厚樸排氣合劑主要藥效成分在不同種屬動(dòng)物血漿中蛋白結(jié)合率的比較Δ

郭明鑫，范文韜吳霞，沈穎胡志強(qiáng)（.江蘇大學(xué)附屬宜興醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 宜興 400；.廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心，廣州 50006）

厚樸排氣合劑由厚樸、枳實(shí)、木香、大黃組成，具有和中理氣、行氣消脹的功效，主要用于腹部非胃腸吻合術(shù)后早期腸麻痹的輔助治療[1]。目前，該合劑可用于恢復(fù)患者術(shù)后胃腸道功能和治療功能性便秘、腸麻痹等癥[2]。有研究指出，厚樸排氣合劑中厚樸酚含量最高，約占總成分含量的90%，和厚樸酚次之，同時(shí)還有少量的大黃素和大黃酚；其中，厚樸酚、和厚樸酚能促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，是厚樸排氣合劑的主要藥效成分[3-4]。

血漿蛋白結(jié)合率會(huì)直接影響體內(nèi)游離藥物的濃度，從而影響藥物的吸收、分布、代謝和消除，最終影響其藥效學(xué)特征[5-6]。考慮到厚樸排氣合劑單次給藥劑量較大、相關(guān)不良反應(yīng)較多[7]，故有必要對(duì)其主要藥效成分的血漿蛋白結(jié)合率進(jìn)行測(cè)定，以有助于研究該合劑的體內(nèi)代謝過程，促進(jìn)臨床合理用藥?；诖?，本研究擬采用超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）技術(shù)結(jié)合平衡透析法測(cè)定厚樸排氣合劑主要藥效成分厚樸酚、和厚樸酚在牛、兔、大鼠血漿中的蛋白結(jié)合率并進(jìn)行比較，旨在為闡明該合劑有效成分的血漿蛋白結(jié)合特性提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括API 5500型UPLC-MS/MS系統(tǒng)（美國(guó)AB Sciex公司）、BP210D型萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)Sartorius公司）、20HR型高速冷凍離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司）、ZH-2型渦旋振蕩儀（上海精勝科學(xué)儀器有限公司）、MG-2200型氮吹儀（上海愛郎儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

厚樸排氣合劑（批號(hào)20080601，每1 mL相當(dāng)于飲片0.8 g）購(gòu)自瑞陽(yáng)制藥股份有限公司；厚樸酚對(duì)照品（批號(hào)110729-201910，純度99.0%）、和厚樸酚對(duì)照品（批號(hào)110730-201910，純度99.8%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；牛血漿（批號(hào)J28S10S99034）、兔血漿（批號(hào)J10O10S99437）、磷酸鹽 緩沖液（pH7.2～7.4，批號(hào)8121556）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；大鼠血漿采自SPF級(jí)SD大鼠（雌雄各半）；透析袋（截留分子量1 kDa）購(gòu)自廣州瑞舒生物科技有限公司；甲醇、乙腈、甲酸為質(zhì)譜純，其余試劑均為分析純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 空白透析液 取磷酸鹽緩沖液，加水稀釋并定容至500 mL，作為空白透析液，于4 ℃下保存，備用。

2.1.2 含藥透析液 分別取厚樸排氣合劑適量，加至“2.1.1”項(xiàng)下空白透析液中，混勻，得質(zhì)量濃度分別為4.5、9.0、13.5 μg/mL（按飲片質(zhì)量計(jì)）的含藥透析液。

2.1.3 混合工作液和質(zhì)控樣品 精密稱定厚樸酚、和厚樸酚對(duì)照品適量，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成混合對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取上述混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1.00、0.80、0.64、0.36、0.28、0.10、0.03 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，混勻，配制成厚樸酚質(zhì)量 濃 度 分 別 為 11.38、22.76、45.52、91.04、136.56、182.08、227.60 μg/mL，和厚樸酚質(zhì)量濃度分別為3.90、7.80、15.60、31.20、46.80、62.40、78.00 μg/mL的系列混合工作液。精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加入空白血漿，配制成厚樸酚質(zhì)量濃度分別為1.14、2.28、9.10、18.21 μg/mL，和厚樸酚質(zhì)量濃度分別為0.39、0.78、3.12、6.24 μg/mL的質(zhì)控樣品。上述溶液均于4 ℃下保存，備用。

