脫氫乙酸鈉抑制指狀青霉的作用機制

譚小麗，龍春燕，李 路，陶能國

（湘潭大學化工學院，湖南 湘潭 411105）

指狀青霉（Penicillium digitatum）引起的綠霉病是全球最棘手和最具破壞性的柑橘病害之一，約占柑橘采后病害的60%～90%[1-3]。目前控制柑橘綠霉病的商業(yè)化防治手段主要是采用常規(guī)化學殺菌劑（如噻苯咪唑、抑霉唑、咪酰胺、咯菌腈和嘧霉胺等），這些藥物雖然對病原菌有較好的防治效果，但也具有毒性大、高殘留、污染環(huán)境以及作用位點單一導致病菌易產生耐藥性等缺點[4-6]。

作為新一代的鹽類食品防腐劑，脫氫乙酸鈉（sodium dehydroacetate，SD）對多種病原菌具有極強的抑制作用，目前已廣泛應用于食品、飼料、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)的防腐保鮮[7-10]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，SD對鏈格孢霉、灰葡萄孢霉、果鏈核盤菌、青霉和酸腐菌等采后病原真菌也具有顯著的抑制作用，且能夠有效延緩多種果蔬采后品質的下降，增強果蔬的貯藏性[11-15]。前期的研究發(fā)現(xiàn)，SD對柑橘典型采后病害（如綠霉病、青霉病和酸腐?。┚哂忻黠@的防治效果，質量分數(shù)0.02%～0.08%SD就能顯著抑制指狀青霉、意大利青霉和酸腐菌的生長，降低貯藏柑橘果實發(fā)病率，維持柑橘采后品質[11,13,16]。因此，SD可能是非常有應用前景的防控柑橘綠霉病常規(guī)化學殺菌劑的替代品。

研究表明，SD處理能夠破壞酸腐菌菌絲體細胞膜和線粒體，導致其菌絲體細胞質流失、質壁分離、胞內物質溶解，胞內ATP含量降低和Na+/K+-APTase活性增加[12]；此外，碳酸銨可通過直接損傷意大利青霉菌絲線粒體結構和功能發(fā)揮其抑菌活性[17]；聚合季銨鹽處理不僅能夠破壞水稻紋枯病菌細胞的結構完整性和功能，引起細胞質膜受損和線粒體功能障礙，導致胞內物質泄漏，還會嚴重破壞病原菌細胞壁的完整性，造成胞內堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）的大量外泄[18]。因此，細胞壁、細胞膜和線粒體等可能是鹽類物質發(fā)揮抑菌作用的直接靶標位點。但SD抑制P. digitatum生長的作用機制尚不清楚，這極大限制了SD在實際生產中的應用。因此，本實驗通過研究不同質量濃度SD對P. digitatum菌絲體細胞壁、細胞膜、線粒體功能以及柑橘綠霉病等的影響，分析SD抑制P. digitatum的可能作用機制，以期為柑橘采后綠霉病的持續(xù)防治和新型防腐保鮮技術的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

柑橘指狀青霉（P. digitatum）菌種保存于湘潭大學農產品加工與保藏實驗室。

金柑果實（八成熟）采購于湖南省湘潭市湘潭大學附近的果園。

SD（分析純） 上海阿拉丁試劑有限公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）、JC-10線粒體膜電位和Na+/K+-ATPase測定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；AKP試劑盒 上海貝博生物科技有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基由水、土豆、葡萄糖和瓊脂粉按照質量比50∶10∶1∶1配制而成；馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基由水、土豆和葡萄糖按照質量比50∶10∶1配制而成。

1.2 儀器與設備

LDZF-50KB立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械有限公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；Labogene冷凍干燥機 香港環(huán)球分析測試儀器有限公司；DS-FI2熒光顯微鏡 日本尼康儀器有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀 蘇州市萊頓科學儀器有限公司；UV-6300B紫外-可見分光光度計青島明博環(huán)保科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SD用量的確定及菌絲體的收集

