特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中?；撬岷康臏y定

姚程晨，楊麗梅，林立

（北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評估中心（北京市食品檢驗(yàn)所），國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京 100094）

0 引言

我國每年出生的新生兒中都會有部分新生嬰兒由于受各種疾病的影響，其生命初期或相當(dāng)長一段時間里母乳或其他普通嬰兒配方食品不能完全滿足其所需的營養(yǎng)需求，而特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品的出現(xiàn)不僅可以提供這部分新生嬰兒所需的營養(yǎng)，也可以作為其賴以生存的唯一或主要的食物來源[1-3]。?；撬嵊址Qβ-氨基乙磺酸，分子式為HO3S-CH2-CH2-NH2，分子量為125.2 u，對人體起著十分重要的生理調(diào)節(jié)作用，尤其是增強(qiáng)免疫力和抗疲勞。?；撬峥梢砸鸫x物的變化，具有穩(wěn)定性強(qiáng)、抗氧化能力，可被作為生化試劑和潤滑劑來使用，缺乏牛磺酸會引起視網(wǎng)膜功能紊亂[4-12]。

目前測定?；撬岬闹饕椒ㄓ邪被岱治龇?、分光光度法、高效液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)法、傅立葉變換紅外線光譜法[13-17]等。特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品在世界各國均作為特殊膳食用食品進(jìn)行管理[18-19]，2015年起我國逐步完善對特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品的監(jiān)管，并明確了其作為食品的法律屬性[20]。針對嬰幼兒配方乳粉樣品可依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.169-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中牛磺酸的測定》第二法丹磺酰氯柱前衍生法進(jìn)行檢測[21]。但是特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品樣品復(fù)雜，?；撬崾芑|(zhì)干擾明顯，分離度差，衍生不充分，檢測結(jié)果不理想[22-24]。

本方法在國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.169-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中?；撬岬臏y定》第二法丹磺酰氯柱前衍生法的基礎(chǔ)上對特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品樣品稀釋后再進(jìn)行衍生優(yōu)化，選用資生堂CAPCELL PAK C18色譜柱分離效果好，可以很好的消除其他氨基酸引起的基質(zhì)干擾，滿足分析要求。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 樣品

市售的特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品，包括：無乳糖配方或低乳糖配方，乳蛋白部分水解配方，乳蛋白深度水解配方或氨基酸配方，早產(chǎn)、低出生體重嬰兒配方。

1.1.2 試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

亞鐵氰化鉀（分析純）、乙酸鋅（分析純）、鹽酸（分析純）、甲胺鹽酸鹽（分析純）、乙酸鈉（分析純）、冰乙酸（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水碳酸鈉（分析純），天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；丹磺酰氯(色譜純)，美國Alfa Aesar公司；乙腈(色譜純)，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；?；撬針?biāo)準(zhǔn)品（Taurine，CAS：107-35-7，純度：99.8%），sigma。

1.1.3 儀器與設(shè)備

安捷倫高效液相色譜分析儀1260（配有二極管陣列檢測器（DAD）以及熒光檢測器（FLR）)及OpenLAB CDS ChemStation Edition for LC & LC/MS Systems數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))，美國安捷倫公司；百分之一分析天平（型號ME802，d=0.01 g)、千分之一分析天平（型號ME203T，d=1 mg），瑞士梅特勒公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

稱取約10 mg?；撬針?biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容至100 mL。將?；撬針?biāo)準(zhǔn)儲備液用水稀釋配制成濃度分別為：1、2、10、20、50 μg/mL一系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，臨用前現(xiàn)配。

1.2.2 試劑配制

碳酸鈉緩沖液：稱取0.424 g無水碳酸鈉，加40 mL水溶解，用鹽酸溶液調(diào)pH至9.5，用水定容至50 mL。

丹磺酰氯溶液：稱取0.15 g丹磺酰氯，用乙腈溶解并定容至100 mL。臨使用前配制。

甲胺鹽酸鹽：取2.00 g鹽酸甲胺，用水溶解并定容至100 mL。

乙酸鈉緩沖液：稱取0.82 g乙酸鈉，加入800 mL水溶解，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至4.2，用水定容至1 000 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾。

