光甘草定通過調(diào)節(jié)ERK/IRS-1和PI3K/Akt信號(hào)通路改善HepG2細(xì)胞的胰島素抵抗

李德鋒，樊金玲，杜 琳，任國(guó)艷

? 藥理與臨床 ?

光甘草定通過調(diào)節(jié)ERK/IRS-1和PI3K/Akt信號(hào)通路改善HepG2細(xì)胞的胰島素抵抗

李德鋒，樊金玲*，杜 琳，任國(guó)艷

河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023

探索光甘草定改善肝細(xì)胞胰島素抵抗（insulin resistance，IR）的作用和機(jī)制。通過高胰島素誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞建立IR模型，采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)細(xì)胞的葡萄糖消耗量及生成；熒光標(biāo)記法檢測(cè)葡萄糖攝取量；蒽酮法檢測(cè)糖原含量；ELISA檢測(cè)葡萄糖代謝關(guān)鍵酶的活性；Western blotting檢測(cè)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶/胰島素受體底物-1（extracellular regulated protein kinase/insulin receptor substrate-1，ERK/IRS-1）信號(hào)通路相關(guān)蛋白以及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）的表達(dá)。采用分子對(duì)接技術(shù)研究光甘草定和ERK分子間的相互作用。光甘草定顯著增加IR-HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗和攝取（＜0.05）；通過顯著提高糖原合成酶（glycogen synthase，GS）、葡萄糖激酶（glucokinase，GCK）和丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）活性（＜0.05、0.01），促進(jìn)IR-HepG2細(xì)胞的糖原合成和糖酵解；通過顯著減弱磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）和葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G6Pase）的活性（＜0.05），抑制IR-HepG2細(xì)胞的糖異生。IR-HepG2細(xì)胞經(jīng)光甘草定處理后，Akt、糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）和叉頭框蛋白O1（forkhead boxing protein O1，F(xiàn)OXO1）的磷酸化水平得到顯著恢復(fù)（＜0.01），而這種作用被PI3K的抑制劑LY294002所逆轉(zhuǎn)（＜0.01）。同時(shí)，光甘草定顯著促進(jìn)GLUT4向質(zhì)膜的易位（＜0.01）。光甘草定顯著降低IR-HepG2細(xì)胞的ERK和IRS的磷酸化水平（＜0.01），還可作為ERK的I1/2型抑制劑。光甘草定通過抑制ERK/IRS-1通路，激活PI3K/Akt信號(hào)通路，修復(fù)IR-HepG2細(xì)胞的糖代謝紊亂，緩解IR癥狀。

胰島素抵抗；ERK/IRS-1；PI3K/Akt；光甘草定；HepG2細(xì)胞；糖代謝；葡萄糖攝取

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一種慢性疾病，以糖脂代謝紊亂為特征[1]。胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是導(dǎo)致T2DM的主要誘因。IR發(fā)生時(shí)，肝臟相對(duì)其他靶器官更早呈現(xiàn)IR癥狀[2]，是受IR影響最嚴(yán)重的組織之一，表現(xiàn)為胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受損[主要是磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）通路異常，PI3K/Akt途徑是介導(dǎo)胰島素刺激細(xì)胞攝取利用葡萄糖的主要途徑[3]]，一方面導(dǎo)致肝臟的葡萄糖攝取減少，另一方面導(dǎo)致糖酵解和糖原合成能力減弱、肝糖原的分解和糖異生加強(qiáng)，使得肝糖原輸出增加；最終造成肝臟調(diào)節(jié)血糖的能力減弱，血糖代謝出現(xiàn)紊亂。

光甘草定是光果甘草L中特有的疏水性異黃烷，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)保護(hù)等多種生物活性[4]。研究發(fā)現(xiàn)，光甘草定對(duì)動(dòng)物模型表現(xiàn)出顯著的降血糖和抗糖尿病活性[5-6]，能夠促進(jìn)正常大鼠L6骨骼肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，預(yù)防骨骼肌細(xì)胞的葡萄糖不耐受[7]。研究者先后采用MC3T3-E1成骨細(xì)胞[8]、J774A.1小鼠巨噬細(xì)胞[9]、THP-1人類白血病單核細(xì)胞[10]、3T3-L1前脂肪細(xì)胞[11]等探索了光甘草定抗糖尿病的作用機(jī)制，目前還未發(fā)現(xiàn)關(guān)于光甘草定對(duì)肝細(xì)胞糖代謝的影響及機(jī)制的報(bào)道。

細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族最主要的成員，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、增殖和分化[12]。研究表明ERK信號(hào)通路與胰島素信號(hào)級(jí)聯(lián)和T2DM的發(fā)展密切相關(guān)[13-14]。過度激活的ERK可以誘導(dǎo)胰島素受體底物-1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）在Ser307/612/632/636處發(fā)生絲氨酸磷酸化[15-16]，抑制其酪氨酸磷酸化，降低IRS-1的活性，阻斷胰島素信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起IR的發(fā)生[17]。ERK信號(hào)通路是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑之一。正常生理?xiàng)l件下，胰島素刺激可激活PI3K/Akt通路和ERK通路[18]，前者調(diào)節(jié)葡萄糖代謝，包括葡萄糖攝取和糖生成[19]；后者主要調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化[20]，同時(shí)對(duì)胰島素激活PI3K/Akt途徑起到負(fù)反饋調(diào)節(jié)的作用。ERK途徑還受胰島素以外的信號(hào)激活，如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、病毒、G-蛋白偶聯(lián)受體配體、致癌物等[12]，這些刺激物在病理?xiàng)l件下會(huì)使ERK過度激活，從而損害胰島素信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，PI3K/Akt和ERK這2種信號(hào)途徑的平衡被認(rèn)為是胰島素敏感性的關(guān)鍵調(diào)控器[14,21]。本課題組前期采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究了光甘草定改善T2DM潛在的作用機(jī)制，通過對(duì)“疾病-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浞治龊Y選出ERK2是光甘草定潛在的作用靶點(diǎn)之一。

