青蒿琥酯誘導(dǎo)胃癌BGC-823細(xì)胞死亡的實(shí)驗(yàn)研究

王維明 周香 鄭志強(qiáng)

●論 著

青蒿琥酯誘導(dǎo)胃癌BGC-823細(xì)胞死亡的實(shí)驗(yàn)研究

王維明 周香 鄭志強(qiáng)

目的 觀察青蒿琥酯（ART）對(duì)胃癌細(xì)胞株BGC-823的裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。方法將胃癌BGC-823細(xì)胞注射至裸鼠右側(cè)背部近腋下部位皮下，建立荷瘤裸鼠模型并隨機(jī)分為空白對(duì)照組（0mg/kg ART組）、60mg/kg ART組、120mg/kg ART組、240mg/kg ART組，每組5只。各組裸鼠每天腹腔注射ART1次（空白對(duì)照組注射0.9%氯化鈉溶液），連續(xù)15d，觀察裸鼠移植瘤生長(zhǎng)情況，并采用RT-PCR、免疫組化及Western blot法測(cè)定血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及鈣中性蛋白酶2（Calpain2）表達(dá)情況。結(jié)果 4組裸鼠移植瘤體積比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），兩兩比較亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05），與空白對(duì)照組比較，60mg/kg ART組、120mg/kg ART組、240mg/kg ART組裸鼠移植瘤體積均明顯縮小，ART表現(xiàn)出劑量依賴性的抑瘤作用。4組胃癌BGC-823細(xì)胞VEGF、Calpain2 mRNA與蛋白表達(dá)水平比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05），兩兩比較亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05），與空白對(duì)照組比較，60 mg/kg ART組、120 mg/kg ART組、240 mg/kg ART組細(xì)胞VEGF mRNA與蛋白相對(duì)表達(dá)水平均下降，Calpain2 mRNA與蛋白相對(duì)表達(dá)水平均升高，且VEGF相對(duì)表達(dá)水平隨ART濃度升高而降低，而Calpain2相對(duì)表達(dá)水平隨ART濃度升高而升高。結(jié)論 ART在胃癌移植瘤模型體內(nèi)起劑量依賴性的抑瘤作用，該作用機(jī)制可能與下調(diào)VEGF的表達(dá)、上調(diào)Calpain2的表達(dá)有關(guān)。

青蒿琥酯 胃癌 裸鼠模型

青蒿琥酯（ART）是青蒿素衍生物，即二氫青蒿素-10-α-丁二酸單酯，分子式C19H28O8，有較好的水溶性，是具有過(guò)氧化橋的倍半萜類(lèi)化合物。研究表明，ART具有抗腫瘤作用，且具有低毒性、不存在交叉耐藥等優(yōu)勢(shì)[1-2]。細(xì)胞脹亡是指以細(xì)胞腫脹為突出特征的細(xì)胞死亡，其形態(tài)表現(xiàn)與凋亡不同[3]。筆者團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，ART體外作用于胃癌BGC-823細(xì)胞后，細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、溶解性死亡，呈典型的細(xì)胞脹亡特征[4-5]?；诖?，本研究進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討ART誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞死亡的作用機(jī)制，以期為臨床胃癌的治療提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 人胃腺癌細(xì)胞株BGC-823由上海生命科學(xué)研究所提供；20只無(wú)胸腺的BALB/c裸鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。ART注射液（廣西桂林南藥制藥廠，國(guó)藥準(zhǔn)字H10930195，批號(hào)LA100703）；PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM購(gòu)自日本Takara公司；兔抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及鈣中性蛋白酶2（Calpain2）多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)abcam公司；即用型免疫組化二抗試劑盒及DAB、蘇木素復(fù)染液購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 癌細(xì)胞的培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?胃癌BGC-823細(xì)胞培養(yǎng)于完全RPMI-1640培養(yǎng)液（含10%FBS、100IU/ml青霉素、100IU/ml鏈霉素）中，置于37℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BGC-823細(xì)胞，用含10%FBS的1640培養(yǎng)基終止消化。離心后將細(xì)胞用不含血清的1640培養(yǎng)基洗滌1次，再次離心將細(xì)胞混勻于不含血清的1640培養(yǎng)基中。將BGC-823細(xì)胞懸浮，用一次性注射器注射至裸鼠右側(cè)背部近腋下部位皮下，每只注射約1×107個(gè)細(xì)胞。1周后，所有裸鼠的移植瘤體積約200mm3，成瘤率100%。實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵循浙江省有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)與使用的準(zhǔn)則。