本課題組前期研究表明，SD對P. digitatum的最小抑菌質量濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最小殺菌質量濃度（minimum fungicidal concentration，MFC）分別為0.2 g/L和0.4 g/L[13]，因此本研究直接使用此質量濃度進行后續(xù)實驗。

菌絲體樣品收集：取-80 ℃保藏的P. digitatum菌液5 μL，加入100 μL PDB培養(yǎng)基混勻，涂布于新滅菌的PDA培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)5 d，用直徑6 mm的無菌打孔器在新培養(yǎng)好的P. digitatum平板上取菌苔，置于各新滅菌的PDA培養(yǎng)基中間，倒置培養(yǎng)5 d。刮取PDA培養(yǎng)基中的P. digitatum孢子置于無菌水中，調整孢子濃度為1×107spores/mL（血球計數(shù)板計數(shù)法測得），將20 μL孢子懸浮液注入無菌PDB培養(yǎng)基，25 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，用質量濃度分別為0、1/2 MIC和MIC的SD處理120 min，并分別在0、30、60 min和120 min 4個時間點取樣，離心收集菌絲體。

1.3.2 胞內和胞外SD質量濃度測定

胞內和胞外SD質量濃度測定參考劉海龍[19]方法。菌液用紗布過濾，濾液用于測定胞外SD含量。收集的菌絲體用無菌水清洗3 次，液氮研磨，取1.0 g于離心管中，加入3 mL乙腈混勻，隨后加入40 μL冰醋酸混勻，超聲提取20 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液，殘渣重復提取1～2 次，合并上清液，加入1 mL正丙醇，45 ℃旋轉蒸發(fā)干燥。利用2 mL流動相（V（甲醇）∶V（0.02 mol/L乙酸銨）＝31∶69）溶解殘渣，超聲1 min，10 000 r/min離心10 min，上清液過0.22 μm有機系濾膜備用。高效液相色譜檢測條件：C18分析柱（250 mm×4.6 mm）；流速1.0 mL/min；流動相（V（甲醇）∶V（0.02 mol/L乙酸銨）＝31∶69）線性洗脫；紫外檢測器；檢測波長293 nm；進樣量10 μL。

1.3.3 細胞壁完整性的檢測

細胞壁完整性的檢測參考Tang Xu等[12]方法。挑取少量菌絲體在載玻片上，加入10 μL鈣熒光白（calcofluor white，CFW）染色10 s，之后加入等量KOH溶液（質量分數(shù)10%）洗脫背景色，置于熒光顯微鏡下觀察拍照，每組重復3 次。

AKP活力測定參考Tang Xu等[12]的方法。培養(yǎng)的菌液用4 層紗布過濾，收集上清液，用于檢測胞外APK活力。菌絲體用無菌水清洗3 次，取過濾后菌絲體0.50 g，加入2 mL磷酸緩沖鹽液（phosphate buffered saline，PBS）（0.10 mol/L、pH 7.0，含1.5 g/L 4-氨基安替吡啉），液氮研磨，4 000 r/min離心20 min，收集上清液，用于檢測胞內APK活力。AKP活力測定具體步驟按照說明書進行。定義40 ℃每克樣品每分鐘催化水解產生1 μmol酪氨酸為一個酶活力單位，AKP活力單位為U/g。

1.3.4 細胞膜完整性檢測

細胞膜完整性的檢測參考李路等[20]的方法。取0.10 g菌絲體，加入1 mL pH 7.0 50 mmol/L PBS、10 μL 1 mg/mL PI染液，于37 ℃下水浴15 min，之后用PBS洗數(shù)次去除殘留染液，取少量菌絲體制片，置于熒光顯微鏡下觀察、拍照。使用熒光分光光度計檢測樣品熒光強度，參考李路等[20]方法計算相對熒光強度。