本研究通過高胰島素誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞建立IR模型，通過測(cè)定光甘草定對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗（IR-HepG2）模型葡萄糖消耗和攝取、糖酵解、糖原合成、糖異生以及糖代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性，探討光甘草定對(duì)肝細(xì)胞葡萄糖代謝紊亂的修復(fù)作用；通過測(cè)定光甘草定對(duì)ERK/IRS-1和PI3K/Akt通路的關(guān)鍵信號(hào)節(jié)點(diǎn)和下游底物蛋白的表達(dá)及磷酸化水平，探討光甘草定修復(fù)肝細(xì)胞葡萄糖代謝紊亂的調(diào)控途徑；并采用分子對(duì)接技術(shù)研究光甘草定與ERK的分子間相互作用，旨在從分子水平揭示ERK作為光甘草定作用靶點(diǎn)的可能性。為進(jìn)一步推動(dòng)光甘草定作為功能性降糖活性成分在功能食品、膳食補(bǔ)充劑和藥品中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

HepG2細(xì)胞由陜西師范大學(xué)贈(zèng)送。

1.2 藥品與試劑

光甘草定（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%，批號(hào)GF2020071501）購(gòu)自洛陽藍(lán)斯利科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基（25 mmol/L，批號(hào)AG29714104）、DMEM低糖培養(yǎng)基（5.5 mmol/L，批號(hào)AG29694193）購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；DMEM無糖培養(yǎng)基（批號(hào)PM150270）購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；南美胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，批號(hào)CCS30009）購(gòu)自上海迪奧生物有限公司；MTT（批號(hào)298-93-1）購(gòu)自上海藍(lán)季生物公司；胰島素（批號(hào)11061-68-0）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；鹽酸二甲雙胍（批號(hào)1115-7-4）購(gòu)自上海施貴寶制藥有限公司；熒光-葡萄糖類似物2-NBDG（批號(hào)M6327）購(gòu)自美國(guó)Abmole公司；葡萄糖檢測(cè)試劑盒（批號(hào)A154-1-1）、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）測(cè)定試劑盒（批號(hào)A131-1-1）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）測(cè)定試劑盒（批號(hào)A076-1-1）購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司；糖原合成酶（glycogen synthase，GS）ELISA試劑盒（批號(hào)YB-GS-Hu）、葡萄糖激酶（glucokinase，GCK）ELISA試劑盒（批號(hào)YB-GCK-Hu）、葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G6Pase）ELISA試劑盒（批號(hào)YB-G6Pase-Hu）購(gòu)自上海鈺博生物技術(shù)有限公司；糖原測(cè)定試劑盒（批號(hào)BC0345）購(gòu)自北京索樂博科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)E-BC-K318-M）購(gòu)自武漢精英生物科技有限公司；細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑盒（批號(hào)P0033）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；IRS-1抗體（批號(hào)AP70586）、Akt抗體（批號(hào)AP7028B）、磷酸化Akt（Ser473，phosphorylated Akt，p-Akt）抗體（批號(hào)AP3434a）、糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）抗體（批號(hào)AP60301）、磷酸化GSK-3β（Ser9，phosphorylated GSK-3β，p-GSK-3β）抗體（批號(hào)AP67217）、叉頭框蛋白O1（forkhead boxing protein O1，F(xiàn)OXO1）抗體（批號(hào)AP60814）、磷酸化FOXO1（Ser256，phosphorylated FOXO1，p-FOXO1）抗體（批號(hào)Ap67045）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）抗體（批號(hào)AP60050）、ERK抗體（批號(hào)AM2189b）購(gòu)自美國(guó)Abcepta公司；磷酸化IRS-1（Ser307，phosphorylated IRS-1，p-IRS-1）抗體（批號(hào)Ab5599）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；磷酸化ERK（Thr202/Tyr204，phosphorylated ERK，p-ERK）抗體（批號(hào)AF1015）購(gòu)自美國(guó)Affinity公司；β-actin抗體（批號(hào)66009-1-lg）購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；Na+, K+-ATPase抗體（批號(hào)ABL1141）購(gòu)自美國(guó)Abbine公司；ERK途徑抑制劑PD98059（批號(hào)HY-12028）、PI3K抑制劑LY294002（批號(hào)HY-10108）購(gòu)自Med Chem Express公司；山羊抗小鼠二抗（批號(hào)CW0102S）、山羊抗兔二抗（批號(hào)CW0103S）購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技股份有限公司。

1.3 儀器

SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（金西盟人工智能有限責(zé)任公司）；UV-4800型紫外可見分光光度計(jì)（上海尤尼柯儀器有限公司）；倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；DYY-6C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠）；5200型Multi全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和IR-HepG2模型的建立

HepG2細(xì)胞用含10% FBS和1%雙抗的DMEM低糖培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化、傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以5×104個(gè)/mL接種于96孔板中，每孔200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；用無血清的DMEM高糖培養(yǎng)基替換DMEM低糖培養(yǎng)基再培養(yǎng)12 h；棄去舊培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞3次，然后用含有5×10?6mol/L胰島素的DMEM高糖培養(yǎng)基（含10% FBS）培養(yǎng)36 h；檢測(cè)各孔細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中葡萄糖含量，計(jì)算葡萄糖消耗量。造模細(xì)胞的葡萄糖消耗量顯著低于正常細(xì)胞，則表明IR模型建立成功。

