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    基于復(fù)合酶制劑抑菌的糖蜜無酸發(fā)酵酒精技術(shù)的研究

    2022-12-29 07:01:36尚紅巖楊鳳婷張洛銚殷德運(yùn)鄭子鑫陳秀麗鄭毅鋒付金億黃澤彬鐘靖琪曹嘉亮
    甘蔗糖業(yè) 2022年5期
    關(guān)鍵詞:發(fā)酵酒糖蜜溶菌酶

    尚紅巖,楊鳳婷,張洛銚,殷德運(yùn),鄭子鑫,陳秀麗,鄭毅鋒,付金億,黃澤彬,鐘靖琪,曹嘉亮

    (1廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)學(xué)院,廣東廣州 510300;2廣東省科學(xué)院南繁種業(yè)研究所,廣東廣州 510316)

    0 前言

    糖蜜是制糖副產(chǎn)物,富含蔗糖和還原糖,是發(fā)酵酒精最經(jīng)濟(jì)的原料之一[1]。但糖蜜原料中還含有灰分、膠體和雜菌等,會抑制酵母繁殖和發(fā)酵,容易造成發(fā)酵感染雜菌,使發(fā)酵酒精濃度降低,揮發(fā)酸升高,影響發(fā)酵產(chǎn)酒率,發(fā)酵前必須盡可能排除這些雜質(zhì)[2]。傳統(tǒng)糖蜜發(fā)酵酒精通過添加硫酸調(diào)節(jié)pH值來抑制雜菌,容易造成設(shè)備腐蝕、結(jié)垢和環(huán)境污染等問題[3]。以果膠酶、蛋白酶和溶菌酶等復(fù)合酶制劑用于糖蜜酒精發(fā)酵,一方面溶菌酶可以殺滅細(xì)菌,但對酵母沒有殺滅作用,因此,可以替代硫酸實現(xiàn)無酸發(fā)酵。另一方面在蛋白酶、果膠酶等多種酶制劑協(xié)同作用下,將糖蜜中膠體、蛋白質(zhì)等水解為酵母可以利用的糖和氨基酸等,有利于提高產(chǎn)酒率。另外,氨基酸等還可以增加酵母營養(yǎng),提高酵母細(xì)胞密度,以酵母生長優(yōu)勢抑制雜菌,同時可以降低發(fā)酵液黏度,減少泡沫及避免蒸餾塔結(jié)垢,有利于節(jié)能減排[4-8]。

    本文通過對糖蜜原料的無酸澄清后添加復(fù)合酶制劑到糖蜜中,進(jìn)行酵母培養(yǎng)和連續(xù)發(fā)酵酒精,經(jīng)過連續(xù)發(fā)酵,測定其中的還原糖、揮發(fā)酸、酒分含量。糖蜜酒精發(fā)酵中分別添加果膠酶、木瓜蛋白酶和溶菌酶進(jìn)行單因素試驗,研究3種酶的最適添加濃度;接著通過正交實驗優(yōu)化復(fù)合酶制劑添加量,研究最佳添加濃度組合。

    1 材料與方法

    1.1 原料及試劑

    糖蜜,廣西糖業(yè)集團(tuán)有限公司;果膠酶100000 U/g,河南林博生物科技有限公司;溶菌酶2000 U/g、葡萄糖氧化酶30000 U/g,廣州瑟燁生物科技有限公司;木瓜蛋白酶30000 U/g、纖維素酶30000 U/g,河南萬邦實業(yè)有限公司;釀酒活性干酵母,廣西丹寶利酵母有限公司;過磷酸鈣、硫酸銨、碘液、酚酞等均為分析純,廣州化學(xué)試劑廠;濃硫酸,重慶長鵬化工有限公司;氫氧化鈉,天津華東試劑廠。