1.3.5 菌絲體總脂質含量和胞外pH值測定

將培養(yǎng)48 h的菌液用紗布過濾，取濾液，用pH計測定胞外pH值。菌絲體總脂質含量測定參照Zhou Hai’en等[21]的方法，以膽固醇為標準品，繪制標準曲線，根據(jù)樣本在520 nm波長處的吸光度以及標準曲線方程計算各樣品總脂質含量，單位為mg/g。

1.3.6 菌絲體線粒體膜電位和Na+/K+-ATPase活力的測定

線粒體膜電位采用JC-10線粒體膜電位檢測試劑盒測定。線粒體膜電位較高時，JC-10聚集在線粒體基質中形成聚合物，可以產生紅色熒光；線粒體膜電位較低時，JC-10不能聚集在線粒體的基質中，此時JC-10為單體，可以產生綠色熒光。用紅綠熒光強度比來表征線粒體膜電位，進而反映線粒體功能的受損程度。

Na+/K+-ATPase活力測定參考相應試劑盒說明書進行。定義每小時每克菌絲體中Na+/K+-ATPase分解ATP產生1 μmol無機磷的用量為一個酶活力單位，Na+/K+-ATPase活力單位為U/g。

1.3.7 ATP、ADP、AMP含量的測定和能荷的計算

ATP、ADP、AMP含量的測定和能荷的計算參考辛志彤[22]的方法。取1.3.1節(jié)制備的菌絲體，用滅菌的ddH2O清洗，稱取適量樣品（0.1 g）于試管中，加入煮沸的MgSO4溶液（5 mL、2 mmol/L），混勻，100 ℃水浴15 min后取出立即流水冷卻，液氮研磨并離心（4 000 r/min、4 ℃），上清液用于高效液相色譜測定胞內ATP、ADP、AMP含量。液相色譜條件：C18分析柱（250 mm×4.6 mm）；流動相為V（緩沖液）∶V（甲醇）＝97.5∶2.5，緩沖液為0.05 mol/L KH2PO4-K2HPO4溶液（含1 mmol/L pH 6的乙二胺四乙酸）；紫外檢測器；等度洗脫；流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長259 nm；進樣體積20 μL。

1.3.8 SD對金柑果實綠霉病干預實驗

采摘下來的金柑果實于15 ℃貯藏庫放置過夜，先用自來水沖洗干凈，再用次氯酸鈉溶液（體積分數(shù)2%）處理2 min，之后蒸餾水沖洗3 次，晾干，用無菌手術刀在果實赤道處前后對稱劃2個十字傷口（1 mm×1 mm）。接種10 μL（1×105CFU/mL）孢子懸浮液于傷口處，靜置4 h。將果實隨機分成4 組，每組3個重復，分別浸泡于不同質量濃度的SD溶液（0、4 MFC、8 MFC、16 MFC）中30 s。果實自然晾干后，每10個果實一筐，用聚乙烯保鮮袋包裝，置于培養(yǎng)箱（溫度25 ℃、相對濕度90%）培養(yǎng)6 d。每天拍照并統(tǒng)計果實腐爛率，腐爛率計算參考李路等[20]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗均重復3 次，結果以平均值±標準差表示。采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用Duncan’s test檢驗差異的顯著性，以P＜0.05表示差異顯著。使用Origin 2017軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 SD處理對P. digitatum菌絲體胞內和胞外SD水平的影響

如圖1A所示，與對照相比，1/2 MIC SD和MIC SD處理菌絲體后，胞內SD質量濃度迅速升高，且分別在處理60 min和30 min時達到峰值，之后有所下降但仍維持較高水平，在整個處理期間SD處理組胞內SD質量濃度均顯著高于同時期對照，結果表明SD在處理30 min時已進入胞內，致使胞內SD質量濃度增加。胞外SD質量濃度主要受SD處理質量濃度的影響，在整個處理期間維持穩(wěn)定，且處理組胞外SD質量濃度均高于同時期對照（圖1B）。