2.2 IR-HepG2模型的穩(wěn)定時(shí)間

模型建立成功后，將正常細(xì)胞組和模型組同時(shí)置于不含胰島素的DMEM高糖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24、36、48 h；檢測(cè)各孔細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中葡萄糖含量，計(jì)算葡萄糖的消耗量。模型組細(xì)胞的葡萄糖消耗量顯著低于正常細(xì)胞，則表明IR模型在相應(yīng)的時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.3 細(xì)胞活力的測(cè)定

取HepG2細(xì)胞和建模成功的IR-HepG2細(xì)胞，用PBS清洗1～2次，然后每孔加入200 μL由DMEM高糖培養(yǎng)基（含10% FBS）配成的不同質(zhì)量濃度的光甘草定（0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0 μg/mL），于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后，用PBS沖洗細(xì)胞1～2次，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活性。

2.4 糖代謝相關(guān)實(shí)驗(yàn)

2.4.1 分組及處理 設(shè)置對(duì)照組、模型組及光甘草定低、中、高劑量（0.1、1.0、10.0 μg/mL）組和二甲雙胍（0.5 mmol/L）組。對(duì)照組細(xì)胞用不含胰島素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)；模型組、光甘草定各劑量組和二甲雙胍組均按“2.1”項(xiàng)下方法誘導(dǎo)IR。細(xì)胞用PBS沖洗3次后，對(duì)照組和模型組加入DMEM高糖培養(yǎng)基，光甘草定各劑量組加入DMEM高糖培養(yǎng)基配制的不同質(zhì)量濃度的光甘草定溶液；二甲雙胍（0.5 mmol/L）組加入由DMEM高糖培養(yǎng)基配制的二甲雙胍溶液。各組均在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.4.2 葡萄糖消耗測(cè)定 96孔板中（HepG2細(xì)胞5×104個(gè)/mL）進(jìn)行“2.4.1”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)分組及處理，并設(shè)置空白孔。處理結(jié)束后，收集每孔的培養(yǎng)液，用葡萄糖檢測(cè)試劑盒（葡萄糖氧化酶法）檢測(cè)培養(yǎng)液中的葡萄糖含量，計(jì)算各孔的葡萄糖消耗量。

葡萄糖消耗量＝空白孔葡萄糖含量－每孔葡萄糖含量

2.4.3 葡萄糖攝取測(cè)定 24孔板中（HepG2細(xì)胞1×105個(gè)/mL）進(jìn)行“2.4.1”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)分組及處理，其中光甘草定處理組只選取高劑量組。處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗板2次；然后加入50 μmol/L的2-NBDG溶液，并在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min；棄去2-NBDG溶液，用冷PBS清洗2～3次；在倒置熒光顯微鏡下觀察，獲得熒光圖像，并利用Image J軟件對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。

2.4.4 糖原含量測(cè)定 6孔板中（HepG2細(xì)胞5×105個(gè)/mL）進(jìn)行“2.4.1”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)分組及處理，其中光甘草定處理組只選取高劑量組。處理結(jié)束后，收集細(xì)胞，然后按照糖原測(cè)定試劑盒（蒽酮法）中的操作方法測(cè)定各組細(xì)胞中的糖原含量。

2.4.5 葡萄糖生成測(cè)定 6孔板中進(jìn)行“2.4.1”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)分組及處理，其中光甘草定處理組只選取高劑量組。處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗板2次；加入含2 mmol/L丙酮酸鈉和20 mmol/L乳酸鈉的無糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h。然后收集各孔的培養(yǎng)基和細(xì)胞，按照葡萄糖測(cè)定試劑盒（葡萄糖氧化酶法）中的步驟檢測(cè)各組葡萄糖含量，并將葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)化為細(xì)胞蛋白濃度。

2.4.6 糖代謝關(guān)鍵酶活性測(cè)定 6孔板中進(jìn)行“2.4.1”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)分組及處理，其中光甘草定處理組只選取高劑量組。處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗板2次，收集細(xì)胞。按照ELISA試劑盒說明書分別測(cè)定GCK、GS和G6Pase的活性，按照PK和PEPCK檢測(cè)試劑盒說明書分別測(cè)定PK和PEPCK的活性。

2.5 PI3K/Akt和ERK/IRS-1途徑中蛋白表達(dá)及磷酸化的檢測(cè)

2.5.1 分組及處理 在6孔板中（HepG2細(xì)胞1×106個(gè)/mL）進(jìn)行分組及處理。設(shè)置對(duì)照組、模型組、光甘草定高劑量組、高劑量光甘草定＋LY294002組和PD98059抑制劑組。對(duì)照組用不含胰島素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)；模型組、光甘草定高劑量組、高劑量光甘草定＋LY294002組、PD98059組均按“2.1”項(xiàng)下方法誘導(dǎo)IR。細(xì)胞用PBS沖洗3次后，對(duì)照組、模型組、光甘草定高劑量組細(xì)胞的處理方法同“2.4.1”項(xiàng)；高劑量光甘草定＋LY294002組和PD98059組先用DMEM高糖培養(yǎng)基配成的LY294002（10 μmol/L）或PD98059（10 μmol/L）溶液預(yù)處理細(xì)胞1 h，然后加入DMEM高糖培養(yǎng)基配成的光甘草定＋LY294002樣品液或PD98059溶液處理24 h。處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基；各組均加入含100 nmol/L胰島素的DMEM高糖培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)箱中刺激20 min；棄去培養(yǎng)基，然后用冷PBS洗板1～2次，收集細(xì)胞。

