溴莫尼定在大鼠面神經(jīng)夾挫傷損傷修復(fù)中的作用研究和機(jī)制探討

李立恒 蔡晶 嚴(yán)強(qiáng) 劉虹 韓月臣*

1湖州市中心醫(yī)院（湖州師范學(xué)院附屬中心醫(yī)院）耳鼻喉科（湖州 313099）

2山東省耳鼻喉醫(yī)院耳鼻喉研究所（濟(jì)南 250023）

3湖州市智能數(shù)字精準(zhǔn)外科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湖州 313002）

周圍性面癱是臨床上常見疾病，其發(fā)病原因包括外傷，感染，炎癥反應(yīng)，病毒等。其中外傷造成面神經(jīng)損傷的關(guān)鍵原因之一。面神經(jīng)是第七對(duì)腦神經(jīng)，屬于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)為主的混合神經(jīng)，支配面部表情肌作用[1]。當(dāng)其出現(xiàn)損傷后，患者會(huì)出現(xiàn)額紋消失、鼻唇溝變淺等面癱的癥狀。同時(shí)面神經(jīng)損傷的修復(fù)與再生過程復(fù)雜。研究表明[2]面神經(jīng)損傷的修復(fù)可能與腦組織神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌水平相關(guān)。目前臨床上主要通過激素類藥物，全身或局部應(yīng)用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，干細(xì)胞治療、針灸等治療手段對(duì)周圍性面癱進(jìn)行治療[3]。

溴莫尼定(Brimonidine)，屬于α-2-ARs高度選擇性激動(dòng)劑，是臨床青光眼治療的一線藥物，具有穩(wěn)定且顯著的降眼壓治療效果[4]。同時(shí)其對(duì)耳神經(jīng)的損傷也有一定的修復(fù)作用[5]。本研究通過對(duì)溴莫尼定的大鼠面神經(jīng)夾挫傷治療效果進(jìn)行觀察，并進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，可幫助我們深入了解溴莫尼定促進(jìn)面神經(jīng)損傷的修復(fù)和再生。

1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar雌性大鼠100只，體重平均200g，飼養(yǎng)于山東省耳鼻喉醫(yī)院動(dòng)物房，恒溫恒濕，每日提供正常充足的純凈水及專用食物，實(shí)驗(yàn)經(jīng)山東大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批號(hào)2017121101)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥

將動(dòng)物隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、手術(shù)后自然恢復(fù)組以及手術(shù)后溴莫尼定治療組。其中假手術(shù)組含10只正常大鼠，僅手術(shù)暴露面神經(jīng)，不做面神經(jīng)夾挫傷處理，僅作對(duì)照。對(duì)80只正常大鼠進(jìn)行面神經(jīng)夾挫傷造模，根據(jù)其損傷后評(píng)分隨機(jī)分為自然恢復(fù)組及溴莫尼定組，每組各含40只大鼠。溴莫尼定組：每隔三日給予溴莫尼定（UK-14303）腹腔注射10mg/kg，持續(xù)3周[5];自然恢復(fù)組給予注射等量的生理鹽水，持續(xù)3周。每周動(dòng)物行電生理檢查后處死取下面神經(jīng)及核團(tuán)行相應(yīng)的病理及WB檢查。

1.2.2 大鼠面神經(jīng)夾挫傷動(dòng)物模型制作

制作前對(duì)器械進(jìn)行消毒。大鼠耳后剃毛發(fā)，消毒表面皮膚，沿耳后溝切開皮膚，鈍性撐開肌肉筋膜，暴露面神經(jīng)主干后用血管鉗鉗夾主干3次,如圖1，每次持續(xù)10s，三次之間間隔10s[6]。

圖1 A:面神經(jīng)主干夾挫傷；B:造模成功的大鼠（左側(cè)面部不能閉眼，左側(cè)胡須不能活動(dòng)，鼻尖偏向右側(cè)）Fig.1 A:Facial nerve trunk clamp contusion;B:Rats with successful modeling(eyes can’t closed on the left side,no movement in the left side of the beard,the tip of the nose was tilted to the right side).

