上升，乙烯處理蘋果后釋放的香氣物質(zhì)為己醇和己醇酯（己醇與C18:1和C18:2酯化合成），推測(cè)乙烯調(diào)控果實(shí)成熟和衰老進(jìn)程與果實(shí)蠟質(zhì)改變及香氣物質(zhì)的釋放可能具有協(xié)同作用[52]。

一些品種蘋果貯藏時(shí)易出現(xiàn)果皮油膩問題。與抗油膩品種‘Red Delicious’相比，‘Jonagold’和‘Cripps Pink’更容易發(fā)生果皮油膩，這與果實(shí)蠟質(zhì)組分中C18:1烯酸與短鏈醇、法尼醇合成酯類物質(zhì)的含量增加有關(guān)，酯類物質(zhì)可溶解蠟質(zhì)晶體[53]。易油膩品種‘Royal Gala’的研究結(jié)果表明，除蠟質(zhì)組分改變外，3種烯酸（C18:1、C18:2和C18:3）與法尼醇合成的酯質(zhì)以及C29脂肪醇的含量均升高[54-55]。推測(cè)以上蠟質(zhì)變化可能與采后蘋果果實(shí)內(nèi)源乙烯含量升高有關(guān)，內(nèi)源乙烯釋放對(duì)一些品種蘋果蠟質(zhì)組分尤其是脂肪酸含量的升高有明顯促進(jìn)作用[56]。1-MCP對(duì)常溫貯藏蘋果蠟質(zhì)合成代謝影響的研究結(jié)果表明，1-MCP可能通過降低脂肪酸和酯質(zhì)合成酶基因KASII、KASIII、KASI、CAC1、CAC3、SAD6和FAD2等的表達(dá)來降低3種脂肪酸（C16:0、C18:1和C18:2）以及這些脂肪酸與C3～C5短鏈醇合成的酯類物質(zhì)（共12種組分）含量，以減緩蠟質(zhì)晶體的溶解速率，最終延緩果皮油膩進(jìn)程[57]。1-MCP結(jié)合動(dòng)態(tài)氣調(diào)處理也可以降低‘Maxi Gala’蘋果蠟質(zhì)組分中脂肪酸和C29脂肪醇的含量[58]。這些研究表明不同蘋果品種發(fā)生的果皮油膩現(xiàn)象與果實(shí)蠟質(zhì)改變有關(guān)，乙烯加速果實(shí)蠟質(zhì)組分含量的改變及蠟質(zhì)晶體溶解的速率，進(jìn)而引發(fā)蘋果果皮油膩。

2.2 乙烯調(diào)控梨果實(shí)蠟質(zhì)的合成

據(jù)報(bào)道乙烯利處理可以提高常溫貯藏梨果實(shí)（‘豐水梨’‘翠冠梨’‘玉露香梨’）的蠟質(zhì)含量[28]。另外乙烯促進(jìn)‘庫爾勒香梨’和‘蘋果梨’果實(shí)蠟質(zhì)中萜類、烯烴等組分和總蠟質(zhì)含量的增加，但減少了蠟質(zhì)組分的種類，加速了果實(shí)軟化[59-62]，而乙烯抑制劑1-MCP能保持蠟質(zhì)組分的多樣性并對(duì)蠟質(zhì)含量無明顯影響，1-MCP延緩C29烷烴、C27烷烴（果實(shí)失水相關(guān)成分）含量的下降，以及棕櫚酸、反油酸、順-11-二十烯酸和C29脂肪醇等組分含量的上升，起到保鮮效果[59-62]。筆者課題組前期研究1-MCP對(duì)低溫貯藏‘紅香酥梨’果實(shí)蠟質(zhì)影響發(fā)現(xiàn)，1-MCP可能通過抑制乙烯信號(hào)感知和傳遞，降低13個(gè)蠟質(zhì)合成結(jié)構(gòu)基因（LACS1、LACS2、KCS2、KCS9、KCS20、FDH、CER6、CER10、LTPG1、LTP3、LTP4、ABCG11和ABCG12）的表達(dá)，進(jìn)而降低‘紅香酥梨’果實(shí)總蠟質(zhì)含量，延緩蠟質(zhì)晶體體積增大、融化和瓦解過程，起到抑制衰老的作用[18]。以上研究表明，盡管貯藏條件和果實(shí)品種不同會(huì)造成乙烯對(duì)果實(shí)蠟質(zhì)影響的差別，但總體依然呈現(xiàn)乙烯抑制劑1-MCP通過抑制信號(hào)傳遞來延緩果實(shí)蠟質(zhì)組分種類多樣性的降低以及蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而保持果實(shí)優(yōu)良品質(zhì)。