2.5.2 PI3K/Akt途徑中蛋白表達(dá)及其磷酸化的檢測(cè) 對(duì)照組、模型組、光甘草定高劑量組和高劑量光甘草定＋LY294002組收集細(xì)胞后，通過Western blotting法檢測(cè)PI3K/Akt信號(hào)通路中Akt、GSK-3β和FOXO1蛋白的表達(dá)及其磷酸化。

2.5.3 GLUT4易位的檢測(cè) 對(duì)照組、模型組、光甘草定高劑量組收集細(xì)胞后，根據(jù)細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑盒中的步驟提取細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白，然后通過Western blotting法分別檢測(cè)細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中GLUT4的表達(dá)。

2.5.4 ERK/IRS-1途徑中蛋白表達(dá)及其磷酸化的檢測(cè) 對(duì)照組、模型組、光甘草定高劑量組和PD98059抑制劑組收集細(xì)胞后，通過Western blotting法檢測(cè)ERK和IRS-1蛋白表達(dá)及其磷酸化。

2.5.5 Western blotting分析 收集細(xì)胞后，用RIPA緩沖液裂解細(xì)胞，離心后取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)量蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用脫脂牛奶封閉1.5 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜；用TBST緩沖液洗滌后，加入二抗，37 ℃孵育2 h，使用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光成像，使用成像儀自帶圖像分析軟件GIS 1D對(duì)曝光結(jié)果進(jìn)行分析。

2.6 分子對(duì)接

分別從PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)和PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)中下載受體的晶體結(jié)構(gòu)和配體的化學(xué)結(jié)構(gòu)，ERK2對(duì)應(yīng)的PDB ID為4ZZN，采用AutoDock Tools工具對(duì)上述蛋白受體和配體進(jìn)行常規(guī)處理，再用其Autogrid模塊得到對(duì)接活性位點(diǎn)，運(yùn)行程序進(jìn)行分子對(duì)接，并利用Pymol軟件繪制光甘草定與ERK2分子對(duì)接圖。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 光甘草定對(duì)IR-HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗的影響

葡萄糖的消耗是細(xì)胞攝取葡萄糖和外排葡萄糖的凈結(jié)果，直接反映細(xì)胞對(duì)外源葡萄糖的利用情況。首先在IR-HepG2細(xì)胞模型建立并可在48 h內(nèi)保持穩(wěn)定的基礎(chǔ)上，分析光甘草定的細(xì)胞毒作用，測(cè)定了光甘草定對(duì)IR-HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響，如圖1-A所示，當(dāng)光甘草定質(zhì)量濃度為0.1～10.0 μg/mL時(shí)，HepG2細(xì)胞和IR-HepG2細(xì)胞的存活率均在90%以上，表明光甘草定在此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)HepG2細(xì)胞和IR-HepG2細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性。選取0.1、1.0和10.0 μg/mL光甘草定分別孵育IR-HepG2細(xì)胞24 h，如圖1-B所示，3個(gè)劑量的光甘草定均不同程度地增加IR-HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗，且呈劑量相關(guān)性，其中，光甘草定高劑量組的細(xì)胞葡萄糖消耗量顯著高于模型組（＜0.05），與二甲雙胍陽性對(duì)照組（0.5 mmol/L）無顯著差異，表明10 μg/mL的光甘草定可有效改善IR-HepG2細(xì)胞對(duì)外源葡萄糖的利用。后續(xù)實(shí)驗(yàn)的光甘草定質(zhì)量濃度均選取10 μg/mL。

3.2 光甘草定對(duì)IR-HepG2細(xì)胞葡萄糖攝取的影響

采用2-NBDG熒光標(biāo)記物檢測(cè)光甘草定對(duì)IR-HepG2細(xì)胞攝取葡萄糖的影響，如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組2-NBDG攝取量顯著降低（＜0.01）；光甘草定處理顯著提高了IR-HepG2細(xì)胞的葡萄糖攝取量（＜0.05），效果與二甲雙胍陽性對(duì)照組（0.5 mmol/L）無顯著差異。

與對(duì)照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

圖2 光甘草定對(duì)IR-HepG2細(xì)胞葡萄糖攝取的影響(, n = 3)

3.3 光甘草定對(duì)IR-HepG2細(xì)胞葡萄糖代謝的影響

通過測(cè)定光甘草定對(duì)IR-HepG2細(xì)胞的糖原合成量、葡萄糖生成量以及關(guān)鍵酶活性的影響，研究光甘草定對(duì)發(fā)生IR的肝細(xì)胞中葡萄糖代謝的調(diào)節(jié)作用。

3.3.1 光甘草定促進(jìn)IR-HepG2細(xì)胞的糖酵解 PK和GCK是糖酵解途徑中的2個(gè)關(guān)鍵限速酶。如圖3所示，模型組PK和GCK的活性與對(duì)照組相比均顯著降低（＜0.01）；而光甘草定處理顯著提高了IR細(xì)胞的PK和GCK活性（＜0.05、0.01），提示光甘草定可以通過上調(diào)IR-HepG2細(xì)胞中PK和GCK的活性促進(jìn)糖酵解。

3.3.2 光甘草定提高IR-HepG2細(xì)胞的糖原合成 IR發(fā)生時(shí)，肝細(xì)胞的肝糖原合成受阻、而糖原分解加快，是造成肝臟葡萄糖生成量增加的一個(gè)重要原因。GS是糖原合成的關(guān)鍵酶。如圖4所示，模型組的GS活性和糖原含量均顯著低于對(duì)照組（＜0.01）；經(jīng)光甘草定處理后，GS活性和糖原含量均顯著提高（＜0.05），表明光甘草定可以通過上調(diào)IR-HepG2細(xì)胞中GS的活性促進(jìn)糖原合成。