    1.2 主要儀器

    UV-520紫外可見分光光度計,上海元析儀器有限公司;PHS-3精密酸度計,上海大普儀器有限公司;FA224電子分析天平,上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;DK-98-II電熱恒溫水浴鍋,鄭州長城科工貿(mào)有限公司;98-1-C數(shù)顯控溫電熱套,天津市泰斯特儀器有限公司;YX-280型手提壓力蒸汽滅菌鍋,廣州越特科學(xué)儀器有限公司;101-3AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱,天津市泰斯特儀器有限公司;DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海恒科科學(xué)儀器有限公司;酒精濃度計,河北省武強(qiáng)縣同輝儀表廠;移液槍,濟(jì)南歐萊博技術(shù)有限公司。

    1.3 糖蜜發(fā)酵酒精工藝流程

    糖蜜發(fā)酵酒精工藝流程如圖1所示。

    圖1 糖蜜發(fā)酵酒精工藝流程

    1.4 試驗方法和步驟

    1.4.1 糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)基制備

    糖蜜加水稀釋到50°Bx,加過磷酸鈣0.3%,硫酸銨 0.6%,加熱不斷攪拌至 80~85℃,自然沉降30 min,離心分離排除沉降物。再加水稀釋到25°Bx,加入0.2%尿素,制成發(fā)酵培養(yǎng)基,降溫到31℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.4.2 酵母液制備

    稱取發(fā)酵培養(yǎng)基0.5%活性干酵母,加入20 mL 30℃無菌水活化10 min,制成酵母液。

    1.4.3 糖蜜發(fā)酵酒精酶制劑添加濃度單因素實驗

    分別量取發(fā)酵培養(yǎng)基250 mL于錐形瓶中,接種活化好的酵母液,分別加入果膠酶(10、15、20、25 U/g),木瓜蛋白酶(12、16、20、24 U/g),溶菌酶(12、16、20、24 U/g),進(jìn)行單因素實驗,分別置于生化培養(yǎng)箱中,31℃/140 r搖床培養(yǎng)48 h,發(fā)酵結(jié)束檢測并記錄發(fā)酵前后發(fā)酵液糖錘度、酒精濃度、揮發(fā)酸和殘?zhí)呛俊?/p>

    1.4.4 正交實驗優(yōu)化酶制劑添加量

    在單因素實驗基礎(chǔ)上對果膠酶、木瓜蛋白酶、溶菌酶做3因素3水平正交實驗,如表1所示,以發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵成熟醪酒精濃度、揮發(fā)酸和殘?zhí)菫楹饬繀?shù),優(yōu)化復(fù)合酶制劑的最佳添加濃度。

    表1 糖蜜發(fā)酵復(fù)合酶正交實驗表

    1.5 檢測方法

    1.5.1 糖錘度的測定

    糖錘度的測定參考《甘蔗糖蜜酒精生產(chǎn)檢驗方法》中的糖錘度計法[9]。

    1.5.2 酒精度的測定

    酒精度的測定采用蒸餾-酒度計法。具體操作步驟為:量筒量取100 mL發(fā)酵液,放入蒸餾燒瓶內(nèi),用100 mL蒸餾水沖洗量筒,也放入蒸餾燒瓶內(nèi),蒸餾并收集餾出液100 mL,用酒度計測定餾出液酒精濃度。

    1.5.3 揮發(fā)酸的測定

    采用堿液滴定法測定發(fā)酵蒸餾酒液的揮發(fā)酸。具體操作步驟為:取步驟 1.5.2節(jié)的酒精餾出液 50 mL,加入 0.1%酚酞指示劑 2~3滴,用 0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液呈微紅色在30 s不消失為止,記錄消耗NaOH溶液的毫升數(shù)。

    1.5.4 殘還原糖的測定

    采用 3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS法)測定殘還原糖的含量[10]。

    1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

    每組實驗重復(fù) 3次,實驗結(jié)果取平均值,用Excel軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計和繪圖,SPSS 19.0進(jìn)行正交實驗數(shù)據(jù)分析。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 不同果膠酶添加量對發(fā)酵的影響

    高濃度糖蜜中膠體等粘性物質(zhì)較多,果膠是以半乳糖醛酸為主的復(fù)合多糖類物質(zhì),高濃發(fā)酵時醪液的粘度很大,給酒精的濃醪發(fā)酵帶來困難。本文分別選擇果膠酶不同添加量,以發(fā)酵成熟醪錘度、酒精濃度、殘?zhí)呛蛽]發(fā)酸作為衡量指標(biāo),研究果膠酶最適添加量。結(jié)果如表2和圖2~5所示。