1.2.2 具體給藥情況及觀察指標(biāo) 根據(jù)移植瘤體積大小排序，將荷瘤裸鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：空白對(duì)照組（0mg/kg ART組）、60mg/kg ART組、120mg/kg ART組、240mg/kg ART組，每組5只。分組后第2天開(kāi)始給藥，各組每天腹腔注射ART 1次（空白對(duì)照組注射0.9%氯化鈉溶液）。每次均在注射藥物前測(cè)量體重，并根據(jù)體重進(jìn)行給藥，連續(xù)給藥15d。移植瘤體積=（荷瘤裸鼠的長(zhǎng)徑×短徑2）/2。每隔3d測(cè)量移植瘤體積大小1次，觀察裸鼠活躍性，記錄結(jié)果并計(jì)算各組抑瘤率 [抑瘤率＝（空白對(duì)照組移植瘤平均體積－實(shí)驗(yàn)組組移植瘤平均體積）/空白對(duì)照組移植瘤平均體積×100%]。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)VEGF、Calpain2 mRNA表達(dá) 分組同上，Trizol法提取總RNA。取500 ng的RNA，按試劑盒DRR037A說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物探針由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。VEGF上游引物5′-AGGAGGGCAGAATCATCACG-3′，下游引物5′-CA－TTTGTTGTGCTGTAGGAAGCT-3′。Calpain2上游引物5′-GAAGGGTGGAGCCAGGTAGA-3′；下游引物：5′-GGGAAAGCCGCTGTTGTT-3′。內(nèi)參基因ACTB上游引物5′-CGTGGACATCCGCAAAGAC-3′，下游引物5′-AAGAAAGGGTGTAACGCAACTAAG-3′。熒光定量PCR反應(yīng)體系及條件參照SYBR Premix Ex TaqTM說(shuō)明書(shū)。數(shù)據(jù)采用LightCycler 480軟件分析，以各組VEGF、Calpain2 mRNA與ACTB的相對(duì)表達(dá)水平作為衡量基因半定量表達(dá)的結(jié)果。

1.2.4 免疫組化法檢測(cè)VEGF、Calpain2蛋白定性表達(dá) 取空白對(duì)照組及120 mg/kg ART組標(biāo)本置于4%多聚甲醛中固定，包埋切片。石蠟切片脫蠟去水；3%雙氧水室溫孵育5～10min以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；加0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0），于微波爐內(nèi)修復(fù)10 min；滴加5%BSA封閉液，室溫孵育20 min，滴加一抗工作液（1∶100稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜；PBS沖洗，5 min×3次，滴加適量生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃孵育30 min；PBS沖洗，5 min×3次；滴加生物素山羊抗兔IgG，37℃孵育15 min；PBS沖洗，5min×3次；顯色劑顯色3 min（DAB）；自來(lái)水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片；以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性結(jié)果。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)VEGF、Calpain2蛋白定量表達(dá) 提取4組標(biāo)本總蛋白，并計(jì)算出上樣體積。變性后SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，電轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，TBST洗膜，然后加入VEGF及Calpain2一抗（1∶500）4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的IgG二抗（1∶6 000）室溫孵育2 h，應(yīng)用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒曝光，以Tubulin蛋白作為內(nèi)參照。采用Image Tool凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組裸鼠移植瘤生長(zhǎng)情況比較 腹腔內(nèi)用藥15 d后，各組裸鼠體重、移植瘤體積比較見(jiàn)圖1、2。

圖1 各組裸鼠體重比較

由圖1可見(jiàn)，各組裸鼠體重比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），裸鼠體重也未見(jiàn)明顯變化，即ART未表現(xiàn)出明顯的毒副反應(yīng)。由圖2可見(jiàn)，各組裸鼠移植瘤體積比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），兩兩比較亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05），與空白對(duì)照組比較，60 mg/kg ART組、120 mg/kg ART組、240 mg/kg ART組裸鼠移植瘤體積均明顯縮小，抑瘤率分別約為37.2%、45.0%、58.1%，即ART表現(xiàn)出劑量依賴性的抑瘤作用。