3.3.3 光甘草定抑制IR-HepG2細(xì)胞的糖異生 糖異生是T2DM患者空腹肝葡萄糖生成增加的主要原因[22]。PEPCK、G6Pase是糖異生途徑中的關(guān)鍵限速酶。如圖5所示，模型組PEPCK、G6Pase的活性和葡萄糖的生成量均顯著高于對(duì)照組（＜0.05、0.01）；而在光甘草定作用下，這種增加被顯著抑制（＜0.05）。表明光甘草定可以通過下調(diào)IR-HepG2細(xì)胞的G6Pase和PEPCK的活性來抑制糖異生。

3.4 光甘草定通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)IR-HepG2細(xì)胞的葡萄糖代謝

胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受損，即PI3K/Akt通路異常是肝臟發(fā)生IR導(dǎo)致葡萄糖代謝失衡的主要原因。通過測(cè)定光甘草定對(duì)該通路的關(guān)鍵信號(hào)節(jié)點(diǎn)Akt以及Akt的下游底物GSK-3β和FOXO1的表達(dá)及磷酸化水平，探討光甘草定對(duì)PI3K/Akt通路的修復(fù)作用以及調(diào)節(jié)糖原合成、葡萄糖生成的機(jī)制。如圖6所示，與對(duì)照組比較，模型組Akt、GSK-3β和FOXO1的磷酸化被顯著抑制（＜0.001），光甘草定處理則顯著提高了三者的磷酸化水平（＜0.01），但這種作用被PI3K抑制劑LY294002顯著逆轉(zhuǎn)（＜0.01）。表明光甘草定對(duì)IR-HepG2細(xì)胞葡萄糖代謝紊亂的修復(fù)作用是由PI3K介導(dǎo)的，通過激活肝細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路，一方面促進(jìn)了GSK-3β的磷酸化從而促進(jìn)了糖原合成，另一方面增強(qiáng)了FOXO1的磷酸化從而抑制了糖異生。

圖3 光甘草定對(duì)IR-HepG2細(xì)胞PK和GCK活性的影響(, n = 3)

圖4 光甘草定對(duì)IR-HepG2細(xì)胞糖原合成和GS活性的影響(, n = 3)

圖5 光甘草定對(duì)IR-HepG2細(xì)胞糖異生的影響(, n = 3)

與光甘草定組比較：&&P＜0.01

3.5 光甘草定促進(jìn)IR-HepG2細(xì)胞GLUT4的質(zhì)膜易位

胰島素通過增加GLUT4從細(xì)胞內(nèi)的儲(chǔ)存囊泡到質(zhì)膜的易位來促進(jìn)葡萄糖攝取，是降低血糖水平的主要機(jī)制之一[23]。為了確定光甘草定對(duì)GLUT4易位的影響，對(duì)光甘草定處理后的IR-HepG2細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)、膜組分的Western blotting檢測(cè)，如圖7所示，β-actin和Na+, K+-ATPase分別在質(zhì)膜和細(xì)胞質(zhì)中幾乎檢測(cè)不到，表明質(zhì)膜和細(xì)胞質(zhì)成分分離較好。與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞質(zhì)膜上的GLUT4表達(dá)顯著降低（＜0.001），而細(xì)胞質(zhì)中GLUT4的表達(dá)顯著升高（＜0.001）；光甘草定處理則顯著提高了GLUT4在IR-HepG2細(xì)胞質(zhì)膜中的表達(dá)（＜0.01），顯著降低其在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)（＜0.01）。表明光甘草定可以顯著促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存GLUT4的囊泡向質(zhì)膜的易位，從而刺激IR-HepG2細(xì)胞的葡萄糖攝取。

圖7 光甘草定對(duì)IR-HepG2細(xì)胞中GLUT4易位的影響(, n = 3)

3.6 光甘草定對(duì)IR-HepG2細(xì)胞ERK/IRS-1信號(hào)通路的影響

過度激活的ERK可以誘導(dǎo)IRS-1在Ser307/612/ 632/636處發(fā)生絲氨酸磷酸化[15-16]，阻斷胰島素信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過測(cè)定光甘草定對(duì)ERK和IRS-1的表達(dá)及磷酸化水平，進(jìn)一步探討了光甘草定修復(fù)PI3K/Akt通路的途徑，如圖8所示，與對(duì)照組比較，模型組ERK和IRS-1的磷酸化水平均顯著升高（＜0.001）；PD98059處理有效阻斷了ERK的磷酸化（＜0.01），同時(shí)顯著抑制了IRS-1的磷酸化（＜0.01）；與PD98059處理相類似，光甘草定處理同樣顯著降低了IR-HepG2細(xì)胞中ERK和IRS-1的磷酸化（＜0.01）。表明在肝細(xì)胞發(fā)生IR時(shí)，光甘草定可以通過抑制ERK/IRS-1通路的激活，修復(fù)PI3K/Akt途徑的損傷，促進(jìn)胰島素信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

3.7 光甘草定與ERK2的分子對(duì)接結(jié)果

本課題組前期的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果表明ERK2是光甘草定潛在的作用靶點(diǎn)之一。采用分子對(duì)接技術(shù)研究光甘草定與ERK之間的分子相互作用，旨在從分子水平揭示光甘草定作為ERK抑制劑的可能性。