1.2.3 面神經(jīng)功能評(píng)價(jià)

對(duì)各組大鼠分別于開始給藥后的第1,7,14,21天進(jìn)行其面神經(jīng)功能評(píng)價(jià)，由兩名研究人員觀察各組大鼠行為進(jìn)行并記錄。觀察項(xiàng)目如下：面神經(jīng)功能評(píng)分（瞬目反射、觸須運(yùn)動(dòng)），評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1和表2.最終將瞬目反射及觸須運(yùn)動(dòng)評(píng)分結(jié)果進(jìn)行評(píng)分。根據(jù)獲得的評(píng)分總值，留待后續(xù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

表1 大鼠瞬目反射評(píng)分表Table 1 Rat blink reflex rating table

表2 大鼠觸須運(yùn)動(dòng)評(píng)價(jià)表Table 2 Evaluation table of palpate movement in rats

1.2.4 電生理檢查

正?；謴?fù)組及溴莫尼定組模型滿1周，2周，3周后采用面神經(jīng)肌電圖（ENoG）對(duì)大鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)：面部安裝好電極后，刺激強(qiáng)度為0.1 mA，測(cè)定其面神經(jīng)的CMAPs波。記10次刺激后，得到CMAPs的潛伏期及最大振幅，然后取平均值[6]。

1.2.5 準(zhǔn)備

完成電生理檢測(cè)的大鼠用水合氯醛深度麻醉后切開原傷口轉(zhuǎn)移至顯微鏡下，顯露面神經(jīng)主干，截取面神經(jīng)主干損傷處上下約2mm長(zhǎng)度面神經(jīng)，轉(zhuǎn)移至4%多聚甲醛內(nèi)浸泡過夜備用，部分神經(jīng)組織做HE染色，部分神經(jīng)組織做免疫組化。取下神經(jīng)后動(dòng)物拉頸處死，動(dòng)物處死符合倫理學(xué)規(guī)范，剪下頭部并獲取完整的腦組織，保留腦干，面神經(jīng)核團(tuán)定位于大鼠腦干接近延髓腹外側(cè)面[6]。取出核團(tuán)組織做WB。

1.2.6 HE染色

面神經(jīng)組織放入二甲苯中浸泡，石蠟包埋，將石蠟切片機(jī)切片設(shè)置為4 μm厚度，包埋好的組織進(jìn)行橫斷面切片，切取的神經(jīng)組織用載玻片轉(zhuǎn)移至溫箱中，65℃烘烤2h，烘烤完成后取出標(biāo)記。行脫蠟水洗分化，復(fù)染，脫水，封片，鏡下觀察。

1.2.7 免疫組化法檢測(cè)S100蛋白表達(dá)

將部分神經(jīng)組織用oct膠固定后冰凍切片機(jī)按4 u m厚度切片，切取的神經(jīng)組織用載玻片清洗破膜封閉后滴加S100（濃度1:1000，CST公司）一抗；二抗，DAB顯色；流水沖洗切片，室溫下干燥，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察得到的使用Image pro Plus 6.0軟件分析測(cè)定鏡下陽性細(xì)胞數(shù)[6]。

1.2.8 Western Blot檢測(cè)面神經(jīng)核團(tuán)組織蛋白表達(dá)水平

取面神經(jīng)核團(tuán)組織，蛋白樣品濃度測(cè)定，配膠上樣，電泳轉(zhuǎn)膜，抗體孵育FGF2（1:2000 CST公司）及S100（1:1000 CST公司）蛋白，暗室照相[7]。利用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并保存，掃描后使用Image J軟件分析每個(gè)孔的灰度值，以每個(gè)樣品的內(nèi)參作為對(duì)照，標(biāo)準(zhǔn)化后，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物評(píng)分結(jié)果

在完成溴莫尼定給藥干預(yù)21天后，見表3，溴莫尼定組的面癱評(píng)分較自然恢復(fù)組顯著降低，差異具有顯著性（P＜0.05），其余時(shí)間段各組大鼠面癱評(píng)分雖均具有一定的下降，但均無顯著差異，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠各時(shí)間段面癱評(píng)分平均值表Table 3 Average score of facial paralysis in each group at different time periods

本研究對(duì)各組大鼠各時(shí)間段觸須反射進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)溴莫尼定組其觸須反射均較自然恢復(fù)組恢復(fù)程度好，這可能是由于自然恢復(fù)組的恢復(fù)依賴機(jī)體自身的神經(jīng)修復(fù)能力，具有較大的個(gè)體差異，同時(shí)溴莫尼定對(duì)神經(jīng)具有一定的恢復(fù)再生效果。同時(shí)組間比較結(jié)果顯示，在藥物治療21天，溴莫尼定組其治療效果顯著優(yōu)于自然恢復(fù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 電生理結(jié)果