2.3 乙烯調(diào)控其他果實(shí)蠟質(zhì)的合成

研究發(fā)現(xiàn)乙烯處理會(huì)引起臍橙總蠟質(zhì)含量的增加，合成新的蠟質(zhì)組分，改變果實(shí)蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)，組裝后的蠟質(zhì)晶體附著于果實(shí)表面并隱藏裂紋和氣孔，減少果實(shí)失水、果皮凹陷和果皮無法著色等品質(zhì)劣變問題，增強(qiáng)臍橙對(duì)假絲酵母菌侵染的抗病能力[63-64]。在適宜濃度條件下，乙烯促進(jìn)柑橘果實(shí)蠟質(zhì)苯乙醇和法尼醇的生成，卻阻礙三萜類化合物的積累；隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，蠟質(zhì)中醇類、角鯊烯和木質(zhì)纖維酸的含量減少，而谷甾醇、法尼醇和C22烷烴的含量增加，通過表皮蠟的變化使果實(shí)保持較高質(zhì)量[65]。這些研究表明乙烯改變園藝作物果實(shí)的品質(zhì)可能通過調(diào)控果實(shí)蠟質(zhì)的合成來實(shí)現(xiàn)。

3 AP2/ERF調(diào)控模式植物、農(nóng)作物和園藝作物果實(shí)蠟質(zhì)的合成

3.1 AP2/ERF家族簡(jiǎn)介

AP2/ERF家族具有60～70個(gè)保守氨基酸組成的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，基于保守結(jié)構(gòu)域的個(gè)數(shù)可將其分為AP2、ERF、RAV亞族，其中AP2亞族包含2個(gè)AP2/ERF保守域，ERF亞族僅包含1個(gè)AP2/ERF保守域，而RAV亞族包含1個(gè)AP2/ERF保守域和1個(gè)B3保守域[66]。AP2亞族調(diào)控植物器官生長(zhǎng)發(fā)育，如花的發(fā)育以及籽粒大小等。ERF亞族主要由CBF/DREB和ERF兩種成員構(gòu)成，其中ERF成員具有GCC-box（AGCCGCC）保守域，可與病程相關(guān)（pathogenesis-related，PR）基因的啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)節(jié)植物抗病響應(yīng)。DREB成員的保守序列CCGAC結(jié)合在順式作用元件上調(diào)控低溫和干旱等非生物響應(yīng)，以及激素ABA和乙烯信號(hào)響應(yīng)。RAV家族也被預(yù)測(cè)能夠響應(yīng)乙烯信號(hào)及生物與非生物脅迫[66-67]。

3.2 植物中AP2/ERF的發(fā)現(xiàn)

通過全基因組測(cè)序以及表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tag，EST）篩選發(fā)現(xiàn)許多植物中存在AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子[67]。其中擬南芥包含122個(gè)ERF亞族、18個(gè)AP2亞族、 6個(gè)RAV亞族，大豆包含98個(gè)ERF亞族、26個(gè) AP2亞族、2個(gè)RAV亞族，水稻包含131個(gè)ERF亞族、26個(gè)AP2亞族、7個(gè)RAV亞族。而園藝作物葡萄包含109個(gè)ERF亞族、18個(gè)AP2亞族、4個(gè)RAV亞族，黃瓜中發(fā)現(xiàn)103個(gè)ERF亞族、20個(gè)AP2亞族、4個(gè)RAV亞族，番茄包含85個(gè)ERF亞族、16個(gè)AP2亞族、3個(gè)RAV亞族，蘋果包含51個(gè)ERF亞族、5個(gè)AP2亞族、2個(gè)RAV亞族，梨包含155個(gè)AP2/ERF亞族、26個(gè)AP2亞族、9個(gè)RAV亞族[66-67]；以上研究結(jié)果表明植物AP2/ERF家族中ERF亞族的數(shù)量明顯高于AP2和RAV 2個(gè)亞族，目前大多數(shù)成員的功能還未解析。

