真菌熒光染色在侵襲性真菌病中的應(yīng)用價(jià)值

張澍雅 陳眾博 虞亦鳴 莊起東 於學(xué)嬋 陳輝 李安琪鄧在春 鄭琳

1.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸與危重癥科，浙江寧波 315000；2.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院微生物室，浙江寧波 315000

近年來，侵襲性肺部真菌感染（invasive pulmonary fungal infection，IPFI）的發(fā)病率明顯上升，免疫力低下的患者發(fā)病率更高[1,2]。同時(shí)IPFI 也日漸成為器官移植受者、惡性血液病和惡性腫瘤患者以及其他危重病患者的死亡原因之一[3,6]。IPFI 是由真菌直接侵犯(非寄生、過敏或毒素中毒)肺或支氣管引起的急、慢性組織病理損害所導(dǎo)致的，及早診斷、及時(shí)治療對提升疾病治愈率、降低死亡率相當(dāng)重要。目前主要診斷方法包括微生物學(xué)檢查（真菌直接鏡檢、真菌培養(yǎng)和鑒定、真菌血清學(xué)檢查、分子生物學(xué)方法）和組織病理學(xué)檢查，其中真菌直接鏡檢操作簡便，可快速報(bào)告結(jié)果，具有重要的臨床價(jià)值[7]。真菌免疫熒光染色是近年來新發(fā)展的一項(xiàng)直接鏡檢方法。既往研究表明真菌免疫熒光染色在淺表真菌感染診斷中具有重要臨床價(jià)值[8-11]，但關(guān)于其在侵襲性真菌病診斷中的應(yīng)用價(jià)值研究不多。本研究以IPFI為例，通過對高度懷疑IPFI 患者的肺泡灌洗液以及血液的檢查結(jié)果進(jìn)行收集、分析統(tǒng)計(jì)，評估真菌熒光染色在侵襲性真菌病中的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2018 年1 月至2021 年12 月寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸與危重癥科收治的高度懷疑侵襲性肺部真菌感染的住院患者資料170 例，其中66 例患者懷疑曲霉菌感染，76 例患者懷疑隱球菌感染，28 例患者考慮其他真菌感染。納入標(biāo)準(zhǔn)：①具有IPFI 高危因素、臨床表現(xiàn)、影像學(xué)特征；②住院期間完成支氣管鏡檢查，并采取肺泡灌洗液；③病例資料完整；④年齡≥18 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①明確為細(xì)菌、真菌感染；②妊娠期、哺乳期；③靜脈滴注白蛋白或免疫球蛋白者；④存在其他可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素。研究共收集患者資料170份，本研究征得患者知情同意，并經(jīng)寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施（倫理學(xué)審批號：KS20224012）。

1.2 標(biāo)本采集

所有患者肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）均為支氣管鏡下采集，具體過程如下：患者無支氣管鏡檢查禁忌，經(jīng)口腔置入氣管鏡，在肺部病變部位進(jìn)行灌洗，灌洗液為滅菌氯化鈉注射液，每次30～50ml，連續(xù)灌洗3～4 次后進(jìn)行回收，回收的灌洗液進(jìn)行送檢。

1.3 檢驗(yàn)方法

1.3.1 真菌免疫熒光染色 取待測BALF 標(biāo)本離心，棄上清液并充分混合沉淀物，取1 滴標(biāo)本均勻涂在潔凈載玻片上，滴加熒光染液1 滴，蓋上蓋玻片，靜置1min 后鏡檢。結(jié)果判讀：鏡下看到亮藍(lán)色真菌菌絲或孢子則判定為陽性，鏡下未找到真菌菌絲或孢子則為陰性。

1.3.2 氫氧化鉀濕片法 標(biāo)本同免疫熒光染色處理后滴加1 滴10%氫氧化鉀溶液，蓋上蓋玻片，酒精燈火焰上微加熱后輕壓蓋玻片，使標(biāo)本透明，顯微鏡下直接觀察。若高倍鏡下觀察到真菌菌絲或孢子則判定為陽性。如果高倍鏡下未找到真菌菌絲或孢子則判定為陰性。

1.3.3 革蘭染色 標(biāo)本同免疫熒光染色處理后取適量涂片，經(jīng)過自然晾干、固定，應(yīng)用革蘭染片儀進(jìn)行革蘭染色，應(yīng)用普通光學(xué)顯微鏡進(jìn)行油鏡下閱片。見到染成紫色的真菌孢子、真菌絲和假菌絲等真菌結(jié)構(gòu)記錄為陽性。

1.3.4 （1,3）-β-D 葡聚糖檢測（G 試驗(yàn)）采集患者清晨空腹肘靜脈血5ml，標(biāo)本預(yù)處理后根據(jù)G 試驗(yàn)試劑盒說明書進(jìn)行具體操作，試驗(yàn)結(jié)果以70pg/ml為陽性臨界值。