1.2.3 樣品處理

準(zhǔn)確稱取2.50 g（精確到0.01 g）待測樣品，用20 mL 40℃左右的溫水溶解后振蕩混勻超聲提取，再分別加入1 mL乙酸鋅溶液和1 mL亞鐵氰化鉀溶液搖勻，繼續(xù)振蕩，用超純水定容至50 mL，搖勻，8 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

1.2.4 樣液稀釋、衍生

取上清液用水稀釋10倍后待用。吸取1 mL待測液到玻璃試管中，加入1 mL碳酸鈉緩沖液，以及1 mL丹磺酰氯溶液，充分振蕩混合，室溫避光衍生反應(yīng)2 h（1 h后需搖晃1次），加入0.1 mL鹽酸甲胺溶液渦旋混合，以終止反應(yīng)，避光靜置至沉淀完全。取上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后供高效液相色譜分析儀檢測。

另取標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液用水稀釋10倍搖勻待用，取1 mL與試液同步進(jìn)行衍生。供高效液相色譜分析儀檢測。

1.3 色譜條件

色譜柱：資生堂CAPCELL PAK C18色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)；流動相流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測器及波長：二極管陣列檢測器，254 nm；流動相：乙酸鈉緩沖液+乙腈,梯度洗脫程序如表1所示。

表1 ?；撬岬南疵撎荻缺?/p>

1.4 結(jié)果計(jì)算

按照下式計(jì)算試樣中?；撬岬暮浚?/p>

式中：X為試樣中牛磺酸的含量(mg/100 g)；c為試樣測定液中?；撬岬臐舛?μg/mL)；V為試樣定容體積(mL)；m為試樣質(zhì)量(g)，100為將結(jié)果單位由毫克每克換算為毫克每百克樣品中含量的換算系數(shù)；1 000為將濃度單位由ng/mL換算為μg/mL的換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

同時比較了Agilent zorbax Eclipse XDB-C18（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱、Agilent zorbax SB-C18（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱和資生堂CAPCELL PAK C18（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱對目標(biāo)化合物分離的影響。如圖1所示，?；撬嵩赬DB-C18柱和SB-C18上分離度較差；在PAK C18柱上分離度均較好，所以最終選擇資生堂CAPCELL PAK C18（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱進(jìn)行分析。

圖1 不同色譜柱分離?；撬岬囊合嗌V圖

流動相的選擇對目標(biāo)化合物的分離、峰形有很大的影響。本文研究比較了10 mmol/L乙酸鈉水溶液和乙腈的等度洗脫和梯度洗脫對?；撬嵘V峰的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品基質(zhì)復(fù)雜等度洗脫無法很好分離?；撬崮繕?biāo)峰，對于結(jié)果數(shù)據(jù)有明顯的影響，而流動相梯度洗脫的牛磺酸分離度較好、響應(yīng)值高，因此選擇10 mmol/L乙酸鈉水溶液和乙腈的梯度洗脫作為流動相。

2.2 蛋白質(zhì)沉淀優(yōu)化

由于特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品基質(zhì)復(fù)雜，考慮蛋白質(zhì)沉淀是否充分。有研究對比了乙腈、硫酸鋅、亞鐵氰化鉀與乙酸鋅的混合試劑沉淀嬰幼兒配方奶粉，結(jié)果發(fā)現(xiàn)亞鐵氰化鉀與乙酸鋅的混合試劑效果最好[25]。現(xiàn)選擇3種蛋白質(zhì)沉淀方法進(jìn)行比較，乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液沉淀蛋白質(zhì)法，調(diào)節(jié)pH酸堿變性蛋白沉淀法，磺基水楊酸蛋白質(zhì)沉淀法。

乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液沉淀蛋白質(zhì)法是利用乙酸鋅與亞鐵氰化鉀反應(yīng)生成的氰亞鐵酸鋅沉淀來挾走或吸附干擾物質(zhì)，這種方法除蛋白質(zhì)能力強(qiáng)。

酸堿變性沉淀法改變了蛋白質(zhì)pH環(huán)境，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)從有規(guī)則的排列變成不規(guī)則排列，其物理性質(zhì)也發(fā)生改變，并失去原有的生理活性，即蛋白質(zhì)發(fā)生變性，變性蛋白質(zhì)在水中的溶解度較小且以沉淀的形式從溶液中析出。這種方法除蛋白質(zhì)能力較弱。