2.2 SD處理對P. digitatum菌絲體細胞壁完整性的影響

利用CFW染料染色后，藍色熒光較亮的部分為幾丁質沉積最多的隔膜和菌絲體頂端。在整個處理期間，對照組與處理組菌絲體細胞壁熒光分布均勻（圖2A），說明SD處理不影響菌絲體細胞壁熒光。

如圖2B所示，在0～120 min，處理組與對照組菌絲體胞外AKP活力整體呈上升趨勢，120 min時，1/2 MIC SD處理組（（4.187 7±0.317 8）U/L）和MIC SD處理組（（4.556 6±0.317 0）U/L）AKP活力均高于對照組（（4.094 3±0.359 5）U/L），但與對照間無顯著差異。

圖2 SD處理對P. digitatum菌絲體細胞壁完整性的影響Fig. 2 Effect of SD on the cell wall integrity of P. digitatum mycelia

2.3 SD處理對P. digitatum菌絲體細胞膜完整性的影響

PI染料染色結果如圖3所示，1/2 MIC SD處理菌絲體30 min時，出現(xiàn)微弱的紅色熒光，且隨處理時間的延長，紅色熒光增強；處理120 min時，相對熒光強度顯著高于對照，為對照組的1.36 倍。MIC SD處理組在30 min即出現(xiàn)明顯的紅色熒光，且隨處理時間的延長，紅色熒光和相對熒光強度均增加，均高于同期1/2 MIC SD處理組和對照組。

圖3 SD處理對P. digitatum菌絲體細胞膜完整性的影響Fig. 3 Effect of SD on the cell membrane integrity of P. digitatum mycelia

2.4 SD處理對P. digitatum菌絲體總脂質含量和pH值的影響

由圖4A可知，與對照相比，SD處理30 min后顯著降低了菌絲體總脂質含量（P＜0.05）。在處理60 min時，1/2 MIC和MIC SD處理組的總脂質含量分別比對照（（524.63±33.40）mg/gmf）降低了24%和30%，僅為（396.60±19.63）mg/gmf和（366.82±59.11）mg/gmf。

菌絲體胞外pH值變化如圖4B所示。由于SD溶液呈弱堿性，在0 min時，MIC SD處理組pH值高于1/2 MIC SD處理組和對照組。MIC SD處理組和1/2 MIC SD處理組的pH值在前60 min持續(xù)升高并在之后維持較高的水平，而對照組在整個處理期間變化較小。

圖4 SD處理對P. digitatum菌絲體總脂質含量（A）和胞外pH值（B）的影響Fig. 4 Effect of SD on total lipid content (A) and extracellular pH (B)of P. digitatum mycelia

2.5 SD處理對P. digitatum菌絲體線粒體膜電位的影響

菌絲體線粒體膜電位熒光變化如圖5所示，對照菌絲體線粒體膜電位在整個處理期間一直維持較高水平；與對照相比，SD處理顯著降低了線粒體膜電位。在30 min時，MIC SD處理組的紅綠熒光強度比顯著低于對照和1/2 MIC SD處理組，之后一直維持在較低的水平。在處理30 min后，1/2 MIC SD處理組與MIC SD處理組間紅綠熒光強度比差異不顯著，但均顯著低于對照。

圖5 SD處理對P. digitatum菌絲體線粒體膜電位的影響Fig. 5 Effect of SD on the mitochondrial membrane potential of P. digitatum mycelia

2.6 SD處理對P. digitatum菌絲體能量水平的影響

菌絲體能量水平變化如圖6所示，對照組、1/2 MIC SD處理組和MIC SD處理組的ATP含量均呈先升后降的變化趨勢，相比于對照組和MIC SD處理組，1/2 MIC SD處理組降低了P. digitatum菌絲體胞內ATP含量，但3個處理組之間無顯著差異。在處理30 min時，1/2 MIC SD處理組和MIC SD處理組的ADP含量均高于對照組，MIC SD處理組顯著高于對照組。對照組AMP水平在30 min后逐漸增加，而SD處理進一步加速其積累。此外，與對照相比，SD處理組在整個處理期間維持了更低的能荷水平。