    表2 不同果膠酶添加量對發(fā)酵的影響

    從表2和圖2~5可以看出,隨著果膠酶添加量的增加,發(fā)酵后錘度不斷降低,發(fā)酵含酒分升高,殘?zhí)呛蛽]發(fā)酸不斷降低。當(dāng)果膠酶添加量為15 U/g時,發(fā)酵效果相對最好,發(fā)酵后錘度最低,發(fā)酵酒分最高,殘?zhí)欠肿畹?。這是由于糖蜜中的果膠在果膠酶的作用下,切斷果膠分子的α-1,4糖苷鍵,分解成半乳糖醛酸和還原糖等小分子糖[11],可顯著降低醪液粘度,增加可發(fā)酵糖的含量,提高發(fā)酵酒精濃度。果膠酶添加量15 U/g為最適添加量。

    圖2 果膠酶添加量對發(fā)酵錘度的影響

    圖3 果膠酶添加量對發(fā)酵酒度的影響

    圖4 果膠酶添加量對發(fā)酵殘?zhí)堑挠绊?/p>

    圖5 果膠酶添加量對發(fā)酵揮發(fā)酸的影響

    2.2 不同木瓜蛋白酶添加量對發(fā)酵的影響

    糖蜜中含有一定量的蛋白質(zhì)(包括微生物菌體細(xì)胞),蛋白酶可將蛋白質(zhì)水解為氨基酸,酵母可以利用氨基酸作為氮源合成細(xì)胞。分別選擇木瓜蛋白酶不同添加量,以發(fā)酵成熟醪錘度、酒精濃度、殘?zhí)呛蛽]發(fā)酸作為測定指標(biāo),研究木瓜蛋白酶最適添加量。結(jié)果如表3和圖6~9所示。

    從表3和圖6~9可以看出,隨著木瓜蛋白酶添加量的增加,發(fā)酵后錘度不斷降低,發(fā)酵含酒分升高,殘?zhí)呛蛽]發(fā)酸不斷降低,當(dāng)木瓜蛋白酶添加量為16 U/g發(fā)酵效果相對最好,發(fā)酵后錘度最低,發(fā)酵酒分最高,殘?zhí)欠肿畹?,發(fā)酵最徹底。酵母利用蛋白酶分解的氨基酸作為氮源合成細(xì)胞,使酵母細(xì)胞密度提高,以生長優(yōu)勢抑制雜菌[12],因此,提高了發(fā)酵酒分,降低了細(xì)菌代謝產(chǎn)生的揮發(fā)酸。木瓜蛋白酶添加量16 U/g為最適添加量。

    表3 不同木瓜蛋白酶添加量對發(fā)酵的影響

    圖6 木瓜蛋白酶添加量對發(fā)酵錘度的影響

    圖7 木瓜蛋白酶添加量對發(fā)酵酒度的影響

    圖8 木瓜蛋白酶添加量對發(fā)酵殘?zhí)堑挠绊?/p>

    圖9 木瓜蛋白酶添加量對發(fā)酵揮發(fā)酸的影響

    2.3 不同溶菌酶添加量對發(fā)酵的影響

    糖蜜中含有少量的微生物菌體細(xì)胞,發(fā)酵過程中也可能感染細(xì)菌,溶菌酶可將細(xì)菌細(xì)胞分解,本實驗分別選擇溶菌酶不同添加量,以發(fā)酵成熟醪錘度、酒精濃度、殘?zhí)呛蛽]發(fā)酸作為測定指標(biāo),研究溶菌酶最適添加量。結(jié)果如表4和圖10~13所示。