磺基水楊酸蛋白質(zhì)沉淀法是利用生物堿制劑磺基水楊酸在酸性環(huán)境下，其陰離子可與帶正電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶性蛋白鹽而沉淀。這種方法除蛋白質(zhì)能力稍差，個別樣品除蛋白后依然出現(xiàn)渾濁狀態(tài)。

用3種蛋白質(zhì)沉淀方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對比如，圖2所示。結(jié)果表明用乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液沉淀蛋白質(zhì)后測得的樣品中?；撬岷扛咏鋵?yīng)標(biāo)簽明示值。

圖2 不同沉淀蛋白方式的?；撬峤Y(jié)果

2.3 樣液稀釋及衍生優(yōu)化

沉淀后上清液分別用水進(jìn)行稀釋，得到原樣液、5倍稀釋液、10倍稀釋液、20倍稀釋液，進(jìn)行衍生優(yōu)化對比。4個濃度待測液按照1.2.4樣液稀釋、衍生步驟操作。

另取標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液用水進(jìn)行稀釋，得到原標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液、5倍稀釋工作液、10倍稀釋工作液、20倍稀釋工作液，同時進(jìn)行上述衍生，得到4條衍生后的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，供高效液相色譜分析儀檢測。

當(dāng)原樣液、5倍稀釋液時，得到樣品中?；撬岬暮枯^低，稀釋10倍時樣品中?；撬岬暮枯^高，接近標(biāo)簽明示值，稀釋10倍、20倍時樣品中?；撬岬暮拷咏５捎谙♂尡稊?shù)越大誤差越大，且目標(biāo)物在儀器上響應(yīng)值越低。因此選擇10倍稀釋液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。不同稀釋倍數(shù)下?；撬岬臏y定結(jié)果如表2所示。

表2 不同稀釋倍數(shù)下?；撬岬臏y定結(jié)果

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍

配制牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)系列工作液進(jìn)HPLC檢測，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，所得線性回歸方程為y=4.427x+1.197，在質(zhì)量濃度1～50 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，滿足分析要求。?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液（10 μg/mL）及特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中牛磺酸的HPLC圖如圖3所示。采用逐步稀釋法，以基線3倍信噪比對最低檢測限進(jìn)行測定，方法檢出限為0.53 mg/100 g；以基線10倍信噪比對定量限進(jìn)行測定，方法定量限為1.60 mg/100 g。

圖3 ?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的HPLC圖

2.5 方法回收率和精密度

選取具有代表性的特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品進(jìn)行回收率與精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。添加3個水平濃度?；撬針?biāo)準(zhǔn)品。在最優(yōu)條件下進(jìn)行樣品前處理,同時做空白實(shí)驗(yàn)。由表3可知，3個添加水平下加標(biāo)回收率范圍為89.6%～103.9%，精密度（RSD）為0.19%～5.02%。

表3 特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品3水平加標(biāo)回收率和精密度

（續(xù)表3）

2.6 實(shí)際樣品測定

采用本方法對8批次特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中?；撬岬暮窟M(jìn)行檢測，外標(biāo)法定量，并與其標(biāo)簽明示值進(jìn)行比較。由表4可知，本實(shí)驗(yàn)方法中?；撬岷颗c其對應(yīng)標(biāo)簽明示值無顯著差異，表明采用本方法測得?；撬峤Y(jié)果可靠。

表4 部分市售樣品?；撬岷考捌錁?biāo)簽明示值

3 結(jié)論

本方法采用乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液沉淀蛋白法沉淀蛋白，并將樣液稀釋10倍后再衍生的柱前衍生前處理方式，用資生堂CAPCELL PAK C18，5 μm，4.6×250 mm色譜柱進(jìn)行梯度洗脫，建立高效液相色譜儀測定特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒食品中?；撬岷康臋z測方法。結(jié)果表明：在質(zhì)量濃度1～50 μg/mL范圍內(nèi)，牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系；該方法的檢出限為0.53 mg/100 g，定量限為1.60 mg/100 g；加標(biāo)回收率范圍為89.6%～103.9%，精密度（RSD）為0.19%～5.02%。本方法靈敏高效、衍生充分、回收率優(yōu)良、重復(fù)性穩(wěn)定，適用于特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中?；撬岬臋z測。