1.3.5 半乳甘露聚糖（galactomannan，GM）試驗(yàn) BALF標(biāo)本預(yù)處理后根據(jù)GM 試驗(yàn)試劑盒說明書進(jìn)行具體操作，以待測標(biāo)本的GM 指數(shù)≥0.5 為診斷界值。

1.3.6 隱球菌莢膜多糖抗原檢測 BALF 標(biāo)本預(yù)處理后按照隱球菌莢膜多糖抗原檢測試劑盒（膠體金法）說明書進(jìn)行具體操作。

1.4 IFPI 判定

參照歐洲癌癥研究治療組織、侵襲性真菌感染協(xié)作組等共同修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]，診斷結(jié)果分為確診、擬診、疑診。在本研究中通過結(jié)合患者病史、臨床癥狀體征、影像學(xué)表現(xiàn)、微生物檢測結(jié)果等做出相應(yīng)診斷。將確診和擬診作為真陽性，將疑診及非IPFI 作為真陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（百分比）[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床診斷結(jié)果

170 例患者中，臨床確診IPFI90 例，非IPFI80 例。IPFI 病原體分類及3 種檢測方法所得結(jié)果，見表1。

表1 IFPI 病原體分類及檢測結(jié)果[n（%）]

2.2 BALF 真菌直接鏡檢3 種方法陽性檢出率比較

170 例BALF 標(biāo)本分別進(jìn)行免疫熒光染色、氫氧化鉀濕片法、革蘭染色，結(jié)果顯示，免疫熒光染色的陽性檢出率為34.7%，明顯高于氫氧化鉀濕片法的陽性檢出率12.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=36.10，P＜0.001）；免疫熒光染色的陽性檢出率為34.7%，高于革蘭染色法檢出率4.1%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=50.10，P＜0.001）。

2.3 免疫熒光染色與G 試驗(yàn)檢測結(jié)果及診斷效能比較

170 例高度懷疑IPFI 患者中，有136 例同時(shí)進(jìn)行了BALF 免疫熒光染色及血清G 試驗(yàn)。以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，免疫熒光的敏感度高于血清G 試驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=16.50，P＜0.001），免疫熒光的特異性低于血清 G 試驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.20，P＞0.05），見表2。

表2 熒光染色和G 實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果及診斷效能比較

2.4 真菌熒光染色在不同真菌類型感染中的診斷價(jià)值評估

170 例患者中，高度懷疑侵襲性曲霉病的66 例患者同時(shí)進(jìn)行了BALF 免疫熒光染色以及GM 試驗(yàn)，結(jié)果顯示，免疫熒光染色的敏感度高于GM 試驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.80，P＜0.05），免疫熒光染色的特異性高于GM 試驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.10，P＜0.05），見表3。

表3 免疫熒光染色和GM 實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果及診斷效能比較

2.5 免疫熒光染色與隱球菌莢膜多糖抗原檢測結(jié)果及診斷效能比較

對于高度懷疑隱球菌感染的76 例患者，進(jìn)行隱球菌莢膜多糖抗原檢測和BALF 免疫熒光染色。隱球菌莢膜多糖抗原檢測顯示陽性36 例，免疫熒光染色檢測顯示其中陽性11 例，陰性25 例；隱球菌莢膜多糖抗原檢測顯示陰性40 例，免疫熒光染色檢測顯示其中陽性2 例，陰性38 例。以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算兩種檢測方法的敏感度、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值。結(jié)果顯示，BALF 隱球菌莢膜多糖抗原試驗(yàn)的敏感度明顯高于BALF 免疫熒光染色，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=19.40，P＜0.001）；兩種檢測方法特異性相同，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.50，P＞0.05），見表4。

表4 免疫熒光染色和隱球菌莢膜多糖抗原檢測診斷效能比較（%）

3 討論

近年來，侵襲性真菌病的患病率及死亡率呈持續(xù)上升趨勢，由于其起病隱匿、臨床表現(xiàn)不典型，早期診斷困難[12,13]。目前侵襲性真菌病的確診依靠組織病理學(xué)和（或）無菌標(biāo)本的培養(yǎng)鑒定，但病理組織的獲取往往需要侵入性操作，無菌標(biāo)本的培養(yǎng)與鑒定所需時(shí)間長并且敏感性低，對疾病的盡早診斷、及時(shí)治療帶來了困難[7,12]。