2.2 樣品預(yù)處理方法

2.2.1 透析內(nèi)液 吸取平衡透析實(shí)驗(yàn)中的透析內(nèi)液200 μL，置于1.5 mL EP管中，加入乙腈600 μL沉淀蛋白，渦旋振蕩3 min后以12 000 r/min離心10 min。取上清液，以氮?dú)饬鞔蹈桑瑲堅(jiān)眉状?00 μL復(fù)溶，渦旋振蕩3 min后以12 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)樣測(cè)定。

2.2.2 透析外液 吸取平衡透析實(shí)驗(yàn)中的透析外液200 μL，置于1.5 mL EP管中，以12 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)樣測(cè)定。

2.3 色譜與質(zhì)譜條件

以ACQUITY UPLC BEH-C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）為色譜柱，以乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～3 min，65%A→75%A）；流速為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為2 μL。

采用電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），以選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（selective reaction monitoring，SRM）模式進(jìn)行負(fù)離子掃描；離子傳輸管溫度為325 ℃；氣化室溫度為350 ℃；電噴霧電壓為3 kV；鞘氣流速為50 Arb；輔助氣流速為10 Arb；離子掃描范圍為m/z50→1 500。用于定量分析的離子對(duì)分別為m/z264.4→247.1、244.9（厚樸酚，去簇電壓分別為-116、-110 V，碰撞電壓分別為-31、-34 V）和m/z264.4→246.9、223.1（和厚樸酚，去簇電壓分別為-110、-100 V，碰撞電壓分別為-28、-40 V）。

2.4 方法學(xué)考察

依照2020年版《中國(guó)藥典》（四部）（以下簡(jiǎn)稱“藥典”）通則“生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”的相關(guān)要求進(jìn)行方法學(xué)考察[8]。

2.4.1 專屬性試驗(yàn) 分別取空白血漿、空白血漿+混合對(duì)照品溶液（厚樸酚、和厚樸酚的最終質(zhì)量濃度分別為2.28、0.78 μg/mL）、平衡透析實(shí)驗(yàn)的透析內(nèi)液樣品（9.0 μg/mL含藥透析液平衡透析24 h后所得），按照“2.2.1”項(xiàng)下方法處理后，再按照“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，在上述條件下，厚樸酚、和厚樸酚色譜峰峰形良好，其保留時(shí)間分別約為1.3、1.0 min；血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)不會(huì)對(duì)上述成分的定量測(cè)定產(chǎn)生干擾。結(jié)果見圖1（因不同種屬血漿樣品的色譜圖基本一致，故以空白牛血漿+混合對(duì)照品、牛血漿透析內(nèi)液樣品的色譜圖作為代表）。

圖1 厚樸酚、和厚樸酚專屬性試驗(yàn)的典型SRM圖

2.4.2 樣本殘留考察 本研究通過測(cè)定較高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品（厚樸酚、和厚樸酚的質(zhì)量濃度分別為18.21、6.24 μg/mL）來(lái)驗(yàn)證是否有殘留。結(jié)果顯示，測(cè)定高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品后，空白血漿樣品中的殘留不超過定量下限的20%，符合藥典相關(guān)要求[8]。

2.4.3 線性關(guān)系和定量下限考察 分別精密量取系列混合工作液10.00 μL，加至空白牛、兔、大鼠血漿90 μL中，得厚樸酚質(zhì)量濃度分別為 1.14、2.28、4.56、9.12、13.65、18.24、22.76 μg/mL，和厚樸酚質(zhì)量濃度分別為0.39、0.78、1.56、3.12、4.68、6.24、7.80 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法處理后，再按照“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分峰面積為縱坐標(biāo)（y）、其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線性回歸（權(quán)重系數(shù)為1/x2），分別擬合得厚樸酚、和厚樸酚的回歸方程，并以線性范圍下限作為定量下限。結(jié)果見表1。