圖2 各組裸鼠移植瘤體積比較

2.2 各組胃癌BGC-823細(xì)胞VEGF、Calpain2 mRNA表達(dá)水平比較 見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，4組胃癌BGC-823細(xì)胞VEGF、Calpain2 mRNA表達(dá)水平比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05），兩兩比較亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05），與空白對(duì)照組比較，60 mg/kg ART組、120 mg/kg ART組、240 mg/kg ART組細(xì)胞VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)水平均明顯下降，Calpain2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平均升高，即VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)水平隨ART藥物濃度升高而降低，而Calpain2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平隨ART藥物濃度升高而升高。

表1 各組胃癌BGC-823細(xì)胞VEGF、Calpain2 mRNA表達(dá)水平比較

2.3 各組胃癌BGC-823細(xì)胞VEGF、Calpain2蛋白表達(dá)情況比較 見(jiàn)圖3-5。

圖3 各組胃癌BGC-823細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)情況比較（a：120mg/kg ART組；b：空白對(duì)照組；蘇木素染色，×200）

圖4 各組胃癌BGC-823細(xì)胞Calpain2蛋白表達(dá)情況比較（a：120mg/kg ART組；b：空白對(duì)照組；蘇木素染色，×200）

圖5 各組胃癌BGC-823細(xì)胞VEGF、Calpain2蛋白表達(dá)情況比較（a:空白對(duì)照組；b:60 mg/kg ART組；c:120 mg/kg ART組；d:240 mg/kg ART組）

由圖3、4可見(jiàn)，VEGF、Calpain2蛋白均表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。由圖5可見(jiàn)，4組胃癌BGC-823細(xì)胞VEGF、Calpain2蛋白表達(dá)水平比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05），兩兩比較亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05），與空白對(duì)照組比較，60 mg/kg ART組、120 mg/kg ART組、240 mg/kg ART組細(xì)胞VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)水平（分別為0.78±0.02、0.62±0.01、0.29±0.01）均下降，Calpain2蛋白相對(duì)表達(dá)水平（分別為1.14±0.02、2.46±0.03、3.98±0.04）均升高，即VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)水平隨ART藥物濃度升高而降低，而Calpain2蛋白相對(duì)表達(dá)水平隨ART藥物濃度升高而升高。

3 討論

Majno及Joris最早在同一細(xì)胞損傷中發(fā)現(xiàn)兩種不同的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞溶解與細(xì)胞腫脹，并將這兩種不同的死亡形態(tài)分別命名為凋亡與脹亡[6]。凋亡作為細(xì)胞死亡的方式已被廣泛接受，是迄今為止研究最深入的細(xì)胞死亡方式；而細(xì)胞脹亡在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中也占有重要地位。周晉等[7]報(bào)道青蒿素能使人白血病細(xì)胞株NB4、K562和原代APL細(xì)胞發(fā)生脹亡，Du等[8]報(bào)道ART能通過(guò)活性氧損傷機(jī)制誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞發(fā)生脹亡。筆者團(tuán)隊(duì)經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ART可在體外誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生脹亡[4-5]。本實(shí)驗(yàn)研究在前期成果的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)ART在胃癌移植瘤模型體內(nèi)產(chǎn)生了劑量依賴性的抑瘤作用，60 mg/kg ART組、120 mg/kg ART組、240 mg/kg ART組裸鼠移植瘤體積均縮小，抑瘤率分別約為37.2%、45.0%、58.1%，且裸鼠未出現(xiàn)明顯的毒副反應(yīng)。可見(jiàn)，ART有潛力發(fā)展成為一種通過(guò)細(xì)胞脹亡機(jī)制抑制胃癌細(xì)胞增殖的候選藥物，可以增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的化療敏感性。