3.3 植物中AP2/ERF的功能

以下從參與激素調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的過程、應(yīng)對(duì)非生物脅迫、應(yīng)對(duì)生物脅迫及對(duì)各種代謝物合成的調(diào)節(jié)4 方面闡述AP2/ERF因子的功能：1）AP2/ERF因子參與調(diào)控花器官生長(zhǎng)發(fā)育及花器官衰老、小穗分生組織發(fā)育、根發(fā)生和發(fā)育、葉面積大小及種子發(fā)育、果實(shí)成熟和種子形成等過程；2）AP2/ERF因子響應(yīng)植物非生物脅迫，如擬南芥基因CBF1/CBF2/CBF3/CBF4、DREB2A/DREB2C、RAP2.2和ERF71分別參與低溫、干旱、高鹽和缺氧等脅迫響應(yīng)，水稻基因OsDREB1A、OsERF71、OsERF101和OsDREB響應(yīng)干旱、高鹽和低溫脅迫；3）AP2/ERF提高植物抵抗病毒、細(xì)菌和病蟲害的能力。過表達(dá)大豆GmERF5/ERF113/ERF3和水稻OsRap2.6或者沉默表達(dá)水稻OsERF922均能激活病程基因PR和PAL等的表達(dá)，提高植物對(duì)大豆疫霉菌侵染和水稻稻瘟病的抗性；4）AP2/ERF參與青蒿素、萜類吲哚生物堿、丹參酮、酯質(zhì)和蠟質(zhì)的生物合成[66-67]。目前植物中篩選和鑒定功能的AP2/ERF因子主要參與植物發(fā)育和脅迫響應(yīng)，而對(duì)于調(diào)控生物活性物質(zhì)合成的基因的功能解析還比較少，尤其是鑒定出功能的調(diào)控園藝作物蠟質(zhì)合成的AP2/ERF因子的數(shù)量仍十分有限。

3.4 AP2/ERF調(diào)控模式植物、農(nóng)作物和園藝作物果實(shí)蠟質(zhì)的合成

模式植物和一些農(nóng)作物中已鑒定出許多調(diào)控蠟質(zhì)合成的AP2/ERF因子，這為園藝作物果實(shí)中篩選具有類似功能的AP2/ERF因子提供了豐富的同源序列信息。擬南芥基因AtDEWAX和AtDEWAX2作為負(fù)調(diào)節(jié)因子參與調(diào)控黑暗和光照周期中莖葉組織總蠟質(zhì)的積累，另外葉片中AtDEWAX的表達(dá)量高于莖組織，說明它介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制可能參與植物表面蠟質(zhì)積累的器官特異性調(diào)節(jié)，它們受黑暗誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)合于蠟質(zhì)合成酶基因CER1、KCS12、LACS2/LACS1、ECR和FAR6的啟動(dòng)子區(qū)來抑制上述基因的表達(dá)，從而減少黑暗環(huán)境下莖葉組織的蠟質(zhì)沉積[68-69]。油莎草CeWRI4-like可能通過促進(jìn)葉片表皮蠟的生物合成和沉積來提高擬南芥的耐旱性[70]。擬南芥AtWRI4直接結(jié)合于蠟質(zhì)合成基因LACS1、PAS2、ECR和WSD1的啟動(dòng)子區(qū)啟動(dòng)它們的表達(dá)，然而AtWRI4缺失會(huì)引起莖表面蠟質(zhì)組分C29烷烴含量和蠟質(zhì)晶體數(shù)量的顯著下降[71]。另外AtWRI1調(diào)控種子表面蠟質(zhì)組分的積累，而AtWRI3為花器官角質(zhì)合成提供前體，以防止發(fā)育器官黏合造成不育現(xiàn)象[72-73]。苜蓿WXP1和WXP2能增加擬南芥葉片中正構(gòu)烷烴等主要蠟質(zhì)組分的積累并提高其抗旱性，但與WXP2相比，苜蓿WXP1還能提高擬南芥和苜蓿的抗凍性，增加葉片中C30脂肪醇等蠟質(zhì)組分的含量[74-75]。作為改善植物應(yīng)對(duì)熱激、干旱和高鹽等非生物脅迫耐受性的重要候選基因，過表達(dá)大麥HvSHN1可以上調(diào)煙草葉片中蠟質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)[76]。擬南芥AtWIN1、水稻OsWR1、大豆GmSHN1和GmSHN9、甘藍(lán)BnWIN1的過表達(dá)使植株葉片中蠟質(zhì)合成基因KCS1、CER2、CER1、LACS2、FAE-1、BCCP1和DGAT2轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)升高，進(jìn)而使C29烷烴和C31烷烴等主要蠟質(zhì)組分含量明顯升高，最終增強(qiáng)植株的抗逆能力[77-80]。相反，沉默表達(dá)大麥HvWIN1基因使大麥小穗易受鐮刀菌侵染，這與花序中蠟質(zhì)組分C18:2烯酸和C16:0烷酸含量的降低有關(guān)[81]。