表1 不同基質(zhì)中厚樸酚、和厚樸酚定量分析的回歸方程與線性范圍

2.4.4 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn) 按照“2.1.3”項(xiàng)下方法配制低、中、高質(zhì)量濃度（厚樸酚2.28、9.10、18.21 μg/mL，和厚樸酚0.78、3.12、6.24 μg/mL，下同）和定量下限質(zhì)量濃度（厚樸酚1.14 μg/mL、和厚樸酚0.39 μg/mL，下同）的質(zhì)控樣品，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法處理后，再按照“2.3”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積，考察日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定3 d，考察日間精密度。以實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度的相對(duì)誤差（relative error，RE）來(lái)表示準(zhǔn)確度。結(jié)果（表2）顯示，定量下限及低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品的日內(nèi)、日間RSD和RE的絕對(duì)值均在5%以內(nèi)，符合藥典相關(guān)要求[8]。

表2 不同血漿中厚樸酚、和厚樸酚定量分析的精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

2.4.5 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn) 按照“2.1.3”項(xiàng)下方法配制低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，每質(zhì)量濃度平行6份。按照“2.2.1”項(xiàng)下方法處理后，再按照“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄待測(cè)成分的峰面積（As）。分別取適量空白血漿，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法處理后，加入適量某質(zhì)量濃度混合工作液，配制成相應(yīng)質(zhì)量濃度（與低、中、高質(zhì)量濃度相同）的待測(cè)樣品，每質(zhì)量濃度平行6份，按照“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄待測(cè)成分的峰面積（As’）。按照“2.1.3”項(xiàng)下方法操作，以甲醇代替空白血漿，平行配制6份低、中、高質(zhì)量濃度的待測(cè)樣品，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法操作后，再按照“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄待測(cè)成分的峰面積（Bs）。提取回收率=As/As’×100%；基質(zhì)效應(yīng)=As’/Bs×100%。結(jié)果見表3。

表3 不同血漿中厚樸酚、和厚樸酚定量分析的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果（±s，n＝6，%）

表3 不同血漿中厚樸酚、和厚樸酚定量分析的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果（±s，n＝6，%）

待測(cè)成分厚樸酚理論質(zhì)量濃度/（μg/mL）2.28 9.10 18.21 0.78 3.12 6.24提取回收率基質(zhì)效應(yīng)牛血漿98.65±0.44 97.98±0.47 98.57±0.33 98.37±0.62 98.05±0.53 98.20±1.04兔血漿96.17±0.32 96.81±0.47 95.74±2.28 97.02±1.03 96.87±0.52 97.19±0.61和厚樸酚大鼠血漿97.77±0.33 98.46±0.48 97.69±0.44 98.67±1.04 98.52±0.53 98.84±0.62牛血漿97.02±3.42 93.18±3.94 97.33±3.63 94.83±2.18 94.03±3.18 95.86±2.57兔血漿97.20±2.97 95.08±2.34 96.51±1.84 95.32±2.45 93.04±2.84 100.28±3.85大鼠血漿98.65±1.46 97.08±1.76 98.05±2.28 95.46±1.48 95.79±1.67 96.97±2.28

2.4.6 稀釋可靠性考察 在實(shí)際測(cè)定時(shí)，往往會(huì)遇到個(gè)別樣品質(zhì)量濃度超過線性范圍上限的情況，為了不影響實(shí)驗(yàn)的精密度和準(zhǔn)確度，本研究向空白血漿中加入適量的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，配制成厚樸酚、和厚樸酚質(zhì)量濃度分別為227.60、78.00 μg/mL的樣品溶液，用空白血漿稀釋10倍后，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法處理，再按照“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算待測(cè)成分的變異系數(shù)。結(jié)果顯示，厚樸酚、和厚樸酚的變異系數(shù)分別為1.13%、0.88%，符合藥典相關(guān)要求[8]。