圖6 SD處理對P. digitatum菌絲體能量代謝的影響Fig. 6 Effect of SD on energy metabolism of P. digitatum mycelia

2.7 SD處理對P. digitatum菌絲體Na+/K+-ATPase活力的影響

如圖7所示，對照菌絲體Na+/K+-ATPase活力在整個處理期間保持穩(wěn)定，而SD處理組菌絲體的胞內Na+/K+-ATPase活力在整個處理期間持續(xù)增加。在處理60 min時，MIC SD處理組的Na+/K+-ATPase活力顯著高于對照組；在處理120 min時，MIC SD處理組和1/2 MIC SD處理組菌絲體的Na+/K+-ATPase活力均達到最高，且顯著高于對照組。

圖7 SD處理對P. digitatum菌絲體胞內Na＋/K＋-ATPase活力的影響Fig. 7 Effect of SD on intracellular Na+/K+-ATPase activity of P. digitatum mycelia

2.8 SD處理對接種P. digitatum金柑果實綠霉病的影響

由表1和圖8可知，對照組果實在接種第2天即發(fā)病，金柑表面?zhèn)谔幊尸F(xiàn)水漬狀病癥，隨著接種后貯藏時間的延長，病斑面積逐漸擴大，在接種后第4天時，果實表面出現(xiàn)明顯的綠色粉狀霉層，在第6天時果實發(fā)病率達到100%，傷口處向內凹陷，整果腐爛。與對照相比，不同質量濃度的SD處理可不同程度地抑制果實綠霉病的發(fā)生和病斑面積擴大，抑制效果呈濃度依賴效應。低質量濃度的SD處理組（4 MFC和8 MFC）在接種第2天時同樣發(fā)病，但發(fā)病率和發(fā)病癥狀明顯低于對照。16 MFC SD處理組在第3天時才發(fā)病，在接種第6天時，發(fā)病率仍比對照低54.2%。

表1 SD處理對接種P. digitatum金柑果實發(fā)病率的影響Table 1 Disease incidence of inoculated kumquat fruit treated with SD%

圖8 SD處理對接種P. digitatum金柑果實綠霉病發(fā)生的影響Fig. 8 Disease progression in inoculated kumquat fruit treated with SD

3 討 論

人們對使用常規(guī)化學殺菌劑帶來的食品安全、環(huán)境污染、病原菌耐藥性等問題的擔憂，以及對無毒、無害和環(huán)境友好型抑菌劑的需求，為具有良好抑菌效果的鹽類食品防腐劑提供了前所未有的發(fā)展機遇，且鹽類食品防腐劑獨特的陽離子賦予其更高的抑菌活性和水溶性[5,23-26]。然而，相比對鹽類物質抑菌活性的研究，目前對包括SD在內的鹽類物質抑菌機制仍知之甚少。

研究發(fā)現(xiàn)，鹽類物質抑菌機理可能是不同陰離子和陽離子的直接毒性作用、滲透脅迫、pH值的改變和誘導宿主抗病機制相關的間接因素（木質化、苯丙烷通路上調和抗真菌相關化合物的生物合成或積累）[5,24,27-29]。對于碳酸鈉和碳酸氫鹽，其主要通過碳酸鹽離子的緩沖作用和堿性環(huán)境的形成來發(fā)揮抑菌作用。相比菌絲體生長，產酸需要更多的能量[30]。P. digitatum在酸性條件下比在中性和堿性條件下生長得更好。本研究發(fā)現(xiàn)，SD處理P. digitatum菌絲體30 min時，菌絲體胞內SD的水平顯著增加，且在整個處理期間維持相對較高的水平，表明在處理30 min時SD已進入細胞發(fā)揮作用。Na+/K+-ATPase活力明顯增加表明SD處理激活了質膜上的鈉-鉀泵，促進了SD的主動運輸，從而增加了胞內SD的水平。作為弱堿性的鹽類物質，MIC的SD加入從初始就提高了病原菌胞外pH值，但1/2 MIC的SD沒有明顯提高胞外pH值，隨處理時間的延長，兩個處理質量濃度下的病原菌胞外pH值均提升，表明SD處理可能加速了胞內離子的泄漏，但SD具體的作用靶標仍有待研究。鹽離子的緩沖作用和對環(huán)境pH值的調節(jié)可能是SD發(fā)揮抑菌作用的一個原因。