目前已篩選出具有調(diào)控果實(shí)蠟質(zhì)合成功能的此類轉(zhuǎn)錄因子。如研究蘋果果實(shí)中轉(zhuǎn)錄因子MdWRI4[82]和MdSHINE2[83]（與擬南芥AtSHINE2同源）調(diào)控環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)的潛在途徑發(fā)現(xiàn)，它們的過表達(dá)使擬南芥莖葉表皮的滲透率和器官失水率顯著下降，幼苗對(duì)ABA的敏感性降低，植物對(duì)干旱和鹽分等脅迫的耐受性增強(qiáng)，這與植物莖葉器官蠟質(zhì)含量和蠟質(zhì)晶體數(shù)量的增加有關(guān)[82-83]。對(duì)番木瓜兩個(gè)品種抗旱能力的研究表明，耐旱強(qiáng)的果實(shí)品種中CpSHN1和CpSHN2的表達(dá)量更高，進(jìn)而迅速上調(diào)脅迫耐受基因的表達(dá)，使果實(shí)表面積累更多蠟質(zhì)，因此它們可作為培育優(yōu)良耐旱品種的候選基因[84]。在模式作物番茄中過表達(dá)SlSHN1使莖葉組織中部分蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄本升高，這引起莖葉器官蠟質(zhì)的沉積，使其呈現(xiàn)深綠色，另外植株保水和抗寒能力也明顯增強(qiáng)[85]。海棠果實(shí)McWRI1基因的功能研究表明，McWRI1能激活蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)基因McKCS、McLACS和McWAX的啟動(dòng)子區(qū)來調(diào)控上述基因的表達(dá)，并增加海棠果實(shí)中烷烴等蠟質(zhì)組分的積累，延長(zhǎng)果實(shí)貨架期和新鮮度[86]。在果實(shí)中調(diào)控蠟質(zhì)合成的AP2/ERF因子主要響應(yīng)低溫、干旱和ABA等的誘導(dǎo)，但對(duì)乙烯的響應(yīng)研究卻很少，還有待進(jìn)一步分析，這將為完善果實(shí)蠟質(zhì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供參考。

4 結(jié) 語

不同種類果實(shí)蠟質(zhì)組分種類和比例不同。盡管園藝作物番茄、蘋果、亞洲梨、殷桃、桃和甜椒果面蠟質(zhì)主要由烷烴和三萜類物質(zhì)構(gòu)成，但除上述兩種組分外，一些梨品種果實(shí)蠟質(zhì)組分富含初級(jí)醇和生育酚等組分[15,19]；李子和一些蘋果品種果實(shí)蠟質(zhì)含有較高含量的次生醇[53,87]；番茄果實(shí)蠟質(zhì)含有較高含量的多不飽和脂肪族組分（烯烴和烯醇）[88]；黃瓜、蔓越莓和柑橘果實(shí)蠟質(zhì)富含脂肪醛組分[8,89-90]；藍(lán)莓果實(shí)蠟質(zhì)含有豐富的β-雙酮[7,13]。隨著果實(shí)中未知蠟質(zhì)組分分析的深入，果實(shí)蠟質(zhì)合成途徑中相關(guān)酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因?qū)⒅饾u被解析，果實(shí)蠟質(zhì)合成途徑網(wǎng)絡(luò)將進(jìn)一步完善。果實(shí)蠟質(zhì)合成途徑是多基因參與的復(fù)雜調(diào)控過程，蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)基因的發(fā)現(xiàn)為篩選和鑒定蠟質(zhì)合成調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子提供了豐富的靶基因。

果實(shí)蠟質(zhì)的合成和積累受干旱、溫度、濕度和紫外線輻射等非生物脅迫的影響，也受體內(nèi)ABA和乙烯等激素信號(hào)傳遞系統(tǒng)的調(diào)控，因此蠟質(zhì)組分的組成和結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，其中很多轉(zhuǎn)錄因子參與了這一調(diào)控過程，如AP2/ERF、MYB、WRKY、MIXTA和MIXTA-LIKE等，進(jìn)而提高園藝作物耐受各種非生物脅迫的能力，提高果實(shí)產(chǎn)量及其外觀和內(nèi)在品質(zhì)。通過激素（如乙烯）、非生物脅迫因子及兩者的共同作用，篩選出關(guān)鍵的蠟質(zhì)合成調(diào)控因子，定向用于園藝作物優(yōu)良品種選育和果蔬貯運(yùn)保鮮新技術(shù)的開發(fā)。

乙烯是果實(shí)中重要的植物激素，但其調(diào)控蠟質(zhì)合成的信號(hào)系統(tǒng)中下游轉(zhuǎn)錄因子的潛在調(diào)控機(jī)制還不明確，因此需要借助現(xiàn)代分子生物學(xué)和工程技術(shù)手段如代謝組和轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析、酵母單/雙雜交、CRISPR/Cas基因編輯、病毒誘導(dǎo)沉默表達(dá)、凝膠遷移實(shí)驗(yàn)以及熒光素酶報(bào)告基因結(jié)合活體成像檢測(cè)技術(shù)等，深入解析此類轉(zhuǎn)錄因子的功能。