2.4.7 樣品穩(wěn)定性考察 按照“2.1.3”項(xiàng)下方法配制低、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，每質(zhì)量濃度平行6份?？疾鞓悠肥覝胤胖? h、反復(fù)凍融（-80 ℃～室溫）3次、-80 ℃放置6個(gè)月、按照“2.2.1”項(xiàng)下方法處理后在自動(dòng)進(jìn)樣器中放置24 h、按照“2.2.1”項(xiàng)下方法處理后室溫放置6 h的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，上述樣品中各待測(cè)成分色譜峰峰面積的RSD均小于1%（n=6），符合藥典相關(guān)要求[8]。

2.5 平衡透析試驗(yàn)

將透析袋剪成長(zhǎng)約8 cm的小段，以0.01 mol/L碳酸氫鈉溶液活化后，用水洗凈，置于空白透析液中，于4 ℃下保存，備用。取活化后的透析袋，用棉線結(jié)扎一端使不漏液，精密量取牛、兔、大鼠血漿1 mL（即透析內(nèi)液），分別置于透析袋中，將袋口扎緊。將透析袋分別浸沒于裝有質(zhì)量濃度為4.5、9.0、13.5 μg/mL含藥透析液8 mL的離心管中，調(diào)節(jié)透析袋內(nèi)外液面，使兩者保持在同一水平并盡量避免透析袋接觸到離心管壁，放入37 ℃恒溫箱中平衡透析24 h。待平衡透析結(jié)束后，取少量透析外液加至10%高氯酸溶液0.5 mL中以檢查是否有血漿滲漏（產(chǎn)生白色沉淀者作廢）。取透析內(nèi)液和透析外液，分別按照“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下方法處理后，再按照“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)成分的質(zhì)量濃度，并按下式計(jì)算血漿蛋白結(jié)合率：血漿蛋白結(jié)合率（%）=（c內(nèi)-c外）/c內(nèi)×100%（式中，c內(nèi)、c外分別表示透析內(nèi)、外液中待測(cè)成分的質(zhì)量濃度）。每質(zhì)量濃度平行3次。使用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。結(jié)果見表4。

表4 不同血漿中厚樸酚、和厚樸酚的蛋白結(jié)合率測(cè)定結(jié)果（n＝3，%%）

由表4可見，在相同種屬的血漿樣品中，厚樸酚、和厚樸酚的蛋白結(jié)合率均隨含藥透析液質(zhì)量濃度的增加而升高，有一定的濃度依賴趨勢(shì)（P＜0.05或P＜0.01）。在相同質(zhì)量濃度的含藥透析液中，大鼠、兔血漿樣品中厚樸酚、和厚樸酚的蛋白結(jié)合率與牛血漿樣品比較，差異大多具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），且在9.0、13.5 μg/mL的含藥透析液中，兔血漿樣品中和厚樸酚的蛋白結(jié)合率均顯著高于牛血漿樣品（P＜0.01）。

3 討論

3.1 色譜與質(zhì)譜條件、樣品前處理方法優(yōu)化

本研究應(yīng)用了UPLC-MS/MS技術(shù)，該技術(shù)分離效果佳、靈敏度高、穩(wěn)定性好，具有較高的選擇性和特異性，可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)[9]。本課題組前期發(fā)現(xiàn)，與甲醇-水流動(dòng)相體系相比，乙腈-水流動(dòng)相體系的系統(tǒng)壓力更低；在水相中加入適量的甲酸，可保證色譜峰峰形較好。本課題組前期比較了待測(cè)成分在不同粒徑、不同長(zhǎng)度及內(nèi)徑的色譜柱上的分離效果，最終選擇ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）作為色譜柱進(jìn)行分析。本研究采用了ESI，可用于準(zhǔn)確測(cè)定待測(cè)成分的分子離子峰；此外，本研究進(jìn)一步對(duì)離子傳輸管溫度、氣化室溫度、去簇電壓、碰撞電壓等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定了“2.3”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件。本研究樣品前處理采用了蛋白沉淀法，該方法操作簡(jiǎn)單且重現(xiàn)性好；同時(shí)，血漿樣品經(jīng)蛋白沉淀、離心后的上清液以氮?dú)饬鳚饪s富集，可避免待測(cè)樣品被沉淀劑（乙腈）稀釋。