當(dāng)大鼠面神經(jīng)主干損傷后，數(shù)據(jù)見表4，自然恢復(fù)組其面神經(jīng)CMAPs潛伏期顯著延長(zhǎng)，且波幅降低，在術(shù)后第21天時(shí)，溴莫尼定組大鼠的潛伏期明顯縮短，波幅顯著升高，與自然恢復(fù)組存在顯著差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），圖2表明溴莫尼定對(duì)面神經(jīng)損傷具有一定的損傷修復(fù)作用。

表4 各組大鼠各時(shí)間段電生理表Table 4 Electrophysiology of rats in each group at different time periods

2.3 組織HE染色

本研究發(fā)現(xiàn)正常面神經(jīng)神經(jīng)鞘及其周圍分界清楚明顯，分組給藥干預(yù)2周后，見圖3各組大鼠可見有髓神經(jīng)纖維，可見少量髓鞘碎片，軸突橫截面積較厚但不均勻;給藥干預(yù)3周后，自然恢復(fù)組及溴莫尼定組均可見髓鞘崩解碎片。組間比較后，發(fā)現(xiàn)溴莫尼定干預(yù)3周后，溴莫尼定組的面神經(jīng)形態(tài)較自然恢復(fù)組恢復(fù)程度高，其新生髓鞘數(shù)量及厚度明顯高于自然恢復(fù)組。

2.4 免疫組化

本研究通過對(duì)S100蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，見圖4，自然恢復(fù)組及溴莫尼定組其S100（1:1000）蛋白水平較正常對(duì)照組顯著降低。溴莫尼定組治療干預(yù)3周后，S100蛋白的表達(dá)顯著高于自然恢復(fù)組，接近正常對(duì)照組，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 S-100蛋白表達(dá)的免疫組化分析。免疫組化染色顯示損傷面神經(jīng)胞漿中有S-100表達(dá)。對(duì)照組面神經(jīng)S-100表達(dá)較低。S-100在受損的面神經(jīng)和雪旺細(xì)胞中高表達(dá)。而3周后S-100表達(dá)水平下降，損傷+bri組S-100表達(dá)水平較損傷組低。Fig.4 Expression of S100 protein in each group.Immunohistochemical analysis of S-100 expression.Immunohistochemical staining showed s-100 expression in cytoplasm of injured facial nerve.The expression of S-100 in facial nerve was lower in control group.S-100 was highly expressed in damaged facial nerve and Schwann cells.After 3 weeks,the s-100 expression level decreased,and the S-100 expression level in the injury+BRI group was lower than that in the injury group.

2.5 WB

研究發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，自然恢復(fù)組與溴莫尼定組的FGF2以及S100均較正常對(duì)照組減少，見圖5。與自然恢復(fù)組相比，溴莫尼定組在進(jìn)行治療的21天，S100、FGF2的表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且?guī)缀趸謴?fù)至正常水平，表明溴莫尼定能夠有效修復(fù)面神經(jīng)損傷，可能是通過FGF2及S100介導(dǎo)的。

圖5 各組的WB表現(xiàn)。a正常對(duì)照組；b自然恢復(fù)組；c溴莫尼定給藥1周；d給藥2周；e給藥3周。Fig.5 WB manifestations in each group.a normal control group;b natural recovery group;c brimonidine was injection for 1 week;d brimonidine for 2 weeks;e brimonidine for 3 weeks.

3 討論

溴莫尼定通常被應(yīng)用于眼科青光眼的治療，使眼壓升高并改善眼部視力模糊的癥狀[4]，本次實(shí)驗(yàn)為驗(yàn)證該藥物對(duì)面神經(jīng)損傷的修復(fù)作用，實(shí)驗(yàn)中損傷了面神經(jīng)的顳骨外段，比較容易建模，面神經(jīng)損傷后的評(píng)估包括：視覺的主觀評(píng)估，客觀評(píng)估，電生理檢查等[8]。本次實(shí)驗(yàn)的面部表情評(píng)分和電生理證實(shí)了溴莫尼定的神經(jīng)保護(hù)作用，但電刺激有時(shí)候會(huì)滯后于臨床恢復(fù)?？赡芘c研究人員操作及電極的安放有關(guān)。潛伏期的延長(zhǎng)可能由于髓鞘的不完整，影響了信號(hào)的傳導(dǎo)。面神經(jīng)是混合神經(jīng)，通常電生理比較準(zhǔn)確的反應(yīng)神經(jīng)傳導(dǎo)情況，本實(shí)驗(yàn)中損傷了神經(jīng)的粗纖維使神經(jīng)傳導(dǎo)減弱，隨著神經(jīng)的恢復(fù)，傳導(dǎo)的潛伏期也逐漸縮短，振幅也隨之而增大，也反應(yīng)了藥物治療的有效性。而通常神經(jīng)保護(hù)的藥物也會(huì)使?jié)摲诳s短和振幅增大。