ERK2具有由端和端卷曲形成的雙葉結(jié)構(gòu)。端主要由5個(gè)β折疊（β1～β5）、1個(gè)αC螺旋和1個(gè)甘氨酸富集環(huán)結(jié)構(gòu)組成，它們對(duì)ATP的定位具有重要作用。其中，β1和β2-折疊占據(jù)了部分腺嘌呤結(jié)合口袋；β3折疊通常包含1個(gè)保守的AXK序列，其賴氨酸（Lys）將ATP的α-和β-磷酸鹽耦合到αC-螺旋上；甘氨酸富集環(huán)位于β1、β2-折疊之間，是端中最靈活的部分，有助于定位ATP的β-和γ-磷酸鹽以進(jìn)行催化作用。β3-Lys和αC-谷氨酸（Glu）之間形成的1個(gè)鹽橋是激酶處于活性狀態(tài)的先決條件，稱為αCin構(gòu)象；如果這種鹽橋缺失，則表明該激酶是非活性的，稱為αCout構(gòu)象。端主要由6個(gè)α螺旋和4股較短的β折疊（β6～β9）組成，在β6～β9折疊中包含了與ATP向ERK1/2底物磷酸化轉(zhuǎn)移有關(guān)的大部分催化殘基。端和端通過一段柔性的鉸鏈區(qū)連接，該鉸鏈區(qū)域與ATP結(jié)合位點(diǎn)部分重疊，也被稱為“活化loop”。“活化loop”一般由20～30個(gè)氨基酸殘基組成，從保守的DFG基序（Asp-Phe-Gly）開始，以保守的APE序列（Ala-Pro-Glu）結(jié)束。在活性蛋白激酶中，DFG-天冬氨酸（Asp）側(cè)鏈（ERK2 Asp165）靠近ATP結(jié)合位點(diǎn)，稱為DFG-in構(gòu)象；在非活性蛋白激酶中，DFG-Asp側(cè)鏈遠(yuǎn)離ATP結(jié)合位點(diǎn)，稱為DFG-out構(gòu)象[24]。DFG-in/αCin表示活性蛋白激酶；DFG-in/αCout、DFG-out/αCin和DFG-out/αCout表示非活性蛋白激酶[25]。依據(jù)蛋白激酶的構(gòu)象，將其抑制劑分為I、II、I1/2和III型[26-27]。I型抑制劑與活性蛋白激酶的DFG-in構(gòu)象結(jié)合，可逆的結(jié)合到ATP結(jié)合位點(diǎn)；II型抑制劑與非活性的蛋白激酶的DFG-out構(gòu)象結(jié)合；I1/2型抑制劑與非活性蛋白激酶的DFG-in構(gòu)象結(jié)合（與II型抑制劑的DFG-out構(gòu)象相反），占據(jù)了ATP部分結(jié)合位點(diǎn)；III型抑制劑與蛋白激酶的變構(gòu)位點(diǎn)結(jié)合，不影響ATP的結(jié)合。Liao[28]和van Linden等[29]將蛋白激酶端和端之間的區(qū)域劃分為“Front cleft”“Gate area”和“Back cleft”?！癋ront cleft”包括鉸鏈區(qū)部分殘基、腺嘌呤結(jié)合口袋和甘氨酸富集環(huán)；“Gate area”包括端葉的β3折疊和“活化loop”的近端部分。

圖8 光甘草定對(duì)IR-HepG2細(xì)胞中ERK/IRS-1通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

光甘草定與ERK2的結(jié)合能為?27.78 kJ/mol，說明光甘草定與ERK2能自發(fā)且穩(wěn)定地結(jié)合，具有較好的親和力。光甘草定結(jié)合在了ERK2的“Front cleft”和“Gate area”處。從圖9-A中可以觀察到DFG-Asp165靠近ATP結(jié)合位點(diǎn)；β3-Lys52和αC-Glu69之間沒有形成鹽橋，這表明與光甘草定結(jié)合的ERK2具有DFG-in/αCout構(gòu)象。因此，該激酶是非活性狀態(tài)。光甘草定的羥基分別與甘氨酸富集環(huán)上Ala33、αC螺旋上Tyr62形成了氫鍵；與甘氨酸富集環(huán)上Tyr34、αC螺旋上Thr66形成了極性鍵；光甘草定還與ERK2中β1折疊上Glu31、β2折疊上Gly35、β3-折疊和αC螺旋之間的無規(guī)則卷曲區(qū)域的Ser55、Ile54和Pro56、αC螺旋上的Arg65、β2L0上的Gln15有許多疏水作用（圖9-B）。光甘草定與ERK2的β-折疊（β1～β3）、αC螺旋及甘氨酸富集環(huán)上氨基酸殘基的相互作用在空間上阻止了ATP與激酶的結(jié)合。因此，光甘草定可以被歸類為ERK2的一種I1/2型抑制劑。

圖9 ERK2結(jié)構(gòu)圖 (A)及光甘草定與ERK2的分子對(duì)接圖 (B)

4 討論

光甘草定具有顯著降低IR-HepG2細(xì)胞肝糖產(chǎn)生的能力。肝糖的產(chǎn)生是糖酵解、糖原合成與分解、糖異生過程的等過程的凈結(jié)果，對(duì)血糖調(diào)節(jié)起得重要作用。糖原在進(jìn)食條件下是肝臟中葡萄糖的一種重要儲(chǔ)存形式；在禁食條件下，肝糖原分解產(chǎn)生的游離葡萄糖釋放到血液循環(huán)中，可隨時(shí)為大腦和其他神經(jīng)組織提供葡萄糖。伴隨禁食時(shí)間的延長(zhǎng)，糖異生逐漸取代糖原分解，成為肝臟葡萄糖生成的主途徑。例如在禁食10 h后，糖原分解只占肝臟葡萄糖總產(chǎn)量的30%，糖異生占肝臟葡萄糖總產(chǎn)量的70%。糖異生也是T2DM患者空腹肝葡萄糖生成增加的主要原因[22]。發(fā)生IR時(shí)，肝臟的葡萄糖代謝失衡，包括糖酵解和糖原合成能力減弱、肝糖原的分解和糖異生加強(qiáng)，使得肝糖輸出增加，最終造成肝臟調(diào)節(jié)血糖的能力減弱，血糖代謝出現(xiàn)紊亂。本研究表明，光甘草定通過上調(diào)PK、GCK和GS的活性，使細(xì)胞的糖酵解和糖原合成能力顯著增強(qiáng)；通過下調(diào)PEPCK和G6Pase的活性，顯著減弱了細(xì)胞內(nèi)糖異生的能力，降低肝糖的產(chǎn)生，進(jìn)而減少肝糖的輸出。