3.2 血漿蛋白結(jié)合率檢測(cè)方法選擇及結(jié)果分析

藥物血漿蛋白結(jié)合率的常用研究方法包括平衡透析法、超濾法、超速離心法、高效親和色譜法、高效毛細(xì)管電泳前沿分析法等[10-11]。本研究采用了經(jīng)典的平衡透析法，該法經(jīng)濟(jì)，受外界環(huán)境影響小，結(jié)果穩(wěn)定、可靠[11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，透析袋吸附率的變異系數(shù)均小于1.00%，不影響蛋白結(jié)合率的測(cè)定；隨著透析時(shí)間的延長(zhǎng)，各待測(cè)成分的血漿蛋白結(jié)合率亦不斷增大，其在相鄰時(shí)間點(diǎn)（平衡透析24、48 h）的血漿蛋白結(jié)合率并無(wú)明顯差異，故將平衡透析時(shí)間設(shè)為24 h。同時(shí)，參考人體溫度，將平衡透析溫度設(shè)為37 ℃。

含藥透析液質(zhì)量濃度是根據(jù)有效劑量下所測(cè)血藥濃度而定，需覆蓋常規(guī)劑量下的血藥濃度范圍[12]，故本研究將含藥透析液質(zhì)量濃度設(shè)為4.5、9.0、13.5 μg/mL。結(jié)果表明，在相同種屬血漿中，厚樸酚、和厚樸酚的蛋白結(jié)合率均隨含藥透析液質(zhì)量濃度的增加而升高；在相同質(zhì)量濃度的含藥透析液中，大鼠、兔血漿樣品中厚樸酚、和厚樸酚的蛋白結(jié)合率與牛血漿樣品有所不同，且兔血漿樣品中和厚樸酚的蛋白結(jié)合率（9.0、13.5 μg/mL的含藥透析液）顯著高于牛血漿樣品。筆者認(rèn)為，透析內(nèi)液和外液間的透析擴(kuò)散動(dòng)力來(lái)源于透析袋兩側(cè)待測(cè)成分的濃度差，中、低質(zhì)量濃度含藥透析液中各待測(cè)成分與血漿蛋白的結(jié)合程度較低且尚未達(dá)到飽和，而高質(zhì)量濃度含藥透析液中各待測(cè)成分具有較高的擴(kuò)散動(dòng)力，故其血漿蛋白結(jié)合率較高[13]。同時(shí)，厚樸酚與和厚樸酚均為弱酸性成分，多與血漿白蛋白共價(jià)結(jié)合，在每100毫升牛、兔、大鼠血漿中，分別含白蛋白4.1、3.8、1.68 g[14]，提示牛和兔血漿中可能含有更多的結(jié)合型成分，這可能是造成2種待測(cè)成分蛋白結(jié)合率存在種屬差異的主要原因。研究指出，人體正常血漿白蛋白一般為35～50 g/L[14]，可推測(cè)厚樸排氣合劑主要藥效成分在人血漿中的蛋白結(jié)合率較高，臨床應(yīng)用時(shí)應(yīng)避免與其他高血漿蛋白率藥物聯(lián)用，以防止不良反應(yīng)的發(fā)生，但仍需相關(guān)研究予以證實(shí)。

綜上所述，本研究成功建立了測(cè)定厚樸排氣合劑主要藥效成分在牛、兔、大鼠血漿中蛋白結(jié)合率的方法，并比較了不同種屬血漿蛋白結(jié)合率的差異。結(jié)果顯示，厚樸酚、和厚樸酚在牛、兔、大鼠血漿中的蛋白結(jié)合率有明顯的種屬差異，且有一定的濃度依賴趨勢(shì)。