    從表4和圖10~13可以看出來隨著溶菌酶添加量的增加,發(fā)酵后錘度不斷降低,發(fā)酵含酒分升高,殘?zhí)呛蛽]發(fā)酸不斷降低,當(dāng)溶菌酶添加量為20 U/g時發(fā)酵后錘度最低,發(fā)酵酒分最高,殘?zhí)欠肿畹?,發(fā)酵效果相對最好,發(fā)酵最徹底,溶菌酶添加量20 U/g為溶菌酶最適添加量。原因是溶菌酶可將發(fā)酵液中細(xì)菌細(xì)胞分解,直接殺滅雜菌,細(xì)菌分解產(chǎn)物氨基酸作為氮源合成酵母細(xì)胞,有利于提高酵母細(xì)胞密度,進(jìn)一步抑制雜菌[12]。

    表4 不同溶菌酶添加量對發(fā)酵的影響

    圖10 溶菌酶添加量對發(fā)酵錘度的影響

    圖11 溶菌酶添加量對發(fā)酵酒度的影響

    圖12 溶菌酶添加量對殘?zhí)欠值挠绊?/p>

    圖13 溶菌酶添加量對揮發(fā)酸的影響

    2.4 糖蜜發(fā)酵酒精復(fù)合酶添加量優(yōu)化正交試驗分析

    糖蜜發(fā)酵酒精優(yōu)化復(fù)合酶添加量3因素3水平正交試驗 L9(33)結(jié)果見表 5。由實驗結(jié)果可知,A2B2C3組合的發(fā)酵酒度最高為 9.72%。由極差R大小分析,確定各因素對發(fā)酵酒度的影響主次順序為:A>C>B,即果膠酶對發(fā)酵酒精度的影響最顯著,溶菌酶次之,木瓜蛋白酶影響最?。灰跃凭珴舛葹橹饕u價指標(biāo)各因素最優(yōu)組合為 A3B2C3。用最優(yōu)因素組合A3B2C3進(jìn)行了3次平行驗證試驗,實驗結(jié)果如表6所示,發(fā)酵酒度的平均值為9.96%,比實驗系號5提高了2.45%,因此選擇A3B2C3為糖蜜無酸發(fā)酵各種酶制劑最佳配比,即果膠酶添加量為20 U/g,木瓜蛋白酶添加量為16 U/g,溶菌酶添加量為24 U/g。

    表5 糖蜜發(fā)酵酒精優(yōu)化復(fù)合酶添加量正交試驗L9(33)

    表6 正交實驗最優(yōu)組合驗證發(fā)酵試驗

    3 結(jié)論與討論

    本研究首先對糖蜜進(jìn)行無酸澄清處理配制成發(fā)酵培養(yǎng)基,然后接種活化的干酵母,分別添加不同濃度的果膠酶、木瓜蛋白酶、溶菌酶進(jìn)行單因素試驗,果膠酶濃度在15 U/g,木瓜蛋白酶濃度在16 U/g,溶菌酶濃度在20 U/g時,發(fā)酵效果相對最好,即發(fā)酵后錘度最低,酒度最高,殘?zhí)呛蛽]發(fā)酸也最低。進(jìn)一步通過 L9(33)正交試驗優(yōu)化復(fù)合酶添加量,以發(fā)酵酒度作為評價指標(biāo),最優(yōu)組合為 A3B2C3,即果膠酶添加量20 U/g,木瓜蛋白酶添加量為16 U/g,溶菌酶添加量為24 U/g,對應(yīng)發(fā)酵酒度的為9.96%,比添加上述單種酶最高酒度分別提高了 3.75%、11.91%、2.68%。糖蜜發(fā)酵酒精中添加果膠酶、木瓜蛋白酶和溶菌酶等復(fù)合酶制劑代替硫酸抑制雜菌,能明顯提高發(fā)酵成熟醪液酒精濃度。隨著制糖提糖技術(shù)的提高,作為副產(chǎn)物糖蜜中的膠體、灰分和雜菌的含量不斷增高[8],以果膠酶、蛋白酶和溶菌酶等酶制劑代替硫酸對糖蜜進(jìn)行澄清處理后發(fā)酵,將能取得更好的發(fā)酵效果,同時能降低酒精添加硫酸對生產(chǎn)設(shè)備和環(huán)境的危害,有利于糖蜜酒精生產(chǎn)企業(yè)減排增效。

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