真菌直接鏡檢操作簡單，適用于多種臨床樣本，可快速報(bào)告結(jié)果，為侵襲性真菌病的盡快診斷提供臨床依據(jù)[7]。目前臨床常用真菌鏡檢方法包括免疫熒光染色、氫氧化鉀濕片法、革蘭染色、六銨銀染色等。熒光染色是一種新近發(fā)展的鏡檢方法，可用于各種疑似真菌感染的檢查，其染液中的增白劑能特異性的與真菌細(xì)胞壁中的β-多糖成分結(jié)合，并可吸收一定波長的紫外光，使真菌菌絲和孢子在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)黃綠色或淡藍(lán)色，與背景形成鮮明對比，容易辨認(rèn)真菌形態(tài)，相較于傳統(tǒng)的氫氧化鉀濕片法和革蘭染色，可避免因檢測人員技術(shù)差異而造成的結(jié)果不一致，提高真菌檢測的陽性率。既往熒光染色廣泛用于淺表真菌感染的檢測，近幾年來有不少研究證明熒光染色亦可用于深部真菌感染的檢測，相較于氫氧化鉀濕片法有明顯優(yōu)勢[14,15]。本研究對高度懷疑侵襲性肺部真菌感染患者的肺泡灌洗液進(jìn)行免疫熒光染色、氫氧化鉀濕片法、革蘭染色，結(jié)果提示熒光染色的檢出率與陽性率明顯高于氫氧化鉀濕片法及革蘭染色。

血清學(xué)檢查具有耗時(shí)短、高敏感型和特異性的優(yōu)點(diǎn)，臨床常用的血清學(xué)檢查方法包括G 試驗(yàn)、GM試驗(yàn)、隱球菌莢膜多糖抗原檢測等。（1，3）-β-D-葡聚糖廣泛存在于真菌細(xì)胞壁中，當(dāng)真菌進(jìn)入人體血液或深部組織后，經(jīng)吞噬細(xì)胞處理后（1，3）-β-D-葡聚糖可從細(xì)胞壁釋放出來，從而使其在血液及其他體液中含量升高。本研究顯示真菌熒光染色的靈敏性、陰性預(yù)測值、陽性預(yù)測值均高于G 試驗(yàn)，與既往報(bào)道相符[16]。需要指出的是，本研究中G 試驗(yàn)的靈敏性僅為14.7%，低于既往報(bào)道[17]，考慮原因如下：①在136 例同時(shí)進(jìn)行BALF 免疫熒光和血清G試驗(yàn)的患者中，最終有68 位診斷為IPFI，其中肺隱球菌病36 例。既往觀點(diǎn)認(rèn)為隱球菌細(xì)胞壁外莢膜抑制（1，3）-β-D-葡聚糖的釋放，故G 試驗(yàn)不適合用于隱球菌的檢測，但近來有報(bào)道提示G 試驗(yàn)對隱球菌檢測有應(yīng)用價(jià)值。故本研究進(jìn)行分析時(shí)并未將肺隱球菌病例排除在外。結(jié)合本研究結(jié)果，G 試驗(yàn)是否適用于隱球菌檢測有待進(jìn)一步研究。②造成G 試驗(yàn)假陰性因素較多，如患者存在巨噬細(xì)胞功能缺陷、標(biāo)本保存不規(guī)范等。

GM 試驗(yàn)檢測的是半乳甘露聚糖，其為廣泛存在于曲霉菌和青霉菌細(xì)胞壁的一種多糖，菌絲生長時(shí)半乳甘露聚糖從菌絲頂端釋放，是最早釋放的抗原，故用于侵襲性曲霉病的早期診斷，具有較高的特異性。在本研究中66 位患者同時(shí)進(jìn)行了BALF GM 試驗(yàn)與免疫熒光染色，以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，免疫熒光的敏感度、特異性和陽性預(yù)測值均高于GM 試驗(yàn)。隱球菌莢膜多糖抗原通過檢測隱球菌的莢膜莢膜多糖類物質(zhì)對隱球菌進(jìn)行檢測，具有較高的敏感度與特異性，本研究結(jié)果顯示其敏感度明顯高于免疫熒光染色。

綜上所述，相較于氫氧化鉀濕片法以及革蘭染色，真菌菌絲以及孢子經(jīng)熒光染色后，輪廓清楚，易于識別，提高了真菌的檢出率及陽性率。此外熒光染色能清楚辨別部分真菌的形態(tài)，如毛霉、曲霉、接合菌等，可在早期提供形態(tài)學(xué)診斷，彌補(bǔ)了真菌培養(yǎng)時(shí)間長的缺點(diǎn)。相較于常用的血清學(xué)檢測方法，免疫熒光染色亦有相當(dāng)高的診斷效能。但免疫熒光染色無法排除定值真菌，所以仍需要結(jié)合其他檢測方法協(xié)助侵襲性真菌病的診斷。