接著，本研究進(jìn)一步通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)研究其可能作用機(jī)制。研究表明，細(xì)胞在缺氧的環(huán)境下，能量耗竭導(dǎo)致離子失衡（特別是鈣離子），激活鈣相關(guān)蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞脹亡[9-10]。Calpain是一種鈣依賴性的中性蛋白酶，屬于半胱氨酸蛋白酶家族，能水解spectrin、paxillin及vinculin肌纖維蛋白，與細(xì)胞脹亡的發(fā)生密切相關(guān)[11]。Calpain抑制劑能夠抑制細(xì)胞發(fā)生脹亡，對(duì)細(xì)胞凋亡沒(méi)有抑制作用或抑制作用較弱。Calpain活性受細(xì)胞中鈣離子的濃度影響，鈣離子可以激活此蛋白，根據(jù)激活此種蛋白所需的鈣離子濃度，Calpain分為Calpain1（微摩爾級(jí)）和Calpain2（毫摩爾級(jí)）。Calpain1能在正常生理?xiàng)l件下發(fā)揮功能，而Calpain2則在病理?xiàng)l件下(如細(xì)胞內(nèi)鈣超載)才能激活，引起細(xì)胞膜通透性增加進(jìn)而使細(xì)胞發(fā)生脹亡[10]。筆者推測(cè)ART可能是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧，VEGF下降導(dǎo)致鈣離子超載，激活了Calpain2蛋白，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生脹亡。

為驗(yàn)證這一假設(shè)，本研究通過(guò)RT-PCR、免疫組化及Western blot法檢測(cè)胃癌BGC-823細(xì)胞中VEGF、Calpain2的變化，結(jié)果顯示經(jīng)ART作用后，VEGF的mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)水平隨藥物濃度升高而降低，而Calpain2的mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)水平則隨藥物濃度升高而升高。由此可知，ART抑制胃癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)其脹亡與VEGF表達(dá)下調(diào)及Calpain2表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

綜上所述，ART在胃癌移植瘤模型體內(nèi)通過(guò)細(xì)胞脹亡起劑量依賴性的抑瘤作用，該作用機(jī)制可能與下調(diào)VEGF的表達(dá)、上調(diào)Calpain2的表達(dá)有關(guān)。ART或可成為胃癌化療候選藥物，具有重要臨床價(jià)值。

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（本文編輯：李媚）

讀者·作者·編者

《浙江醫(yī)學(xué)》對(duì)醫(yī)學(xué)論文中有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物描述的要求

在醫(yī)學(xué)論文的描述中，凡涉及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物者，在描述中應(yīng)符合以下要求：（1）品種、品系描述清楚；（2）強(qiáng)調(diào)來(lái)源；（3）遺傳背景；（4）微生物學(xué)質(zhì)量；（5）明確等級(jí)；（6）明確飼養(yǎng)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)環(huán)境；（7）明確性別；（8）有無(wú)質(zhì)量合格證；（9）有對(duì)飼養(yǎng)的描述（如飼料型、營(yíng)養(yǎng)水平、照明方式、溫度、溫度要求）；（10）所有動(dòng)物數(shù)量準(zhǔn)確；（11）詳細(xì)描述動(dòng)物的健康狀況；（12）對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的處理方式有單獨(dú)清楚的交代；（13）全部有對(duì)照，部分可采用雙因素方差分析。

本刊編輯部

Effects of artesunate on transplanted human gastric cancer BGC-823 in nude mice

WANG Weiming,ZHOU Xiang,ZHENG Zhiqiang. Department of Hepatobiliary Surgery,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000,China

Artesunate Stomach neoplasms Nude mice model

2017-04-11）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.14.2017-802

溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20140105、Y20140111）

325000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科(王維明）；溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤外科（周香、鄭志強(qiáng)）

王維明，E-mail：wwm_boy2010@163.com

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of artesunate on transplanted human gastric cancer in nude mice. Methods Human gastric cancer BGC-823 cells were inoculated in nude mice.The tumor-bearing nude mice were treated with artesunate at a dose of 60,120,or 240 mg/(kg·d),i.p.for 15 d.The changes of body weights and tumor size were observed.The expression of VEGF and Calpain2 mRNA and proteins were detected by RT-PCR,immunohistochemical and Western Blot, respectively. Results Artesunate suppressed BGC-823 tumor growth in nude mice in a dose-dependent manner.The expression of VEGF mRNA and protein were decreased and the expression of Calpain2 mRNA and protein were increased in cancer cells of artesunate-treated nude mice,compared to control group (P＜0.05). Conclusion Artesunate induces a dose-dependent suppression of BGC-823 tumor growth in nude mice,which might be related to the down-regulation of VEGF and the up-regulation of Calpain2.