光甘草定顯著提高了IR-HepG2細(xì)胞的葡萄糖攝取能力。GLUT4是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中獨(dú)特的亞型，在介導(dǎo)胰島素依賴性葡萄糖攝取和維持葡萄糖平衡方面發(fā)揮著重要作用[30]。GLUT4主要在脂肪細(xì)胞、骨骼肌和心肌細(xì)胞中表達(dá)，當(dāng)攝入碳水化合物食物后，血液循環(huán)中的胰島素水平上升；在胰島素作用下，細(xì)胞內(nèi)的GLUT4轉(zhuǎn)位到質(zhì)膜上，從而增加這些細(xì)胞的葡萄糖攝取和代謝，防止血糖水平的長(zhǎng)期升高。GLUT4向質(zhì)膜轉(zhuǎn)移的缺陷被稱為外周胰島素抵抗。雖然目前認(rèn)為GLUT2是肝細(xì)胞中主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，分別在進(jìn)食和禁食狀態(tài)下參與肝細(xì)胞葡萄糖的攝取和釋放[31]。但是，GLUT4也在肝臟中表達(dá)[31]，而且越來越多的體內(nèi)外研究[17,32-35]表明，肝臟中的GLUT4通過與脂肪細(xì)胞、骨骼肌和心肌細(xì)胞中的GLUT4相同的機(jī)制，即通過胰島素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)位參與肝細(xì)胞對(duì)血液中的葡萄糖的攝取。而當(dāng)肝臟發(fā)生IR時(shí)，GLUT4也同樣表現(xiàn)出易位損傷。GLUT4的易位損傷或修復(fù)與肝細(xì)胞攝取葡萄糖的能力密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，在高胰島素誘導(dǎo)的IR-HepG2細(xì)胞中，GLUT4從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞膜的遷移受到了顯著抑制，而光甘草定處理后質(zhì)膜中GLUT4的表達(dá)顯著提高，而細(xì)胞質(zhì)中GLUT4的表達(dá)顯著降低，表明光甘草定較好修復(fù)了IR-HepG2細(xì)胞的GLUT4的易位損傷。GLUT4在肝臟中的表達(dá)和功能以及對(duì)調(diào)節(jié)全身代謝方面的作用仍需進(jìn)一步深入探討。

PI3K/Akt途徑是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要途徑，在胰島素的靶器官中負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)葡萄糖攝取和代謝，Akt是該途徑中的關(guān)鍵信號(hào)節(jié)點(diǎn)之一。在肝細(xì)胞中，胰島素與細(xì)胞表面胰島素受體特異性結(jié)合后，使IRS活化，接著IRS通過SH2結(jié)構(gòu)域招募PI3K的p85調(diào)節(jié)亞基促使PI3K的激活，然后PI3K磷酸化脂質(zhì)磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（phosphati-dylinositol-4,5-bisphosphate，PIP2）產(chǎn)生磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（phosphati-dylinositol-3,4,5-bisphosphate，PIP3）；Akt通過其PH結(jié)構(gòu)域與PIP3結(jié)合，促進(jìn)上游激酶激活A(yù)kt。GSK-3β、FOXO1是Akt下游直接作用的2個(gè)靶點(diǎn)。GSK3β被Akt磷酸化而降低活性，致使GSK-3β的下游蛋白GS磷酸化水平下降而激活，進(jìn)而促進(jìn)糖原合成[36]。Akt使FOXO1發(fā)生磷酸化后，誘導(dǎo)FOXO1與14-3-3蛋白相互作用，使其發(fā)生核外排，致使FOXO1失去DNA結(jié)合能力和轉(zhuǎn)錄活性[37]，導(dǎo)致PEPCK和G6Pase的表達(dá)降低，從而抑制糖異生[38]。當(dāng)肝臟發(fā)生IR時(shí)，PI3K/Akt途徑受損，Akt的激活受到了抑制，使其對(duì)GSK3β磷酸化的能力減弱，致使GSK3β通過磷酸化GS使其失活，減少了糖原的合成[39]。同時(shí)，Akt對(duì)FOXO1磷酸化能力也被削弱，F(xiàn)OXO1直接與PEPCK和G6Pase靶DNA序列結(jié)合，增加它們?cè)诟闻K中的表達(dá)[40]，促進(jìn)了肝糖異生。在本研究中，光甘草定顯著上調(diào)了Akt的磷酸化水平，致使GSK3β和FOXO1的磷酸化水平也顯著提高。前者導(dǎo)致GS的活性提高，IR-HepG2細(xì)胞的糖原含量也因此顯著增加；后者導(dǎo)致PEPCK和G6Pase的活性顯著降低，IR-HepG2細(xì)胞的葡萄糖生成量也因此顯著下降。當(dāng)加入PI3K抑制劑LY294002后，光甘草定對(duì)Akt、GSK3β和FOXO1磷酸化水平的上調(diào)作用被顯著逆轉(zhuǎn)。上述研究結(jié)果表明光甘草定改善IR的能力是PI3K/Akt途徑依賴性的。