前期的研究表明，對細胞壁、細胞膜和線粒體等結構與功能的影響可能是鹽類物質發(fā)揮抑菌作用的實質，但不同鹽類物質對不同病原菌的影響存在一定差異[11-12,17-18]。幾丁質作為細胞壁構成的重要組分，可與CFW染料結合，在紫外光下發(fā)出藍色熒光，其強度的變化可以直觀反映處理對細胞壁結構的影響[31]。如Ouyang Qiuli等[32]發(fā)現(xiàn)，肉桂醛處理可明顯降低P. digitatum菌絲體的細胞壁熒光強度，抑制菌絲體生長，胞外APK的泄漏進一步證明肉桂醛破壞了酸腐菌細胞壁完整性。本研究發(fā)現(xiàn)，在整個處理過程中，不同質量濃度的SD均未顯著影響P. digitatum菌絲體細胞壁熒光強度，且SD處理組的胞外AKP水平也與對照無顯著性差異。Tang Xu等[12]也發(fā)現(xiàn)SD處理未損傷酸腐菌的細胞壁。由此推測，細胞壁可能不是SD發(fā)揮抑菌作用的直接靶標。功能正常的細胞膜對物質具有選擇透性，而在其遭受破壞時細胞透性增加。PI染料可在細胞膜受損時進入細胞與DNA結合，在熒光下出現(xiàn)紅色熒光[33]。本研究中，對照菌絲體在整個過程未出現(xiàn)紅色熒光，而SD處理組30 min時即出現(xiàn)紅色熒光，且紅色熒光隨著SD質量濃度的增加而增強。這表明SD處理破壞了P. digitatum細胞膜的完整性。進一步的細胞膜總脂質含量測定結果表明，SD處理顯著降低了菌絲體細胞膜總脂質水平，且MIC SD處理組降低效果更明顯。這是導致SD處理組胞外pH值升高的重要原因，pH值的升高不利于孢子萌發(fā)和菌絲體在果實表面的定植，從而可減少果實的發(fā)病[34]。這些結果表明，SD可通過直接破壞P. digitatum菌絲體細胞膜結構完整性和功能來發(fā)揮其抑菌作用。線粒體作為細胞能量供應的主要場所，對細胞內各種需能反應的正常進行至關重要，因此，也常成為多種抑菌物質的作用靶標[35-36]。本實驗檢測了菌絲體線粒體的膜電位和能量變化，結果發(fā)現(xiàn)SD處理能夠降低線粒體膜電位和細胞能荷水平。但對于ATP和ADP，SD處理期間并未直接降低細胞ATP水平，也只是在后期降低了細胞ADP的水平，表明SD破壞細胞膜的同時間接影響了線粒體的功能。這與Tang Xu等[12]研究SD處理酸腐菌的結果一致，表明線粒體不是SD起抑菌作用的直接靶標，但對其間接的影響也增強了SD的抑菌作用。

綜上，SD可通過主動運輸進入P. digitatum菌絲體細胞，直接損傷細胞膜，導致胞內離子泄漏和胞外pH值升高，最終影響線粒體的能量供應，引起菌絲體的凋亡，從而發(fā)揮其抑菌活性，減少柑橘綠霉病的發(fā)生。對SD是否還有其他作用靶標及其抑菌的分子機制仍有待進一步研究。