在神經(jīng)損傷之后，雪旺細(xì)胞直接或間接與其他成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞相互作用，面神經(jīng)功能其傳導(dǎo)的效果受軸突的粗細(xì)、髓鞘厚度及長(zhǎng)度影響。損傷后各組均出現(xiàn)髓鞘與周圍邊界模糊，髓鞘數(shù)量減少，軸突橫截面積縮小，表明神經(jīng)的傳導(dǎo)能力出現(xiàn)障礙[9]。面神經(jīng)的神經(jīng)元胞體位于腦干，一旦損傷，小膠質(zhì)細(xì)胞將聚集在損傷神經(jīng)胞體周圍[9]。在神經(jīng)夾挫傷的動(dòng)物模型中，發(fā)生瓦倫變性，隨后，遠(yuǎn)端軸索和髓鞘開始碎裂，施萬細(xì)胞幫助去除軸索和碎裂的髓鞘，并轉(zhuǎn)運(yùn)給巨噬細(xì)胞，雪旺細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的共同協(xié)作，促進(jìn)組織恢復(fù)[9]。侯正玉[10]等制作視神經(jīng)夾挫傷并用溴莫尼定治療后用HE染色計(jì)數(shù)各組鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)量,用透射電鏡觀察和比較各組鼠視網(wǎng)膜的超微結(jié)構(gòu)改變。并發(fā)現(xiàn)治療組較模型組視網(wǎng)膜形態(tài)損傷減輕.模型組和治療組較正常對(duì)照組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量明顯減少,但治療組較模型組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量明顯增加。并證明了溴莫尼定的神經(jīng)保護(hù)作用。

S100對(duì)維持鈣離子的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有關(guān)鍵作用。具有極高的生理活性，主要依賴神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌[11]。研究表明S100蛋白能夠刺激新生髓鞘數(shù)量的增加，提高神經(jīng)元的存活率。另一項(xiàng)研究表明[12]，局部注射S100蛋白能夠刺激坐骨神經(jīng)的損傷軸突修復(fù)，改善其損傷情況。腸道微生物群下發(fā)揮作用，由炎癥過程或腸腦軸介導(dǎo)，兩者都涉及到S100B蛋白作為一種擴(kuò)散細(xì)胞因子的可能作用，S100鈣結(jié)合蛋白B(S100B)和神經(jīng)元特異性烯醇酶(NSE)可能是反映雙相障礙患者神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)元異常的外周標(biāo)記物。成纖維細(xì)胞因子FGF能夠?qū)C(jī)體中的磷酸鹽進(jìn)行調(diào)節(jié)，抑制羥化酶活性，下調(diào)活性維生素D的合成水平。促進(jìn)損傷神經(jīng)元的再生，改善面神經(jīng)功能。最近研究發(fā)現(xiàn)FGF與聽覺系統(tǒng)耳蝸帶狀突觸，興奮性突觸的形成、維持及調(diào)控過程密切相關(guān)[13]。本次實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了FGF在神經(jīng)恢復(fù)過程中調(diào)節(jié)機(jī)體的穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)了神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)。近來，對(duì)溴莫尼定的機(jī)制研究涉及PI3KAKT，MAPK，Erk等信號(hào)通路[14]，可以通過這些研究了解，激活或者抑制相關(guān)的蛋白及上下游的相關(guān)因子，起到神經(jīng)的保護(hù)作用。

由此可見，溴莫尼定上調(diào)了FGF以及S100的表達(dá)水平，并且使神經(jīng)恢復(fù)再生，維持新生軸突數(shù)量及其保護(hù)了髓鞘結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，起到保護(hù)面神經(jīng)的作用.但具體的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。這為該藥物治療神經(jīng)損傷提供了更多的有價(jià)值的參考，本實(shí)驗(yàn)對(duì)具體分子機(jī)制和影響因素還需進(jìn)一步嚴(yán)格涉及，包括未計(jì)算神經(jīng)傳導(dǎo)速度，血藥濃度，給藥時(shí)間的對(duì)比等，今后還需更多的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證溴莫尼定治療周圍神經(jīng)的可行性。

致謝：蔡晶參與研究設(shè)計(jì)和部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。