幾個(gè)關(guān)鍵的絲氨酸/蘇氨酸激酶通過靶向胰島素信號(hào)傳導(dǎo)PI3K/Akt途徑的關(guān)鍵成分而成為重要的負(fù)向調(diào)節(jié)因子[15,41]。其中，ERK對(duì)IRS的絲氨酸磷酸化與IR密切相關(guān)[17]。過度激活的ERK信號(hào)通路對(duì)PI3K/Akt通路起負(fù)調(diào)節(jié)作用。在IR狀態(tài)下，ERK激活后可以使IRS-1在Ser307等多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生磷酸化[15]，致使IRS-1與胰島素受體的結(jié)合受到抑制[42]，從而導(dǎo)致PI3K/Akt信號(hào)通路損傷和胰島素刺激的葡萄糖利用受損。因此，抑制ERK途徑可能成為治療糖尿病的又一有效手段。在db/db小鼠[21,43]、KKAy小鼠[44]等動(dòng)物模型和3T3-L1脂肪細(xì)胞[21,43]、骨骼肌細(xì)胞[16]中發(fā)現(xiàn)，使用抑制劑（PD184352、U0126、PD98059）或早期反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子-1（early growth response-1，Egr-1）抑制ERK途徑后，可改善小鼠和細(xì)胞的胰島素敏感性及IR癥狀。近年來的研究表明，HepG2細(xì)胞的IR可通過核桃衍生肽[17]、姜黃素及其代謝產(chǎn)物[45]抑制ERK途徑得到顯著改善。本研究發(fā)現(xiàn)，高胰島素誘導(dǎo)的IR-HepG2細(xì)胞的ERK和IRS-1的磷酸化水平顯著升高，而這種升高分別被ERK通路的專一性抑制劑PD98059和光甘草定顯著抑制。光甘草定與ERK2分子對(duì)接的結(jié)果進(jìn)一步表明，光甘草定通過氫鍵、極性鍵、疏水相互作用等作用力穩(wěn)定結(jié)合在非活性狀態(tài)且具有DFG-in構(gòu)象的ERK2的“Front cleft”和“Gate area”位點(diǎn)，在空間上阻止了ATP與ERK2的結(jié)合。上述結(jié)果表明，光甘草定可作為ERK2的一種I1/2型抑制劑，通過抑制IR-HepG2細(xì)胞中ERK/ IRS-1途徑的激活，修復(fù)PI3K/Akt途徑的損傷。

綜上所述，光甘草定可作為ERK的I1/2型抑制劑，通過抑制IR-HepG2細(xì)胞的ERK/IRS-1通路、激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)GLUT4向質(zhì)膜的易位，提高IR-HepG2細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取量；增強(qiáng)或抑制葡萄糖代謝關(guān)鍵酶的活性，促進(jìn)IR-HepG2細(xì)胞的糖原合成和糖酵解，抑制糖異生；進(jìn)而提高IR-HepG2細(xì)胞對(duì)外源葡萄糖的利用、減少肝糖的產(chǎn)生和外排，修復(fù)葡萄糖的代謝紊亂，緩解IR癥狀。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Glabridin ameliorates insulin resistance by regulating ERK/IRS-1 and PI3K/Akt signaling pathways in HepG2 cells

LI De-feng, FAN Jin-ling, DU Lin, REN Guo-yan

College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China

To explore the effect and mechanism of glabridin on ameliorating insulin resistance (IR) in hepatocytes.IR model was established by high insulin-induced HepG2 cells. The cells were evaluated for glucose consumption and production by glucose oxidase assay; The glucose consumption and production of cells were detected by glucose oxidase method; Glucose uptake was detected by fluorescence method; The content of glycogen was detected by anthrone method; The activities of key enzymes in glucose metabolism was detected by ELISA; Western blotting was used to detect phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B (PI3K/Akt), extracellular regulated protein kinase/insulin receptor substrate-1 (ERK/IRS-1) signaling pathway related protein and glucose transporter 4 (GLUT4) expressions. Molecular docking technique was used to study the interaction between glabridin and ERK molecules.Glabridin significantly increased the glucose consumption and uptake of IR-HepG2 cells (< 0.05); Glycogen synthesis and glycolysis of IR-HepG2 cells were promoted by significantly increasing the activities of glycogen synthase (GS), glucokinase (GCK) and pyruvate kinase (PK) (< 0.05, 0.01); The activities of phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) and glucose-6-phosphatase (G6Pase) were significantly decreased (< 0.05), and gluconeogenesis of IR-HepG2 cells was inhibited. After IR-HepG2 cells were treated with glabridin, phosphorylation levels of Akt, glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) and forkhead boxing protein O1 (FOXO1) were significantly restored (< 0.01), and this effect was reversed by PI3K inhibitor LY294002 (< 0.01). Meanwhile, glabridin significantly promoted the translocation of GLUT4 to plasma membrane (< 0.01). Glabridin significantly reduced the phosphorylation levels of ERK and IRS in IR-HepG2 cells (< 0.01), and could be used as I1/2inhibitor of ERK.Glabridin can repair the sugar metabolism disorder of IR-HepG2 cells and relieve IR symptoms by inhibiting ERK/IRS-1 pathway and activating PI3K/Akt signaling pathway.

insulin resistance; ERK/IRS-1; PI3K/Akt; glabridin; HepG2 cells; glucose metabolism; glucose uptake

R285.5

A

0253 - 2670(2022)24 - 7751 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.24.013

2022-10-08

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31571800）

李德鋒（1997—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物組分與功能食品。E-mail: 1659628204@qq.cm

樊金玲（1973—），女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物組分與功能食品。E-mail: fanjinling@haust.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]